愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化氫酶活性

1、過氧化物酶活性的測定（愈創(chuàng)木酚比色法）原理過氧化物酶廣泛分布于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質，可用分光光度計測量生成物的含量。721型分光光度計秒表研缽愈創(chuàng)木酚20mmol/L儀器藥品離心機天平磁力攪拌器30%過氧化氫KH2PO4100mmol/L磷酸緩沖液，pH6.0（見附表2）反應混合液：100mmol/L磷酸緩沖液（pH6.0）50ml于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28pl,于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫19pl,混合均勻，保存于冰箱中。操作步驟稱取植物材料1g，加20mmol/LKH2PO45ml

2、，于研缽中研磨成勻漿，以4000r/min離心15分鐘，傾出上清液保存在冷處，殘渣再用5mlKH2PO4溶液提取一次，合并兩次上清液，貯于冷處備用。取光徑1cm比色杯2只，于1只中加入反應混合液3ml，KH2PO41ml，作為校零對照，另1只中加入反應混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性過高可稀釋之），立即開啟秒表記錄時間，于分光光度計上測量吸光度值，每隔1分鐘讀數(shù)一次，讀數(shù)于波長470nm下進行。3.以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以A470/min*mg蛋白質（或鮮重g）表示實驗三十八過氧化物酶活性的測定（比色法）過氧化物酶是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合

3、作用及生長素的氧化等都有密切關系，在植物生長發(fā)育過程中，它的活性不斷發(fā)生變化，因此測量這種酶，可以反映某一時期植物體內代謝的變化。在有過氧化氫存在的條件下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質，該物質在470nm處有最大吸收，可用分光光度計測量470nm處的吸光度變化速率來測定過氧化物酶活性。一、儀器、藥品與材料（一）實驗材料新鮮植物組織。（二）儀器與用品分光光度計，研缽，恒溫水浴鍋，100mL容量瓶，吸管，高速冷凍離心機，秒表，磁力攪拌器。（三）試劑.愈創(chuàng)木酚。.30%過氧化氫。.100mmol/L磷酸緩沖液pH6.0（見附錄7）。反應混合液：取100mmol/L磷酸緩沖液（pH6.0

4、）50mL于燒杯中，加入愈創(chuàng)木酚28卩L,于磁力攪拌器上加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫19卩L，混合均勻，保存于冰箱中備用。二、實驗步驟稱取植物材料0.1g，剪碎，放入研缽中，加入適量的磷酸緩沖液研磨成勻漿，殘渣再用mL磷酸緩沖液提取一次，以4000rpm低溫離心15min，上清液即為粗酶液，定容至10mL刻度，貯于低溫下備用。取2支試管，于1只中加入反應混合液3mL和磷酸緩沖液1mL，作為對照，另1支中加入反應混合液3mL和上述酶液1mL（如酶活性過高可稀釋之）。迅速將兩支試管中溶液混勻后，倒入比色杯，置于分光光度計樣品室內，立即開啟秒表記錄時間，于470nm處測定吸光度（OD）值，每隔10S讀數(shù)一次。結果計算：以每分鐘0D變化值（4A470/gFWmin）表示酶活性大小，。也可以用每minOD值變化0.01作為1個過氧化物酶活性單位(U)表示。過氧化物酶活性(U/gFWmin)=A470XVT/WXVSX0.01Xt式中：A470反應時間內OD變化值。VT提取酶液總體積(mL)。W植物鮮重(g)oVs測定時取用酶液體積(mL)ot反應時間(min)o三、思考題1測定過氧化物酶活性除了本方法外，還可以采用什么方法進行？2在植物體