白細胞新單克隆抗體ZCH2B8a的表達譜分析及其意義

1、白細胞新單克隆抗體ZCH-2B8a的表達譜闡發(fā)及其意義湯永民郭莉,楊世隆,沈紅強,錢柏芹,張怡,張海忠【關鍵詞】ZH-2B8a抗體；白細胞單克隆抗體；造血干/祖細胞；白血病，淋巴瘤ReativityfaNvelnlnalAntibdyZH-2B8anNralHeatpietiellsandalignantellLinesandItsSignifianeKeyrdsZH-2B8aantibdy;leukytenlnalantibdy;heatpietiste/prgenitrell;leukeia;lypha白細胞膜抗原抗體研究對血液體系腫瘤的診斷、分型、微小殘留病RD的監(jiān)測以及靶向治療均具有非

2、常緊張的意義和遼闊的應用遠景1-7。ZH(ZhejianghildrenHspital)-2B8a是本科研究室自行研制的鼠抗人造血細胞分化抗原的單克隆抗體，已經提交第8屆國際人類白細胞分化抗原協(xié)作組集會HLDA8斷定。按照HLDA8總部大量研究的反響信息表白，該抗體識別的抗原性子不明，屬國際上尚未熟悉的血細胞膜新的分化抗原8。為了進一步明白2B8a抗體的抗原識別特性，我們應用多色流式細胞術檢測2B8a抗原在正凡人外周血細胞、外周血和骨髓D34+造血干/祖細胞以及種種細胞系細胞上的表達，現(xiàn)將開端效果總結報道如下。質料和要領ZH-2B8a雜交瘤細胞株的創(chuàng)立以人原始髓細胞白血病細胞系KG1a作為免疫

3、原，接納經典雜交瘤技能9將小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0交融，經選擇造就液造就后和KG1a細胞挑選，得到1株與KG1a細胞呈弱陽性反響的細胞系，定名為ZH-2B8a簡稱2B8a。經3次以上亞克隆造就，創(chuàng)立了能不變排泄2B8a抗體的雜交瘤細胞系。該抗體經用抗小鼠免疫球卵白亞類試劑盒和流式細胞儀F闡發(fā)，證明為IgG2a抗體。以造就上清滴度116作為抗體泉源舉行研究。正常細胞泉源正常外周血細胞身分的疏散選擇本實行室身材康健的年輕志愿者3名，別離抽取其外周靜脈血15l,肝素鈉抗凝。經180g離心5分鐘疏散血漿和血細胞，取血漿部門移入另一試管中，經1800g離心20分鐘，棄上清，沉淀物作為血小

4、板的泉源，懸浮于適量的含5小牛血清的RPI1640造就液中備用。血細胞部門用10l造就液稀釋后，別離參加終濃度為1.5%的羥乙基淀粉Hespan,美國Baxter公司產物，放入37水浴鍋中孵浴1小時，使之天然沉落，取上層液體部門作為白細胞的泉源，經磷酸鹽緩沖液PBS，0.01l/L,pH7.4離心洗滌2次后，用含5滅活小牛血清的RPI1640造就液適量，制成細胞懸液，調細胞濃度至107/l備用。下層作為成熟紅細胞的泉源，同上RPI1640造就液懸浮制成細胞懸液并調細胞濃度為107/l備用。細胞系B系細胞系Nall-1，SS-SB，Nal-6，Raji購自美國AT公司，凍存于本研究室液氮中。清醒

5、后參加10滅活小牛血清的RPI1640造就液，于37、52、飽和濕度造就箱中通例造就擴增細胞，網絡充足的細胞，經洗滌后，用0.4%臺盼藍計數(shù)活細胞，細胞存活率在95以上，制成單細胞懸液，調細胞濃度為107/l備用。T系細胞系E、J、lt-4、lt-3購自美國AT公司，凍存于本研究室液氮中，經清醒后同上造就及細胞懸液制備備用。髓系細胞系eg-01巨核細胞白血病細胞系、KG1a原始粒細胞白血病細胞系、U937單核細胞白血病細胞系、HL-60早幼粒細胞白血病細胞系、K562、HEL紅白血病細胞系購自美國AT公司，凍存于本研究室液氮中，經清醒后同上造就及制成細胞懸液備用。神經母細胞瘤細胞系LAN-1、

6、KNR、BE由美國南加州大學醫(yī)學院Reynlds傳授惠贈，SK-N-AS、SK-N-SH購自美國AT公司，凍存于本研究室液氮中，經清醒后用上述造就液舉行貼壁細胞造就，待細胞到達90造就瓶底覆蓋時，接納0.2%胰酶/EDTA液消化疏散細胞，臺盼藍計數(shù)細胞存活率達85以上者用于實行，以同上造就液舉行貼壁造就及細胞懸液制備后備用。結腸癌細胞系HR8348引自浙江大學腫瘤研究所，按上述要領擴增造就并制成細胞懸液備用。羊膜細胞株FL引自浙江大學醫(yī)學院病理教研室，用同上述要領擴增造就和處置懲罰后備用?？贵w2B8a抗體泉源于該雜交瘤細胞的造就上清，抗體滴度達116以上。異硫氰酸熒光素FIT標識表記標幟的羊抗

7、鼠免疫球卵白GA購自美國KPL公司。D3-AP、D19-PE、D56-PE、D34-PE、D38-AP、D33-AP、D14-PE、D66b-PE、D45-PerP、HLA-DR-PerP、GlyphrinA-PE、D41-PE及種種熒光素標識表記標幟的同型陰性比較抗體均購自美國BetnDikinsn公司。染色要領取上述種種細胞身分，每管106細胞，設同型陰性比較1管。經AB血漿孵育以停滯F受體后，別離參加2B8a抗體上清50l，混勻后室溫反響20分鐘，用PBS洗滌1次，參加FIT-GA0.5g，4避光反響20分鐘，用PBS洗滌2次。對細胞系闡發(fā)管直接行流式細胞術F闡發(fā)，別的細胞身分闡發(fā)管別離

8、參加如下相干直接標識表記標幟的熒光抗體以選擇相應細胞群：T細胞管參加D3，B細胞管參加D19,NK細胞參加D3和D56，D細胞管參加HLA-DR、D33、D14、D5610，單核細胞管參加D14，粒細胞管參加D66b，紅細胞管參加GPA,血小板管參加D41，造血干/祖細胞管參加D45、D34、D38。避光室溫反響20分鐘后，用FAS溶血劑每管1l室溫避光溶血10分鐘，以PBS洗滌2次，用500lPBS重懸浮細胞行F闡發(fā)。流式細胞術闡發(fā)接納美國BetnDikinsn公司的FASalibur流式細胞儀和ellQuest3.1軟件獵取數(shù)據，外周血細胞身分闡發(fā)獵取10000個細胞，造血干/祖細胞獵取6

9、0000個細胞，儲存于電腦影象體中。按照陰性比較闡發(fā)抗原的表達環(huán)境。以20陽性細胞數(shù)作為陽性尺度10。統(tǒng)計學闡發(fā)以重復3次效果的中位數(shù)表現(xiàn)。效果2B8a抗原在外周血細胞上的表達2B8a抗原在D34+造血干/祖細胞及其亞群上的表達2B8a抗原在3例骨髓總D34+細胞上均有差異程度的表達(3/3例)，陽性細胞率39.33；在D34+D38和D34+D38-細胞的陽性表達別離為1/3例和2/3例，陽性細胞率別離為13.58和20.42。而在G-SF發(fā)動的外周血干/祖細胞，2B8a抗原僅在1/3例的總D34+細胞上表達，陽性細胞率為1.25；在D34+D38和D34+D38-細胞的陽性表達均為1/3例

10、，陽性細胞率別離是1.27和0表2?？梢?，2B8a抗原在骨髓D34+細胞上表達，在造血干/祖細胞亞群上重要在D34+D38-原始干細胞上表達，在D34+D38的造血祖細胞的表達那么較低，而在G-SF發(fā)動的PBS細胞上那么不表達。Table2.Reativityf2B8aantibdytD34+ellsanditssubsetsderivedfrbnearrandG-SFbilizedperipheralbldheatpietiste/prgenitrells(略)2B8a抗原在細胞系上的表達討論ZH-2B8a是本研究接納原始髓細胞白血病細胞系KG1a作為免疫原通過雜交瘤技能研制樂成的抗人白細胞

11、分化抗原的單克隆抗體。該抗體經HLDA8協(xié)作組集會相干的研究機構全面地研究相識該抗體識別抗原的性子，提示該抗體所識別的分子大概是如今尚未熟悉的抗原8。因此，對該抗體在正常血細胞身分以及在種種血液腫瘤細胞系中的表達譜研究具有緊張意義。接納流式細胞儀和一系列尺度化熒光素直接標識表記標幟的抗體對外周血、骨髓、G-SF發(fā)動的外周血造血干/祖細胞舉行設門界說闡發(fā)，要領可靠6,11。效果表現(xiàn)，2B8a抗原重要在B細胞系與單核細胞系細胞上表達，在經檢測的4個B細胞系中，固然此中的3個出現(xiàn)高表達，但在一個B細胞系即Nall1細胞上卻不表達，緣故原由不明。別的，該抗體固然用KG1a作為免疫原并用該細胞系舉行挑選

12、得到，但該抗體識別的抗原在KG1a細胞上的表達卻很低，緣故原由是克隆該抗體的時間，在同一造就孔中克隆出來的細胞造就上清中，亞克隆到2個反響強度差異的雜交瘤克隆，此中弱反響的1個定名為ZH-2B8a被克隆建株保存下來舉行了深化研究。別的，該抗體在上皮性羊膜細胞系FL細胞上的表達也較高，這與HLDA8協(xié)作組研究效果同等。該研究機構總部信息提示，該抗體與宮頸癌細胞系HeLa細胞與鱗狀上皮細胞系HUT.78有必然的反響性HLDA8信息交換，其緣故原由不明。按照HLDA8總部信息反響得知，該抗體對骨髓瘤細胞系如JJN3、P1有很強的反響性HLDA8信息交換，對外周血B細胞、漿細胞無反響，提示該抗體大概可以用于骨髓瘤的診斷，本研究尚未接納骨髓瘤病人標本舉行闡發(fā)，這一方面有待于進一步深化研究。別的，HLDA8研究效果表現(xiàn)，該抗體對正常外周血身分包羅淋巴細胞、粒細胞、單核細胞和骨髓細胞無反響，而對活化