植物基因克隆方法

1、關(guān)于植物基因克隆方法第一張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、基因克隆（分子克隆molecular cloning） 通過體外重組技術(shù),將一段目的DNA經(jīng)切割、連接插入適當載體，并導(dǎo)入受體細胞，擴增形成大量子代分子的過程。二、基因克隆的核心-體外重組(Recombination) 人工將一段目的DNA插入一個載體的過程。第二張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月載體DNA（vector）目的DNA（target fragment）重組DNA（recombinant DNA ）宿主（host）篩選、擴增克?。╟lone）基因克隆的路線DNA 重組轉(zhuǎn)化第三張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于

2、2022年6月 用何種方法取決于基因產(chǎn)物（Gene products）的豐度以及gene的相關(guān)背景知識，如 gene or its protein 的表達模式及初級結(jié)構(gòu)等 （一）已知 基因產(chǎn)物 的基因分離（二）未知 基因產(chǎn)物 的基因分離第四張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）已知 Gene products 的基因分離1、利用DNA探針篩選基因文庫 前提是已知一段DNA序列并構(gòu)建了基因文庫 同源(homologous)DNA探針 為了克隆一個完整基因結(jié)構(gòu)或研究調(diào)節(jié)序列。 異源(Heterologous)DNA探針 利用一種植物的一段DNA序列作探針，從其它 植物中克隆同源基因 注意

3、：有的基因在不同物種間同源性很高，有的則很低。第五張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月2、利用protein信息分離基因 前提是所研究的protein可以從植物中分離純化 利用antibody篩選表達文庫(Expression Library) Antibody production Construction of Expression Library 利用protein測序的氨基酸信息 Probe (oligonucleotides) Primer (degenerated primer)第六張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月(b) Oligonucleotide probes

4、 or generated primers for genes whose translation products have been characterized p176Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met 1 2 2 2 2 1 (16 species)Ser-Glu-Try-Leu-Thr-Asn 6 2 2 6 4 2 (1152 species)第七張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第八張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月RT-PCR and RACE PCRReverse Transcription, Rapid Amplification of cDNA

5、 Ends第九張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月問題1：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒有RT-PCR產(chǎn)物。原因：1）RNA被降解 建議解決方法：利用無污染技術(shù)分離RNA；如果使用RNase抑制劑，不要加熱超過45或pH超過8.0。2）RNA中包含逆轉(zhuǎn)錄抑制劑 建議解決方法：通過乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70（v/v）乙醇對RNA沉淀進行清洗。逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，甲酰胺和胍鹽。RT-PCR實驗中的常見問題與對策第十張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月3）多糖同RNA共沉淀 建議解決方法：使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。 4）起始RNA量不夠 建議解

6、決方法：增加RNA量。對于50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1g到0.5g乙酰BSA。5）RNA模板二級結(jié)構(gòu)太多 建議解決方法：將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火. 提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度，對SuperScript可以到50，對ThermoScript可以到65。注意：不要在60時使用oligo(dT)引物，選擇一個在反應(yīng)溫度可以退火的GSP。對于1kb的RT-PCR產(chǎn)物，保持反應(yīng)溫度65。注意：不要在高于37時使用M-MLV。如果不需要全長cDNA，在第一鏈反應(yīng)中使用隨機引物。第十一張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月6）PCR引物設(shè)計較差建議解決方法：避

7、免在引物3端含有互補序列。避免可以形成內(nèi)部發(fā)卡結(jié)構(gòu)的序列。設(shè)計Tm類似的引物。7）鎂離子濃度太低建議解決方法：從1mM到3mM，間隔0.5mM進行一系列反應(yīng)，確定對于每個模板和引物對的最佳鎂離子濃度。8）退火溫度太高建議解決方法：把退火溫度設(shè)定為低于Tm 5。因為公式估算Tm值比所有真正的退火溫度實際會高些或低些。 9）富含GC的模板建議解決方法：對于GC含量50的模板，使用PCRx Enhancer Solution。 第十二張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月問題2：在瓊脂糖凝膠分析中觀察到非預(yù)期條帶。原因：1）引物和模板非特異性退火建議解決方法：以2到5間隔增加退火溫度，減少退火時

8、間。在開始幾個循環(huán)使用較高的退火溫度，然后使用較低的退火溫度。使用Platinum Taq DNA進行自動熱啟動PCR。2）引物設(shè)計較差避免在引物3端含有2到3個dG或dC。3）RNA中沾染了基因組DNA4）鎂離子濃度太高建議解決方法：優(yōu)化鎂離子濃度。5）因為擴增復(fù)雜模板導(dǎo)致引物錯誤起始建議解決方法：使用巢式PCR或遞減PCR。第十三張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月RACEPCR第十四張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR和細胞內(nèi)DNA復(fù)制的相同點：（1）兩者都符合半保留復(fù)制模型，即兩條鏈都可作為 模板，子代鏈中一條鏈來自于親代鏈，另一條鏈 是新合成的（2）兩者都需要引物（

9、3）兩者都需要依賴DNA的DNA聚合酶（4）兩者的底物都是dNTP（5）DNA合成時都是在DNA聚合酶作用下按堿基配對 原則往3-OH上加dNTP，形成3，5磷酸二酯鍵（6）兩者新合成鏈延伸的方向都是5to3（7）兩者DNA合成的保真度（精確性）都較高第十五張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR和細胞內(nèi)DNA復(fù)制的不同點：（1）復(fù)制為半不連續(xù)復(fù)制，而PCR兩條鏈的合成都是連續(xù)的（2）復(fù)制時引物是由引發(fā)酶或引發(fā)體合成的，而PCR引物是在反應(yīng)前加到反應(yīng)體系中（3）復(fù)制需要在特定的復(fù)制原點起始，并且有終止點，而PCR在有特異引物存在時在任何序列都可起始，并且沒有終止點（4）復(fù)制時兩條模板鏈

10、是在解旋酶的作用下局部打開雙鏈，而PCR兩條模板鏈通過變性完全打開雙鏈（5）復(fù)制時兩條鏈的合成是同步進行的，而PCR兩條鏈的合成可能不同步（6）PCR的DNA聚合酶為耐熱的DNA聚合酶，而復(fù)制的聚合酶一般不耐熱（7）復(fù)制一般為雙向復(fù)制，而PCR反應(yīng)中DNA合成是單向的（8）復(fù)制時由多種蛋白因子參與，而PCR只有DNA聚合酶參與第十六張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）未知 Gene products 的基因分離1、差異雜交篩選（differential hybridization screening） 2、mRNA 差異顯示( differential display) 3、DNA

11、 表達文庫（expression library） 4、 DNA 結(jié)合蛋白基因的分離 5、信號傳遞蛋白基因的分離 6、圖位克隆技術(shù)（Map-based cloning）第十七張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月建庫法cDNA Libraryab第十八張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）是根據(jù)絕大多數(shù)真核細胞mRNA3端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)構(gòu)，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。該方法的創(chuàng)始人Liang P和Pardee A根據(jù)Poly A序列起點前2個堿基除AA外只有12種可能性的

12、特征，設(shè)計合成了12種下游引物，稱3-錨定引物，其通式為5-T11MN；同時為擴增出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能性的mRNA序列，在5端又設(shè)計了20種10bp長的隨機引物。這樣構(gòu)成的引物對進行PCR擴增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA。將差別表達條帶中的DNA回收，擴增至所需含量，進行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達的目的基因 。第十九張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月mRNA 差異顯示( diff

13、erential display)第二十張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月表達文庫法第二十一張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月從基因文庫的功能上看可分為克隆文庫及表達文庫。 克隆文庫由克隆載體構(gòu)建。載體中具復(fù)制子、多克隆位點及選擇標記，可通過細菌培養(yǎng)使克隆片斷大量增殖。 表達文庫是用表達載體構(gòu)建。載體中除上述元件外，還具有控制基因表達的序列(如啟動子、SD序列、ATG、終止子等)，可在宿主細胞中表達出克隆片段的編碼產(chǎn)物。表達載體又有融合蛋白表達載體及天然蛋白表達載體之分。 從克隆文庫中分離目的克隆時主要利用核酸探針，可以是根據(jù)蛋白質(zhì)序列合成的寡核苷酸探針，也可以是同種或同屬生物

14、的同源序列探針。從表達文庫中分離目的克隆時，因克隆片段的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)具有抗原性及生物活性，所以除核酸探針外，還可以利用免疫學(xué)探針及生物功能進行篩選。表達文庫適合于那些不知道蛋白質(zhì)的氨基酸序列、不能用核酸類探針篩選的目的基因的分離。 第二十二張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1、差異雜交篩選（differential hybridization screening） 2、mRNA 差異顯示( differential display) 3、DNA 表達文庫（expression library） 4、 DNA 結(jié)合蛋白基因的分離 5、信號傳遞蛋白基因的分離 6、圖位克隆技術(shù)（Map-b

15、ased cloning）利用表達文庫利用酵母單雜交第二十三張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月Promoter structure3 noncoding region5 noncoding regioncoding regionPromoter region0 ATG-75 -25TATACAATEnhancerSilencerOther control sequenceCore promoterTermination signal第二十四張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA 結(jié)合蛋白第二十五張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月a. DNA結(jié)合域 -DNA bindi

16、ng domain，簡稱DNA-BD，它可識別效應(yīng)基因上游的一段特定的區(qū)段， 即上游激活序列(up-stream activating sequence, UAS)，并與之結(jié)合。 b. 轉(zhuǎn)錄激活域 -Transcriptional activation domain，簡稱AD，它通過同轉(zhuǎn)錄機(transcription machinery)中的其它成分的結(jié)合作用，啟動UAS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄因子的兩個主要結(jié)構(gòu)域： 第二十六張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月酵母單雜交(yeast one hybrid)技術(shù)是體外分析DNA與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的一種方法，通過對酵母細胞內(nèi)報告基因

17、表達狀況的分析，來鑒別DNA結(jié)合位點并發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因，或?qū)NA結(jié)合位點進行分析. 運用此技術(shù)，能篩選到與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，并可直接從基因文庫中得到編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列，而無需復(fù)雜的蛋白質(zhì)分離純化操作 。目前認為真核生物的轉(zhuǎn)錄起始需要轉(zhuǎn)錄因子的參與。這些轉(zhuǎn)錄因子通常由一個DNA結(jié)合域（BD)和一個或多個與其他調(diào)控蛋白相互作用的轉(zhuǎn)錄激活域（AD）組成。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白即是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子。酵母單雜交 Yeast one-hybrid system第二十七張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月GAL4的DNA結(jié)合域靠近羧基端,含有幾個鋅指結(jié)構(gòu),可激活酵母半乳

18、糖苷酶的上游激活位點(UAS);而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性.在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨立地發(fā)揮作用.據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為其他蛋白，只要他能與我們想要了解的目的基因相互作用，就照樣可以通過其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，從而啟動對下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。正是基于這一理論，酵母單雜交系統(tǒng)由2部分組成：(1)將文庫蛋白片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達的cDNA文庫質(zhì)粒；(2)含有目的基因和下游報告基因的報告質(zhì)粒。首先將報告質(zhì)粒整合入酵母基因組,產(chǎn)生帶有目的基因的酵母報告株；再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入

19、報告株；若存在文庫蛋白與目的基因相互作用,可通過對報告基因的表達將文庫蛋白的基因篩選出來.第二十八張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十九張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1、差異雜交篩選（differential hybridization screening） 2、mRNA 差異顯示( differential display) 3、DNA 表達文庫（expression library） 4、 DNA 結(jié)合蛋白基因的分離 5、信號傳遞蛋白基因的分離 6、圖位克隆技術(shù)（Map-based cloning）第三十一張，PPT共

20、四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 酵母雙雜交體系 酵母雙雜交體系(yeast - two hybrid system, Y2H)是上一世紀九十年代初期在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種敏感的檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法，亦即是體內(nèi)鑒定基因的方法。它不僅可有效地用來分離能與一種已知的靶蛋白(target protein)相互作用的另一種蛋白質(zhì)及其編碼基因， 而且可以用來確定蛋白質(zhì)相互作用的特異性結(jié)構(gòu)域及其氨基酸序列。第三十二張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月方法構(gòu)建兩種E.coli-Yeast穿梭質(zhì)粒載體 :已知基因與BD序列融合表達融合的蛋白質(zhì)叫做誘餌蛋白質(zhì)(Bait protein

21、) 第一種質(zhì)粒載體又叫做誘餌質(zhì)粒載體或DNA-BD質(zhì)粒載體(具Trp基因) 。第三十三張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第二種質(zhì)粒載體又叫做文庫質(zhì)粒載體或AD質(zhì)粒載體，它具有亮氨酸基因(leu)，是用來構(gòu)建cDNA表達文庫的專用載體 。cDNA編碼蛋白質(zhì)與GAL4-AD多肽融合這種與AD融合的蛋白質(zhì)叫做基因文庫編碼蛋白質(zhì)，其中可與誘餌蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的特稱為捕獲蛋白質(zhì)(prey protein)第三十四張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月AD: GAL4 Activation Domain; DNA-BP: DNA Binding Protein;USA：Upstream ac

22、tivating sequence.GAL1 UAS啟動子LacZ (or HIS3) 報告基因GAL1 UAS啟動子LacZ (or HIS3) 報告基因GAL1 UAS啟動子LacZ (or HIS3) 報告基因轉(zhuǎn)錄DNA BDADDNA BD(a)(b)(c)XYADXY第三十五張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月1、差異雜交篩選（differential hybridization screening） 2、mRNA 差異顯示( differential display) 3、DNA 表達文庫（expression library） 4、 DNA 結(jié)合蛋白基因的分離 5、信號傳遞

23、蛋白基因的分離 6、圖位克隆技術(shù)（Map-based cloning）第三十六張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月圖位克隆技術(shù)圖位克隆(Map - based cloning) 又稱定位克隆(positional cloning) , 1986 年首先由劍橋大學(xué)的Alan coulson 提出，用該方法分離基因是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進行的，無需預(yù)先知道基因的DNA順序，也無需預(yù)先知道其表達產(chǎn)物的有關(guān)信息，但應(yīng)有以下兩方面的基本情況:一是有一個根據(jù)目的基因的有無建立起來的遺傳分離群體。二是開展以下幾項工作:1) 首先找到與目標基因緊密連鎖的分子標記；2) 用遺傳作圖和物理作圖將目標

24、基因定位在染色體的特定位置；3) 構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫(BAC 庫或YAC) ；4) 以與目標基因連鎖的分子標記為探針篩選基因組文庫；5) 用獲得陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的跨疊群；6) 通過染色體步行、登陸或跳躍獲得含有目標基因的大片段克?。?) 通過亞克隆獲得含有目的基因的小片段克??；8) 通過遺傳轉(zhuǎn)化和功能互補驗證最終確定目標基因的堿基序列。 第三十七張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA markers for genetic maps第三十八張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 eg. The breast cancer gene BRCA1Mapping o

25、f BRCA1To isolate the gene, the first step is to determine which chromosome contains it and the position of the gene on this chromosome.第三十九張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十一張，PPT共四十七頁，創(chuàng)作于2022年6月圖位克隆存在的問題圖位克隆也有其自身的局限性，在某些情況下，就很難或者不能通過圖位克隆技術(shù)來定位基因。 在分析自然發(fā)生的變異的時候，我們最有可能遇到的復(fù)雜情況是一個給定的性狀是由不止一個的基因位點控制的。無論何時，當影響這些性狀的自然或者誘導(dǎo)的突變被定位的時候，第二位點修飾成分會干擾這些分析。 表觀（上位）遺傳突變這個術(shù)語是描述一個基因在表達和功能上的可遺傳改變，