氨基酸蛋白質提取工藝特性

1、關于氨基酸蛋白質提取工藝特性第一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、氨基酸的特性因氨基酸分子較小，且有羧基、氨基，同時具有堿性和酸性極性基團較多，所以它的極性較大，能溶于水，不溶于有機溶劑。因同時具有羧基和氨基，有酸堿兩性的性質，能與酸和堿形成不同的鹽。當溶液的pH發(fā)生變化時，溶液中的離子狀態(tài)也發(fā)生了變化。在電場中酸性溶液的氨基酸則向陰極電泳，而在堿性溶液中則向陽極電泳，當溶液的pH值達一定時，氨基酸不向任何電極移動，此時溶液的pH值就是該氨基酸的等電點。不同的氨基酸有不同的等電點，在等電點時氨基酸的溶解度最低，根據這種性質可以用電泳法分離氨基酸。第二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于20

2、22年6月氨基酸在適當的條件下，能進行有機胺或有機酸的幾乎全部反應。與一般的酸和堿可生成穩(wěn)定的鹽，大部分均能溶于水，但與重金屬如銅、銀、汞等制成的絡合物不溶于水，也可利用這種性質來分離氨基酸。第三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、氨基酸的浸出水浸出法：將中草藥以粉碎機粉碎，裝入逆流浸出罐組的每一個浸出罐中。用水做浸出溶劑，最好在有攪拌的條件下，加熱進行逆流浸出。稀乙醇浸出法：將生藥粉末裝入逆流滲濾浸出罐組的每一個浸出罐中。以70%乙醇進行滲濾浸出，先浸出的溶液濃度較大，后浸出的溶液濃度較低。最好采用逆流滲漉浸出法，把出液系數控制在5，可以得到較好的浸出效果。 第四張，PPT共三十二

3、頁，創(chuàng)作于2022年6月三、氨基酸的分離水浸出液或稀乙醇減壓濃縮后的水溶液往往含有幾種或十幾種氨基酸，因此所得的是總氨基酸，必須進行分離純化。一般采用以下的純化方法：離子交換法:這是分離氨基酸的常用方法。可直接將水或稀乙醇提取物通過裝有離子交換樹脂的交換柱，帶正荷的氨基酸與樹脂上的-SO基吸附。由于氨基酸帶的正電荷隨溶液pH發(fā)生變化，同一氨基酸在不同pH的緩沖溶液中，以及不同氨基酸在同一pH的環(huán)境中，所帶的正電荷各不相同，與磺酸基吸附的強弱也相應不同?？梢越柚@種差別，使氨基酸互相分離。第五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月成鹽分離法:利用某些酸性氨基酸與某些金屬化合物，如氫氧化鋇、氫

4、氧化鈣生成難溶性鹽，或某堿性氨基酸與一般酸生 成鹽，從而與其他未成鹽的氨基酸分離。如南瓜子中的南瓜子氨基酸是通過與過氯酸生成結晶性鹽而分出的。晶析法:利用不同氨基酸等電點不同，進行晶析結晶分離。例如在含有亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的溶液，其pH值為1.52.0時，濃縮先晶析出亮氨酸，它的母液加鹽酸后再濃縮晶析出異亮氨酸，最后母液中回收纈氨酸。 第六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月四、氨基酸、肽的鑒別反應茚三酮(Ninhydrin)反應：所有的a-氨基酸及含有a-氨基酸的肽類和蛋白質都能和該試劑反應呈現(xiàn)蘭色或蘭紫色。必要時加熱，反應可在濾紙上進行。(2)吲哚醌(Isatin）試劑反應：不

5、同的氨基酸與吲哚醌試劑反應，能顯示不同的顏色。由于試劑的配制方法不同，對同一種氨基酸所顯示的顏色也往往有差異。吲哚醌不僅可用于氨基酸的顯色，而且從其顏色的區(qū)別，可以幫助辨認氨基酸。顯色不穩(wěn)是其特點，氨對顯色無干擾。 第七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 蛋白質提取工藝特性 一、不同結構的蛋白質及其溶解性質蛋白質按其功能可分為活性蛋白和非活性蛋白二類；按結構又可分為簡單蛋白和結合蛋白二類：再一種分類是根據蛋白質的溶解度差別而分為水溶性蛋白、醇溶性蛋白等，還有一類硬蛋白，不溶于水、稀酸、稀堿和有機溶劑，遇強酸、強堿水解。 第八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋 白 質 類

6、 別溶 解 性 質簡單蛋白質1.白蛋白2.球蛋白 a.真球蛋白 b.擬球蛋白3.醇溶蛋白4.谷蛋白5.精蛋白6.組蛋白1、溶于水及稀鹽、稀酸、稀堿溶液，可被50%飽和度硫酸銨析出。2、a.一般在等電點不溶于水，但加入少量的鹽、堿則可溶解。 b.溶于水，可為50%的飽和度硫酸銨析出。3、溶于7080%乙醇中，但不溶于水及無水乙醇。4、在等電點不溶于水，也不溶于稀鹽酸，易溶于稀酸，稀 堿溶液。5、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。6、溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀。硬蛋白質不溶于水、鹽、稀酸、稀堿結合蛋白質(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白等)此類蛋白質溶解度

7、性質隨蛋白質與非蛋白結合部分的不同而異， 除脂蛋白外，一般可溶于稀酸，稀堿及鹽溶液中，脂蛋白如脂質部分露于外，則脂溶性占優(yōu)勢，如脂質部分被包圍于分子之中，則水溶性占優(yōu)勢。表6-1 不同結構的蛋白質及其溶解性質第九張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、蛋白質及酶的一般提取方法1.水溶液提取 凡能溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿的蛋白質或酶，一般都可用稀鹽溶液或緩沖溶液進行提取。稀鹽溶液有利于穩(wěn)定蛋白質結構和增加蛋白質溶解度。加入的提取液的量要適當，加入量太少提取不完全，加的量太多，則不利于濃縮，一般用量為原材料36倍體積左右，可一次提取或分次提取。提取時常緩慢攪拌，以提高提取效率。以鹽溶液或緩沖

8、液提取蛋白質和酶時，常綜合考慮下列因素： 第十張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)鹽濃度：提取蛋白質的鹽的濃度，一般在0.020.2M的范圍內。常用稀溶液和緩沖液有0.020.05M磷酸緩沖液，0.090.15M氯化鈉溶液。 (2)pH值：蛋白質和酶所用的提取液pH值一般選擇在被提取的蛋白質等電點兩側的穩(wěn)定區(qū)內。 (3)溫度：蛋白質和酶一般都不耐熱，所以提取時通常要求低溫操作。第十一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2.有機溶劑提取一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，難溶于水、稀鹽、稀酸和稀堿，常用有機溶劑提取。如丙酮、異丙醇、乙醇、正丁醇等，均可溶于

9、水或部分溶于水，這些溶劑都同時有親脂性和親水性。其中正丁醇有較強的親脂性，也有一定親水性，在0時于水中有10.5的溶解度。它在水和脂分子間起著類似去污劑的作用，取代蛋白質與脂質重新與蛋白質結合，使原來蛋白質在水中溶解度大大增加。丁醇在水溶液及各種生物材料中解離脂蛋白的能力極強，是其他有機溶劑所不及的。我國生化工作者曾用此法成功地提取了琉拍酸脫氫酶，對于堿性磷酸醋酶的提取效果也十分顯著。第十二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月有些蛋白質和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于一定比例的有機溶劑。在這樣的情況下，采用稀的有機溶劑提取常常是為防止水解酶的破壞，并兼有除雜和提高純化效果的作用。第十三張，

10、PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3、從細胞膜上提取水溶性蛋白質的方法膜上的蛋白質或酶一般有兩種存在狀態(tài)，一是在膜表面上，與膜成分聯(lián)系比較松；第二是膜的內在成分之一，或與膜成分結合較緊。蛋白質與膜成分的結合可通過脂質形成復合物，也可以通過金屬離子與膜成分結合，或與膜其他蛋白質形成復合物。與膜成分結合較松的蛋白質或酶，經過充分破碎細胞，在一定pH范圍用稀鹽溶液即可提取分離。但一些與膜成分結合較牢或屬于膜組成的蛋白質，提取則比較困難，須用超聲波、去污劑或其他比較強烈的化學處理，才能從膜上分離出來。主要方法有：第十四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)濃鹽或尿素等溶液提取 如NaCl

11、O4、尿素、肌鹽酸等溶液均有人應用于提取膜蛋白，當以上溶液濃度達到2mol/L時，可提取27以上的膜蛋白，但使用這樣條件易引起蛋白質和酶的變性。(2)堿溶液提取 堿性條件也可以解離與膜上成分結合的蛋白質。在pH8-10范圍內，某些膜蛋白隨著pH的提高而溶解度大大增加，至pHll時，有40%-50的膜蛋白被抽出，但堿提取法也容易引起蛋白質和酶的失活，應用上不廣。(3)加人金屬鰲合劑 蛋白質通過金屬離子與膜成分結合時，加人金屬鰲合劑如EDTA可使蛋白質釋放出來。用此法曾成功地提取了膜上ATP酶的偶聯(lián)因子I 。EDTA與超聲波聯(lián)合處理抽提膜上的磷酰轉移酶效果更好。第十五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2

12、022年6月(4）有機溶劑抽提 使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正丁醇等溶劑抽提及用冷丙酮做成丙酮粉，是提取膜上與脂質結合的脂蛋白或膜內脂蛋白組分最常用也較有效的方法，其中叔戊醇及正丁醇用于膜內脂蛋白效果尤佳。前已提到正丁醇可在廣泛的pH (pH3-10)和溫度范圍（-240）內使用。用有機溶劑結合其他方法已成功地提取了多種膜上蛋白質和酶，如NPDH脫氫酶、唬珀酸脫氫酶、細胞色素氧化酶、堿性磷酸酯酶、膽堿酯酶等。第十六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(5)去垢劑處理 去垢劑處理是目前廣泛應用于提取膜上水溶性蛋白和脂蛋白的方法，常用的去垢劑有弱離子去垢劑脫氧膽酸鹽、膽酸鹽，強離子型去垢劑十二烷

13、基磺酸鈉(SDS）和非離子型去垢劑Triton X-100和Tween, Lubrol和Brij等。去垢劑處理膜蛋白時的濃度通常為1左右，用此法提取的膜蛋白和酶有細胞色素BS、膽堿醋酶、細胞色素氧化酶、DPNH氧化酶、ADP/ATP載體蛋白等。第十七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月用去垢劑分離膜蛋白時，選擇去垢劑首先考慮：去垢劑的溶解能力；去垢劑的溫和性。強離子型去垢劑（如SDS)一般具有很好的溶解能力，但溫和情況不理想，容易引起蛋白質變性。弱離子型或非離子型去垢劑對蛋白質變性影響較小，而溶解能力差。去垢劑的溶解能力與溶液的離子強度大小有關。一般來說，離子強度增加，去垢劑的溶解能力也

14、隨之增大。所以使用去垢劑溶解膜蛋白時，須考慮各種條件。根據Klingenberg等的經驗，分離線粒體膜DP/ATP載體蛋白，選用Triton X100比用Lubrol, Brij和Aminoxide等去垢劑效果更好，所得ADP/ATP載體蛋白具有較高的天然活性。但主要缺點是riton X100在280nm處有強的紫外吸收，干擾用紫外法測定蛋白質的含量。第十八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(6)加人脂酶或磷酸酯酶水解蛋白質一脂質復合物 從蛇毒中提取的磷酸醋酶A主要作用于磷脂，最適pH為6-8。從胰臟中提取的醋酶作用于單、二、三甘油醋，酶作用最適pH為7-8o醋酶和磷酸醋酶均需要Ca

15、2激活。用酶法處理提取的膜蛋白及酶有細胞色素C、 a-磷酸甘油脫氫酶、TPNH-細胞色素C還原酶等。第十九張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、蛋白質的純化方法1.根據蛋白質等電點的不同來純化蛋白質 蛋白質、多肽及氨基酸都是兩性電解質，在一定pH環(huán)境中，某一種蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，或解離成兩性離子，其凈電荷為零，此時環(huán)境的pH值即為該蛋白質的等電點。在等電點時蛋白質性質比較穩(wěn)定，其物理性質如導電性、溶解度、粘度、滲透壓等皆最小，因此可以利用蛋白質等電點時溶解度最小的特性來制備或沉淀蛋白質。 等電點沉淀 等電點除雜第二十張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2.根據蛋白質

16、分子形狀和大小的不同來純化蛋白質 蛋白質的一個主要特點是：分子大，而且不同種類的蛋白質分子大小也不相等。由此可以用凝膠過濾法、超濾法、離心法及透析法等將蛋白質與其它小分子物質分離，也可將大小不同的蛋白質分離。 凝膠過濾層析第二十一張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3.根據蛋白質溶解度的不同來純化蛋白質 蛋白質的溶解度受溶液的pH、離子強度、溶劑的電解質性質及溫度等多種因素的影響。在同一特定條件下，不同的蛋白質有不同的溶解度，達到分離的目的。鹽溶與鹽析，結晶，低溫有機溶劑沉淀法。如:鹽析和有機溶劑分級分離法。4.根據蛋白質電離性質的不同來純化蛋白質 離子交換劑作為一種固定相，本身具有正離

17、子或負離子基團，它對溶液中不同的帶電物質呈現(xiàn)不同的親和力，從而使這些物質分離提純。 蛋白質、多肽或氨基酸具有能夠離子化的基團。 對蛋白質的離子交換層析，一般多用離子交換纖維和以葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠為骨架的離子交換劑。主要是取得其有較大的蛋白質吸附容量、較高的流速和分辨力。第二十二張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5.根據蛋白質功能專一性的不同來純化蛋白質。 主要手段是親和層析法，即利用蛋白質分子能與其相應的配體進行特異性的、非共價鍵的可逆性結合而達到純化的目的。 固相化金屬親和層析IMAC是新發(fā)展的一種親和層析技術。蛋白質分子中的咪唑基和巰基可與一些金屬元素（如Cu2

18、+,Zn2+)形成配位結合，使蛋白質得到分離純化。第二十三張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月6.根據蛋白質疏水基團與相應的載體基團結合來純化蛋白質 蛋白質上有疏水區(qū)，它們主要由酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等非極性的側鏈密集在一起，并暴露于分子表面。這些疏水區(qū)能夠與吸附劑上的疏水性基團結合，在通過降低介質的離子強度和極性等方法將蛋白質洗脫下來。如疏水相互作用層析7.根據蛋白質在溶劑系統(tǒng)中分配的不同來純化蛋白質 逆流分配色譜第二十四張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月8.根據蛋白質受物理、化學等作用因素的影響來純化蛋白質。 蛋白質易受pH、溫度、酸堿、金屬離子、蛋白質沉

19、淀劑，絡合劑等的影響，用于各種蛋白質都存在差異，可利用這種差異來分離純化蛋白質。 如：電泳法、結晶純化第二十五張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月9.根據蛋白質的選擇性吸附性質來純化蛋白質 在蛋白質分離中，最廣泛使用的吸附劑有結晶磷酸鈣，磷酸鈣凝膠，硅膠，皂土、沸石、硅藻土、活性白土、氧化鋁以及活性炭等。如：吸附層析10.根據酶對蛋白質的作用來純化蛋白質 SOD酶抗蛋白水解酶。 親和層析第二十六張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月總之，蛋白質和酶從細胞內提取出來后，仍處于十分混雜的體系中，必須進一步純化。但經過提取除去了大量與制備性質差別較大的雜質，只剩余與制備物理性質大致相近或類

20、似的物質。因此，經過有選擇性的提取這一步驟，對以后純化工作創(chuàng)造十分有利條件。蛋白質和酶溶劑提取后進一步分離純化常用方法有如下幾種： 第二十七張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)鹽析法；(2)等電點沉淀法；(3)有機溶劑分級分離法；(4)層析法（凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析）；(5)電泳法（等電聚焦電泳、雙向凝膠電泳）(6)結晶純化等。第二十八張，PPT共三十二頁，創(chuàng)作于2022年6月四、蛋白質的鑒別方法雙縮脲(Biuret）反應：本試劑為1 CuS04和40%NaOH溶液等量混合。主要是Cu +2與蛋白質或肽分子中肽鍵-CO-NH-絡合呈色。蛋白質水提液和上述試劑反應，顯紅紫色。這是檢驗雙縮脲以及有兩個肽鍵以上的化合物的一個方法。雙縮脲不溶