淺析對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的基因多態(tài)性分型研究

1、淺析對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的基因多態(tài)性分型研究【摘要】目的探究一種正確、快速、可靠的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(RSA)的分子生物學(xué)分型要領(lǐng)，相識(shí)病院內(nèi)RSA的多態(tài)性，為臨床公正、有用地利用抗生素和操縱耐藥基因在種群間的流傳提供幫助。要領(lǐng)用eA基因相干高變區(qū)PR擴(kuò)增(HVR-PR)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)兩種要領(lǐng)，對(duì)RSA菌株舉行多態(tài)性闡發(fā)。HVR-PR檢測(cè)eA基因相干高變區(qū)正相重復(fù)序列元件(DRUs)的長(zhǎng)度，按照DRUs數(shù)量標(biāo)差異對(duì)RSA分型;RAPD按照電泳圖譜中條帶的數(shù)量及位置，經(jīng)NTSYS統(tǒng)計(jì)軟件舉行聚類闡發(fā)，得到遺傳樹狀圖，按RSA菌株之間的相干性舉行分型。結(jié)果應(yīng)用HVR

2、-PR要領(lǐng)可將31株RSA標(biāo)天職為7型，別離含有7、8、9、10、11、12和16個(gè)DRUs，此中10DRUs型最多11/31(35.48%)，16DRUs型最少1/31(3.23%);應(yīng)用RAPD分型，31株RSA共分10型，此中以型為主10/31(32.26%)，其他型漫衍比力靠近。在11株HVR-PR分型的10DRUs型中RAPD型4株4/11(36.36%)，RAPD型和RAPD型各2株2/11(18.18%);10株RAPD型中9DRUs型、10DRUs型各4株4/10(40.00%)。結(jié)論RAPD要領(lǐng)和HVR-PR要領(lǐng)對(duì)RSA的分型率都比力高，并且這兩種要領(lǐng)都比力簡(jiǎn)樸、不變、可靠、

3、快速，有用性強(qiáng)，具有遼闊的應(yīng)用遠(yuǎn)景?！娟P(guān)鍵詞】耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;eA基因;隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA;eA基因相干高變區(qū)PR擴(kuò)增KEYRDS:ethiillin-resistantStaphylusaureus;eAgene;randaplifiedplyrphiDNA;PRfrthee-assiatedhypervariableregin葡萄球菌的分型要領(lǐng)許多，傳統(tǒng)的分型要領(lǐng)包羅血清學(xué)分型、抗生素分型等，但均無法滿意正確區(qū)分的要求。分子生物學(xué)技能的出現(xiàn)為這一范疇?zhēng)砹烁锩?。如今，分子分型要領(lǐng)已成為研究細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生及流傳的緊張本領(lǐng)，常見的有：脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-fielgelel

4、etrphresis,PFGE)，隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性(randaplifiedplyrphiDNA,RAPD)，eA基因高變區(qū)長(zhǎng)度多態(tài)性(PRfrthee-assiatedhypervariableregin,HVR-PR)，熒光擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性(fluresentaplifiedfragentlengthplyrphris,FAFLP)等。這些要領(lǐng)各有特點(diǎn)，應(yīng)用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(ethiillin-resistantStaphylusaureu,RSA)的分型在國表里均有報(bào)道，但這些要領(lǐng)尚未成熟，各地分型尺度也不一樣，且多接納單一的分型要領(lǐng)。RAPD和HVR-PR團(tuán)結(jié)應(yīng)用于RS

5、A多態(tài)性分型尚未見報(bào)道。本實(shí)行接納RAPD和HVR-PR兩種要領(lǐng)對(duì)RSA菌株舉行分型，相識(shí)其多態(tài)性漫衍狀態(tài)、區(qū)分菌株之間的相干性，為公正、有用地利用抗生素和操縱耐藥基因在種群間的流傳提供理論基矗1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1質(zhì)料1.2要領(lǐng)2結(jié)果2.1RSA的HVR-PR分型結(jié)果應(yīng)用HVR-PR要領(lǐng)對(duì)31株RSA標(biāo)本舉行分型，一共可以分為7型，別離含有7、8、9、10、11、12和16個(gè)DRUs。全部的RSA都可以擴(kuò)增出長(zhǎng)度450820bp的基因片斷，用HVR-PR分型要領(lǐng)都可以加以區(qū)分，分型率到達(dá)了100%。DRUs的數(shù)量=(擴(kuò)增的基因片斷長(zhǎng)度-171)/40，此中171是存在于擴(kuò)增序列之中而沒有重復(fù)的序

6、列片斷長(zhǎng)度，40是每一個(gè)正向重復(fù)單位序列的長(zhǎng)度。全部RSA菌株中，10DRUs型最多(11/31，35.48%)，其次是9DRUs型(8/31，25.81%)，11DRUs型(4/31，12.90%)，7DRUs型(3/31，9.68%)，12DRUs型(2/31，6.45%)，8DRUs型(2/31，6.45%)，最少的是16DRUs型(1/31，3.23%)。2.2RSA的RAPD分型結(jié)果應(yīng)用RAPD與HVR-PR對(duì)31株RSA舉行團(tuán)結(jié)分型，這兩種要領(lǐng)的分型率都比力高，都到達(dá)了100%。在11株HVR-PR分型的10DRUs型中RAPD型4株(36.36%)，RAPD型和RAPD型各2株(

7、18.18%);10株RAPD型中9DRUs型、10DRUs型各4株(40.00%)(表2)。表2RAPD與HVR-PR對(duì)RSA的團(tuán)結(jié)分型圖331株RSA的遺傳間隔樹狀圖Fig.3Thegenetidistanetreef31RSAs橫坐標(biāo)為相干系數(shù)，縱坐標(biāo)為菌株編號(hào)。3討論按照HVR多態(tài)性，將31株RSA分為7型，以10DRUs型多見，共11株(35.5%)，16DRUs型少見，只有1株(3.23%)。SENNA等1報(bào)道，按照HVR多態(tài)性將從巴西PrtAlegre地域分散的254株RSA分為8型。本實(shí)行未創(chuàng)造3DRUs型及5DRUs型，而多了16DRUs型，這大概與菌株數(shù)較少有關(guān)，也大概當(dāng)?shù)?/p>

8、域無此型菌株存在，有待進(jìn)一步研究。接納HVR-PR法對(duì)RSA舉行分型，與RSA的表型分型法、藥敏試驗(yàn)相團(tuán)結(jié)，對(duì)付追蹤RSA熏染源、操縱盛行、引導(dǎo)臨床抗菌藥物的公正應(yīng)用具有緊張意義。別的，RSA中dru差異重復(fù)次數(shù)有何詳細(xì)生物學(xué)意義，即片斷巨細(xì)差異對(duì)PBP2a構(gòu)型及其介導(dǎo)耐藥性凹凸的干系有何影響，國表里尚無報(bào)道，有待進(jìn)一步探究。SHITZ等3用PFGE、RAPD、16-23SrDNA、卵白APR、HVR-PR、凝固酶基因PR對(duì)183株RSA分型，創(chuàng)造PFGE結(jié)果與HVR-PR結(jié)果相近，對(duì)RSA都有比力高的區(qū)分本領(lǐng)。IHELHAUS等4同時(shí)應(yīng)用凝固酶基因多態(tài)性、spa基因多態(tài)性，eA基因高變區(qū)長(zhǎng)度

9、多態(tài)性及PFGE對(duì)46株RSA舉行分子分型研究，證明了這3種特異成效團(tuán)體的多態(tài)性分型要領(lǐng)與PFGE分型同等，得當(dāng)于短時(shí)間如幾天到幾周內(nèi)的盛行病學(xué)闡發(fā)，12h可出結(jié)果，而PFGE那么需5d或更長(zhǎng)時(shí)間。固然HVR-PR沒有PFGE對(duì)RSA分型結(jié)果好，但是比凝固酶基因PR更能有用地對(duì)RSA分型，并且分型率比力高，對(duì)其盛行病學(xué)研究有緊張的意義5。eA基因是耐甲氧西林葡萄球菌所特有，而HVR基因高變區(qū)與該基因精細(xì)相連，存在于其卑劣，也具有特異性。HVR-PR法操縱簡(jiǎn)樸、快速，不必要特別的電泳裝備和限定酶消化，大多數(shù)的臨床微生物實(shí)行室皆可舉行。本實(shí)行在藥敏試驗(yàn)的底子上接納雙引物RAPD法對(duì)31株RSA舉行

10、了基因分型，按照RAPD電泳圖譜中條帶的數(shù)量及位置，經(jīng)NTSYS統(tǒng)計(jì)軟件舉行聚類闡發(fā)，得到遺傳樹狀圖。31株RSA共分為10個(gè)基因型。韓立中等6用RAPD法將檢測(cè)菌株分為4個(gè)型別(AD型)，分型區(qū)別較大的緣故原由大概是RAPD引物選擇的差異，別的由于利用隨機(jī)的引物，一旦基因組DNA分子產(chǎn)生片斷插入、缺失或堿基突變，將造成引物特定團(tuán)結(jié)位點(diǎn)的變革，使PR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶產(chǎn)生分子量和數(shù)量標(biāo)改變。ILLE等7在美國紐約市立病院及紐約疾病操縱中央共網(wǎng)絡(luò)103株金黃色葡萄球菌，用RAPD分型要領(lǐng)共檢測(cè)出71株RSA，檢出率高達(dá)69%，此中52株被以為與病院和社區(qū)熏染有關(guān)，其他19株同源性相差較遠(yuǎn)，被以為是盛

11、行病學(xué)無關(guān)株。VANBELKU等8曾用3種RAPD引物(RAPD1、RAPD7和ERI2)對(duì)金黃色葡萄球菌分型，并同PFGE作比力，證明RAPD是金葡菌基因闡發(fā)以及監(jiān)測(cè)病院熏染盛行較抱負(fù)的分型本領(lǐng)。RAPD的特異性好、闡發(fā)周期短、淺易、不變、可靠、不必要特別試劑和生物質(zhì)料，有用于全部生物的分型，尤其是對(duì)一些尚未創(chuàng)立尺度分型要領(lǐng)和缺乏血清型等要領(lǐng)的菌屬(種)的斷定和分型特別有用。美國病院盛行病學(xué)協(xié)會(huì)已保舉該要領(lǐng)為病院熏染中常見病原菌的分型要領(lǐng)9。因此，RAPD技能在熏抱病學(xué)、微生物盛行病學(xué)和病院內(nèi)熏染學(xué)范疇有很好的應(yīng)用遠(yuǎn)景。在RSA的盛行病學(xué)研究中，每每會(huì)把幾種要領(lǐng)團(tuán)結(jié)利用，如許對(duì)RSA的盛行病

12、學(xué)闡發(fā)每每會(huì)越發(fā)正確。李家泰等10接納HVR-PR基因型和腸毒素基因型相團(tuán)結(jié)，創(chuàng)造兩種基因型團(tuán)結(jié)起來有助于進(jìn)步RSA分型的可靠性。本實(shí)行將RAPD要領(lǐng)與HVR-PR要領(lǐng)相團(tuán)結(jié)，以藥物敏感實(shí)行為底子，對(duì)臨床分散的RSA做盛行病學(xué)闡發(fā)。RAPD要領(lǐng)和HVR-PR要領(lǐng)對(duì)RSA的分型率都比力高，都到達(dá)了100%，并且這兩種要領(lǐng)都比力簡(jiǎn)樸、不變、可靠、快速，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)RSA舉行分型。研究中還創(chuàng)造這兩種要領(lǐng)之間沒有很好的相干性，即雷同的RAPD型可以表示出差異的HVR-PR型;反之，雷同的HVR-PR型也可以出現(xiàn)出差異的RAPD型?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1SENNAJP,PINTA,ARVALHLPS,eta

13、l.parisnfpulsed-fieldgeleletrphresisandPRanalysisfplyrphissntheehypervariablereginfrtypingethiillin-resistantStaphylusaureusJ.Jlinirbil,2002,(6):2254-2256.2TABIA,PEREG,TALSANIAH,etal.Analysisfanutbreakfnn-phage-typeableethiillin-resistantstaphylusaureusbyusingarandlyaplifiedplyrphiDNAassayJ.Jlinirbi

14、l,1997,35(12):3092-3097.3SHITZFJ,STEiERT,TIHYiHV,etal.Typingfethiillin-resistantStaphylusaureusislatesfrDsseldrfbysixgentypiethds.Jedirbil,1998,47(4):341-351.4IHELHAUSTA,HUNFELDKP,BDDINGHAUSB,etal.RapidleulartypingfethiillinresistantStaphylusaureusbyPR-RFLPJ.InfetntrlHspEpideil,2001,22(5):294-298.5N

15、ISHIJ,YSHINAGA.Anepideilgisurveyfethiillin-resistantStaphylusaureusbybinedusefe-HVRgentypingandtxingentypinginauniversityhspitalinJapanJ.InfetntrlHspEpideil,2002,23(9):506-510.6韓立中，王大方，楊莉.上海地域3所病院RSA的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分型J.中國熏染與化療雜志,2022,7(12):88-91.7ILLE,VANL.ValiatinfbinarytypingfrStaphylusaureusstrainsJ.ASietyirbil,1999,37(3):664-674.8VANBELKUA,KLUYTANSJ,VANLEEUEN,etal.ultienterevaluatinfarbitrarilypriedPRfrtypingfStaphylusaureusstrainsJ.Jlinirbil,1995,33(6)