等位基因特異性PCR聯(lián)合限制性內(nèi)切酶消化法檢測(cè)JAK2V617F突變

1、等位基因特異性-PCR團(tuán)結(jié)限定性內(nèi)切酶消化法檢測(cè)JAK2V617F突變申徐良陳方平魏武張梅香史文芝秦小琪徐嘹亮【摘要】目的：創(chuàng)立敏感特異的JAK2V617F點(diǎn)突變的臨床檢測(cè)要領(lǐng)。要領(lǐng)：基因組DNA從HEL細(xì)胞或正常志愿者外周血中提齲接納等位基因特異性-PRAllelespeifi-PR，AS-PR和限定性內(nèi)切酶消化的要領(lǐng)檢測(cè)基因組中JAK2V617F突變。效果：本AS-PR法可對(duì)JAK2基因擴(kuò)增出364bp的內(nèi)參照條帶，當(dāng)存在JAK2V617F突變時(shí)，又可以擴(kuò)增出203bp的突變條帶。只有野生型內(nèi)參照條帶364bp可被BsaX消化切割。結(jié)論：ASPR法和限定性內(nèi)切酶法是檢測(cè)JAK2V617F突

2、變的敏感特異的檢測(cè)要領(lǐng)，可以樂成應(yīng)用于臨床檢測(cè)?！娟P(guān)鍵詞】等位基因特異性-PR；JAK2V617F突變；限定性內(nèi)切酶BsaXAbstratbjetive:TestablishasensitiveandspeifitestfrJAK2V617Fpintutatin.ethds:GeniDNAasislatedfrHELellsrPeripheral-bldellsfrnralvlunteer.Allele-speifiplyerasehainreatins(AS-PR)andrestritinenzyedigestinereperfredtdetettheutatiningeniDNA.Resu

3、lts:Antrlband(364bp)anbebtainedbyAS-PR,andautedband(203bp)anbebtainednlyhenJAK2V617Faspresented.nlyildtypentrlband(364bp)anbedigestedbyrestritinenzyeBsaX.nlusin:AS-PRandrestritinenzyedigestineresensitiveandspeifitestsfrJAK2V617Fpintutatin,andanbesuessfullyusedfrlinialtest.KeyrdsAllelespeifi-PR;JAK2V

4、617Futatin;RestritinenzyeBsaXJAK2基因?qū)貸AKs(Januskinases/Justantherkinases)家屬成員，是胞漿非受體性酪氨酸激酶,在多種造血生長(zhǎng)因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。2022年，Baxter和Kralvus先后創(chuàng)造大部門骨髓增殖性疾病患者攜帶有一個(gè)得到性的JAK2基因突變-JAK2V617F，該基因突變位于JAK2基因第1849位，本來的鳥嘌呤G被胸腺嘧啶T所代替，導(dǎo)致原位于617位的纈氨酸錯(cuò)義編碼為苯丙氨酸(GT,JAK2V617F)。該突變的陽性率在PV中高達(dá)65%97%、ET為23%57%和IF為35%57%，在AL/L中有少量

5、表達(dá)6。JAK2V617F基因突變的創(chuàng)造是比年來骨髓增殖性疾病發(fā)病機(jī)制的打破性希望，因此有學(xué)者將其稱為骨髓增殖性疾病的“JAK2期間。JAK2V617F的創(chuàng)造對(duì)付臨床上骨髓增殖性疾病的診斷和區(qū)分診斷有非常緊張的意義。為此，我們?cè)谂R床上創(chuàng)立了兩種敏感特異的JAK2V671F點(diǎn)突變的檢測(cè)要領(lǐng)等位基因特異性PR法Allelespeifi-PR，AS-PR和限定性內(nèi)切酶消化法。這兩種要領(lǐng)的應(yīng)用，有利于進(jìn)步骨髓增殖性疾病的臨床診斷程度。1質(zhì)料與要領(lǐng)1.1細(xì)胞造就HEL細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上?？茖W(xué)研究院，造就于含10%胎牛血清(Hylne)、100U/L青霉素，100U/L鏈霉素的RPI1640(Gib)

6、造就基中，置于37、5%2、飽和濕度的造就箱中造就，每3d換液一次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯適時(shí)以13的比例傳代，取對(duì)數(shù)生恒久的細(xì)胞用作實(shí)行。1.2基因組DNA制備HEL細(xì)胞基因組和正凡人血液基因組DNA用血液基因組提取試劑盒上海生物工程公司產(chǎn)物提齲1.3AS-PR及產(chǎn)物闡發(fā)PR引物合成事情由北京奧科生物公司完成。各引物序列如下：公用反向引物(R1)5-TGAATAGTTAAGTGTTTTAGTTTA-3、野生型正向引物(F1)5-ATTATAGTATGTGAAAGTAGGAGAAAG-3364bp、突變特異性正向引物(F2)5-AGATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3203

7、bp。PR反響體系為50L,每管中參加80ngDNA模板，公用反向引物(10)1L，突變特異性正向引物(10)1L或野生型正向引物(10)1L，10XPR緩沖液5L，25gl23L，10dNTPs1L，5U/L的Taq聚合酶1L，末了用去離子水補(bǔ)足50L。置于JResearhPT-100基因擴(kuò)增儀中按以下步伐擴(kuò)增:先94變性11in,然后舉行擴(kuò)增循環(huán)，包羅變性40s94、退火1in54、和延伸1in72，擴(kuò)增35循環(huán)，末了72延伸10in。AS-PR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠含EB電泳斷定，應(yīng)用AlphaEaseF凝膠成像處置懲罰體系不雅察并闡發(fā)效果。BsaX限定性內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)物。酶切反

8、響體系：PR產(chǎn)物20L，NEBBuffer44L，BsaX1L2U，去離子水15L，總體積40L，37溫育4h。酶切完畢后于2瓊脂糖凝膠中電泳不雅察效果。2效果HEL細(xì)胞株是人紅白血病細(xì)胞株，有學(xué)者6證明HEL細(xì)胞為JAK2V617F基因突變的純合子。因此，在本實(shí)行中我們以HEL細(xì)胞作為一個(gè)的含有JAK2V617F突變的的陽性標(biāo)本，用于創(chuàng)立JAK2V617F突變的檢測(cè)要領(lǐng)。AS-PR歷程中野生型正向引物(F1)5-ATTATAGTATGTGAAAGTAGGAGAAAG-3和公用反向引物(R1)5-TGAATAGTTAAGTGTTTTAGTTTA-3別離位于基因組上該突變位點(diǎn)的上游和卑劣，擴(kuò)增產(chǎn)

9、物為364bp，該擴(kuò)增作為AS-PR的陽性比較，用于查驗(yàn)基因組DNA提取的質(zhì)量和PR體系的準(zhǔn)確性。無論基因組中是否存在JAK2V617F突變，只要提取的基因組DNA完備，PR體系準(zhǔn)確，這兩條引物都可以擴(kuò)增出364bp的產(chǎn)物。突變特異性正向引物(F2)5-AGATTTGGTTTTAAATTATGGAGTATATT-3是針對(duì)突變位點(diǎn)方案的突變引物，該引物3端包羅2個(gè)錯(cuò)配的核苷酸。當(dāng)基因組中存在JAK2V617F突變時(shí)，該引物與公用反向引物(R1)可以擴(kuò)增出203bp的產(chǎn)物，當(dāng)基因組中不存在JAK2V617F突變時(shí)PR不克不及擴(kuò)增。圖1為AS-PR的效果，在該圖中可以看到野生型正向引物(F1)和公用

10、反向引物(R1)擴(kuò)增出的條帶位于300bp和400bp之間364bp，同時(shí)突變特異性正向引物(F2)與公用反向引物也擴(kuò)增出一條清楚銳利的條帶，巨細(xì)為200bp擺布203bp。2.2BsaX酶切闡發(fā)限定性內(nèi)切酶法所接納的限定性內(nèi)切酶是BsaX。BsaX識(shí)別序列為：5-NNNNNNNGGAGNNNNNGTNNNNNNNNNNNN-33-NNNNNNNNNNTNNNNNANNNNNNNNN-5在我們擴(kuò)增的364bp的AS-PR產(chǎn)物中該酶的識(shí)別序列為：5-AAATTATGGAGTATGTGTTGTGGAGAGA-33-AAATTTAATATATAAAGAATT-5BsaX可將野生型的364bp的PR產(chǎn)

11、物切割為174bp，160bp，30bp三個(gè)片斷。在2的瓊脂糖凝膠中30bp的片斷區(qū)分不清，174bp產(chǎn)物和160bp的產(chǎn)物難以分開而聚攏成一條帶圖2，lane1。起首用野生型正向引物(F1)和公用反向引物(R1)對(duì)HEL細(xì)胞的基因組DNA舉行擴(kuò)增，得到364bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將該產(chǎn)物用BsaX切割，電泳效果如圖2所示：正凡人的比較PR產(chǎn)物被切割為174bp和160bp的兩個(gè)片斷，而HEL細(xì)胞的PR產(chǎn)物不克不及被切割。3討論可以檢測(cè)JAK2V617F點(diǎn)突變的要領(lǐng)許多，比方，AS-PR法,限定性內(nèi)切酶消化法和直接測(cè)序法等，差異的要擁有差異的特點(diǎn)和良好性。等位基因特異性PR最大的長(zhǎng)處是敏感性高，

12、只必要少少量的模板DNA便可以得到很好的效果。限定性內(nèi)切酶要領(lǐng)的檢測(cè)敏感性不及AS-PR法，其長(zhǎng)處在于輕便易行，消耗不高，而且可以作為一個(gè)高通量挑選的要領(lǐng)。測(cè)序法固然可以或許提供應(yīng)我們正確的序列信息，但是由于色譜圖配景的影響其敏感性有限。而且該要領(lǐng)耗時(shí)耗力，消耗比力高，必要一些特別的儀器裝備，在臨床檢測(cè)方面的應(yīng)用照舊有必然的困難。其他檢測(cè)要領(lǐng)如及時(shí)定量PR法和DNA融解曲線闡發(fā)法焦磷酸測(cè)序法和質(zhì)譜法等，利用者較少。我們以HEL細(xì)胞系作為JAK2V617F突變的陽性比較，應(yīng)用突變特異性引物(F2)(3端包羅2個(gè)錯(cuò)配的核苷酸，使得野生型JAK2的難以擴(kuò)增)對(duì)突變基因舉行擴(kuò)增，此后我們又對(duì)突變DNA序列舉行了限定性內(nèi)切酶闡發(fā)，表白這兩種要領(lǐng)比力敏感而且特異性強(qiáng)。我們的履歷提示：在一樣平常環(huán)境下，80ng基因組DNA經(jīng)35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后就可以看到顯著的條帶。假設(shè)參加模板太多，大概會(huì)擴(kuò)增出一些與目的條帶分子量差異的非特異條帶，而小于40ng的基因組DNA那么必要增長(zhǎng)循環(huán)(大概增長(zhǎng)假陽性率)才氣檢測(cè)到；退火溫度的選擇對(duì)付實(shí)行的樂成黑白常緊張的，58是比力相宜的退火溫度。假設(shè)退火溫度高于60時(shí)突變特異性引物(F2)將不克不及擴(kuò)增出顯著的條帶