細(xì)胞懸浮培養(yǎng)與次生代謝物質(zhì)生產(chǎn)

1、 第六章 植物細(xì)胞懸浮培育及次生代謝產(chǎn)物消費(fèi) .1983年，日本三井石油化學(xué)工業(yè)公司在世界上初次勝利地采用紫草細(xì)胞培育工業(yè)化消費(fèi)紫草寧。.北京錦繡大地農(nóng)業(yè)股份gldadi/index.html.1 植物次生代謝產(chǎn)物概述 2 細(xì)胞的初代培育 3 高產(chǎn)細(xì)胞系的挑選 4 植物細(xì)胞懸浮培育方法 5 植物次生代謝物質(zhì)消費(fèi).1.1 植物代謝產(chǎn)物1初生代謝：為維持植物正常的生長發(fā)育所必需的代謝。初生代謝過程中構(gòu)成的各種產(chǎn)物為初生代謝產(chǎn)物。初生代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定，在體內(nèi)容易發(fā)生轉(zhuǎn)化。2次生代謝：建立在初生代謝根底上，對于植物的正常生長發(fā)育非必需的代謝，其代謝產(chǎn)物為次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物是末端代謝產(chǎn)物，比較穩(wěn)定

2、，可以在體內(nèi)積累。. 類別 次生代謝產(chǎn)物 用途 黃酮 銀杏黃酮，大豆黃酮 治療心血管疾病 醌 紫草寧 抗菌、抗炎、抗病毒、止血 簡單酚類 香豆素 香料，抗菌消炎萜 類 紫杉醇 抗癌 青蒿素 抗瘧疾生 物 堿 長春新堿 抗癌 奎寧 抗瘧疾酚類化合物.長春堿： 2 million/kg長春新堿： 15million/kg. 李時珍在中所開列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25的法定藥品來自植物。其藥物的有效成分均為次消費(fèi)物。天然的次生代謝產(chǎn)物曾經(jīng)超越2萬種。次生代謝產(chǎn)物的運(yùn)用：色素、香料、藥物、添加劑、工業(yè)原料等。.紫杉醇：二萜類化合物最早由太平洋紅豆杉Taxus brevifoli

3、a的樹皮中分別廣泛用于治療卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等十幾種癌癥目前主要來源于紅豆杉屬植物紫杉醇簡介.市場需求抗癌一線用藥銷售額年增長率5億美圓 實際需求量 2g /人, 500萬人/年 1000kg/年實踐銷量350 kg/年紫杉醇供需相差非常懸殊 圖1：國際紫杉醇原料藥需求走勢圖單位：公斤圖2：國際紫杉醇銷售額億美圓.藥源問題紅豆杉 主要原料植物 國家一級維護(hù)野生植物，全球十大瀕危物種之一生長緩慢 分布有限 Taxol含量低 樹皮中Taxol含量:0.00001-0.069% 3000棵樹=10噸樹皮=1kg Taxol=500病人700歲的紅豆杉慘遭剝皮.人工栽培 采用種子繁衍、扦插等

4、無性繁衍方法快速、大面積人工繁育紅豆杉幼苗尋覓紅豆衫的替代物 從紅豆杉非樹皮部位提取 產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物藥源問題處理方法一.藥源問題處理方法二化學(xué)合成全合成 1994年獲得勝利 現(xiàn)有六種途徑半合成 以10-DAB和Baccatin 作為半合成原料獲得紫杉醇.藥源問題處理方法三生物方法組織和細(xì)胞培育微生物發(fā)酵生物合成 研討階段 紅豆杉生物合成途徑根本明確 10種相關(guān)酶基因被克隆表達(dá) 利用基因工程手段改造紅豆杉提高紫杉醇產(chǎn)量 .1.2 獲得植物次生代謝產(chǎn)物的方法從植物中提取化學(xué)合成植物細(xì)胞大規(guī)模培育消費(fèi)次生代謝產(chǎn)物植物細(xì)胞具有形狀全能性，化學(xué)全能性在離體的條件下可以合成整株植物能合成的物質(zhì).

5、自然植物和細(xì)胞培育的紫草寧含量比較消費(fèi)方式 消費(fèi)周期 紫草寧含量干重完好植物 23年 12植物細(xì)胞培育 3周 14.細(xì)胞培育是消費(fèi)次生代謝產(chǎn)物的理想途徑：縮短周期，提高消費(fèi)效率植物細(xì)胞培育消費(fèi)周期為15-30d；而完好植株生長短那么幾個月，長那么數(shù)年，如木瓜8個月，而紫草為5年易于管理，減輕勞動強(qiáng)度培育在無菌條件下進(jìn)展，可排除病蟲害干擾可探求新的合成道路，獲得新的有用物質(zhì).1.3 植物細(xì)胞懸浮培育：即是將植物細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)在液體培育基中進(jìn)展大規(guī)模培育的技術(shù)。.勝利的懸浮細(xì)胞培育體系必需滿足3個條件：分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，普通在 3050個細(xì)胞以下，在實踐培育中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)

6、胞懸浮系。細(xì)胞分裂快，均一性好，細(xì)胞外形和細(xì)胞團(tuán)大小大致一樣，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培育基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈艷麗的乳白或淡黃色。有效成分含量高。次消費(fèi)物的產(chǎn)量=細(xì)胞量*細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率可控遺傳要素決議. 植物細(xì)胞培育具有周期長、細(xì)胞抗剪切才干弱、易聚團(tuán)等特點。 植物細(xì)胞培育反響器的設(shè)計不僅要思索有利于細(xì)胞生長，還要思索有利于產(chǎn)物的積累和分別。 適宜植物細(xì)胞培育的反響器應(yīng)具有適宜的氧傳送、良好的流動性和較低的剪切力。.2 細(xì)胞的初始培育實驗中獲得適宜于懸浮培育的細(xì)胞系的過程稱為細(xì)胞的初始培育。2.1建立懸浮系獲取懸浮培育的細(xì)胞細(xì)胞的振蕩培育酶解法愈傷組織培育法使細(xì)胞團(tuán)分散促進(jìn)氣體

7、交換.攪拌培育； 旋轉(zhuǎn)振蕩培育； 旋轉(zhuǎn)培育培育方式：.2.2 建立良好的懸浮系的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 1. 選擇適宜的外植體雙子葉植物：幼胚、成熟胚、下胚軸、葉片單子葉植物：幼胚、成熟胚、幼穗、花藥等. 2. 誘導(dǎo)疏松愈傷組織； 培育基 愈傷組織的異質(zhì)性； 繼代培育 3. 選擇適宜的培育基； 根本培育基+CTK/AUX+天然復(fù)合物 eg:SH+NAA3.0+BA1.0+CM/YE 培育基的PH.李忠光，龔明. 2006.7.4. 懸浮培育初期的控制 轉(zhuǎn)速，光，溫度5. 懸浮細(xì)胞的繼代與選擇 繼代中搜集小的細(xì)胞團(tuán) 條件培育基：新穎培育基.3 高產(chǎn)細(xì)胞系的挑選(P113)3.1高產(chǎn)細(xì)胞系 挑選的整體思緒外植體

8、愈傷組織的誘導(dǎo)挑選懸浮培育細(xì)胞高產(chǎn)細(xì)胞系挑選.高產(chǎn)細(xì)胞系的建立高產(chǎn)細(xì)胞株系的特點培育細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物細(xì)胞生長及產(chǎn)物合成的速度快，在較短的時間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累，而不被迅速分解，最好能將其釋放到培育基中.高產(chǎn)細(xì)胞系的挑選過程選定特定起始資料準(zhǔn)確選擇可以產(chǎn)生目的代謝產(chǎn)物的植物種類、種類或單株應(yīng)盡量選擇自然形狀下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的組織或器官為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并獲得單細(xì)胞懸浮液誘變處置細(xì)胞懸浮液，挑選目的突變細(xì)胞經(jīng)過單細(xì)胞培育突變細(xì)胞，獲得突變細(xì)胞無性系即突變細(xì)胞愈傷組織獲得.高產(chǎn)細(xì)胞系的挑選方法目測法留意：真正的變異體or生理形狀不同的細(xì)胞克隆

9、根據(jù)單細(xì)胞克隆次生代謝產(chǎn)物含量進(jìn)展挑選抗性挑選如：添加抗性抑制劑 庚二酸-生物素誘變挑選.3.2 高產(chǎn)系的穩(wěn)定性及保管方法盡量減少繼代次數(shù)，用礦物油包埋法，低溫保管法0-4，超低溫保管法-196 保管。同時從高產(chǎn)系中不斷克隆構(gòu)成新的高產(chǎn)細(xì)胞系。.4 植物細(xì)胞懸浮培育的方法懸浮培育：將游離的細(xì)胞或者細(xì)胞團(tuán)按一定密度，懸浮在液體培育基中，不斷攪拌或者振蕩培育，使細(xì)胞快速、大量增殖。技術(shù)難點：通氣、剪切力的順應(yīng)性；細(xì)胞同步化控制。培育：培育基：根本培育基+CTK/AUX 培育條件：溫度、氧氣、PH、轉(zhuǎn)速同步化控制細(xì)胞增殖的監(jiān)測，適時測定細(xì)胞的數(shù)量，掌握放罐時機(jī)。.4.1 細(xì)胞懸浮培育的方法(P117

10、) 分批培育法 延續(xù)培育法 半延續(xù)培育法 細(xì)胞固定化培育.分批培育：把細(xì)胞分散在一定溶積的培育基中進(jìn)展培育。注：中途不添加也不改換培育基設(shè)備簡單，操作方便，反復(fù)性好。適宜與突變體挑選和遺傳轉(zhuǎn)化的研討。.懸浮培育細(xì)胞增殖曲線 時間d細(xì)胞數(shù)量123451滯后期、 2對數(shù)生長期3直線生長期 、4減緩期5靜止期1細(xì)胞擴(kuò)增生長成S形曲線2繼代培育：要求縮短滯后期 滯后期的長短：a 繼代細(xì)胞所處的生長時期；對數(shù)期 b 繼代的細(xì)胞密度 104-105個/ml.延續(xù)培育：在培育過程中，不斷向反響 器中以一定流量添加新培育基，同時以 一定流量從系統(tǒng)中取出培育基及培育物的方式。參與培育基排出培育基及其培育物.半延

11、續(xù)培育：在完成分批培育的一個周期 后，從反響器中取出大部分細(xì)胞懸液，只 保管小部分細(xì)胞懸液作為下一培育周期的 種子細(xì)胞，然后參與新穎培育基進(jìn)展培育 的方式。細(xì)胞固定化培育：將細(xì)胞固定在固相基質(zhì)上，放入培育液進(jìn)展培育的方式。.懸浮培育反響器的類型： 機(jī)械攪拌式反響器 氣動式反響器內(nèi)循環(huán)氣升式外循環(huán)氣升式.機(jī)械攪拌式.內(nèi)循環(huán)氣升式.外循環(huán)氣升式.4.2 培育基：與培育的細(xì)胞密度相關(guān)1高密度懸浮系5*104個/mla 用B5，ER等公用培育基b 對傳統(tǒng)培育基做出改良如：加大2,4-D用量；改良MS，參與VB、CH等天然復(fù)合物2低密度懸浮系5*104個/mla 條件培育基b 向培育基中添加多種成分，盡

12、能夠滿足細(xì)胞生長的需求.細(xì)胞同步化：同一懸浮培育體系的大多數(shù)細(xì)胞都同時經(jīng)過細(xì)胞周期的某一特定時期。細(xì)胞培育的同步化方法：饑餓法：限制必需物質(zhì)的供應(yīng)抑制法：化學(xué)抑制，物理抑制分級培育：細(xì)胞分級儀4.3 懸浮細(xì)胞培育的同步化(P121).4.4 懸浮細(xì)胞的生長量和活力分析(P122)1測定懸浮細(xì)胞數(shù)量的方法：細(xì)胞計數(shù)-血球計數(shù)板 鮮重、干重的測定細(xì)胞密實體積(PVC)2細(xì)胞活力測定二乙酸熒光素法 FDA-活細(xì)胞內(nèi)有熒光產(chǎn)生伊凡蘭染色法-染色受損細(xì)胞核-死細(xì)胞相差顯微鏡法-胞質(zhì)環(huán)流能否存在. 5 植物細(xì)胞大規(guī)模培育消費(fèi)次生代謝物質(zhì)植物細(xì)胞大規(guī)模培育的技術(shù)要求： 從工程的角度講必需求進(jìn)一步研討和開發(fā)適

13、宜于植物細(xì)胞生長和次生代謝產(chǎn)物消費(fèi)的生物反響器，建立最正確的控制和調(diào)理系統(tǒng)。 從細(xì)胞生長與培育技術(shù)方面講必需滿足以下3個條件： 1、培育的細(xì)胞在遺傳上應(yīng)是穩(wěn)定的，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物。 2、細(xì)胞生長及生物合成的速度快，在較短的時間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物。 3、代謝產(chǎn)物要在細(xì)胞中積累而不被迅速分解，最好能將其釋放到培育基中。.5.1 技術(shù)道路 (1) 選擇適宜的外植體；誘導(dǎo)疏松愈傷組織； (2) 經(jīng)過含量分析，選擇高產(chǎn)細(xì)胞系 (3) 研討培育條件到達(dá)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)； (4) 建立懸浮細(xì)胞培育、優(yōu)化培育條件 到達(dá)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)； (5) 小試、中試、優(yōu)化培育條件； (6) 大規(guī)模培育； (7) 工業(yè)化消

14、費(fèi)，產(chǎn)品分別，純化。 .5.2 提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法1挑選高產(chǎn)細(xì)胞系 不同植物種類，不同植株及同一植株的不同部位，往往有不同的代謝才干； 經(jīng)過人工誘變改良細(xì)胞系； 經(jīng)過遺傳改良挑選細(xì)胞系。 .云南紅豆杉東北紅豆杉中國紅豆杉南方紅豆杉雜種紅豆杉. 挑選出的高效、高產(chǎn)細(xì)胞株系，有的植物細(xì)胞系其高效、高產(chǎn)性能穩(wěn)定多年，但有的植物細(xì)胞系不穩(wěn)定，因此，還需求定期檢測，更新細(xì)胞株系。.培育基的營養(yǎng)成分一方面要滿足植物細(xì)胞的生物量增長，另一方面要使細(xì)胞能合成和積累次消費(fèi)物。故在生長的第一階段運(yùn)用生長培育基；第二階段運(yùn)用消費(fèi)培育基普通來說添加培育基的N、P和K濃度能促進(jìn)細(xì)胞生長，而適當(dāng)添加糖濃度那么有利于次消費(fèi)物的合成；而激素需根據(jù)實驗確定適于植物細(xì)胞懸浮培育的根底培育基主要是B5和ER 2優(yōu)化培育基 根本培育基+激素+天然復(fù)合物 . 3改善培育條件 對于任何一種細(xì)胞培育，培育條件都要經(jīng)過多次的實驗探求確定。 eg: 在胡蘿卜愈傷組織培育中，光照條件使紫紅色愈傷組織可以生成大量的花箐苷，并且低溫條件下，生成量高。 .4培育基中添加前體物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)次生代謝物質(zhì)是以初生代謝物質(zhì)為原料，經(jīng)過一系列的化學(xué)轉(zhuǎn)化而合成的，