基因工程載體植物基因工程

1、關(guān)于基因工程載體植物基因工程第一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月本章重點掌握的內(nèi)容掌握載體、克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、-互補、插入失活、人工染色體載體的概念。 克隆載體DNA分子具備的條件。 標(biāo)記基因的分類及其作用。 質(zhì)粒克隆載體用途。 -DNA載體的構(gòu)建、類型及其優(yōu)點。 植物表達載體的組成、啟動子的類型等第二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 遺傳物質(zhì) + 載體 重組的DNA分子 引入細胞或生物體內(nèi) 復(fù)制與表達 穩(wěn)定地遺傳給下代 為什么要用到載體？第三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月基因工程流程圖第四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年

2、6月為什么需要載體？ 1）獨立的一個包括啟動子（promoter)、編碼區(qū)（encoding region)和終止子（terminator)的基因，or 組成基因的某個元件，一般是不可以進入受體細胞的； 2）采用理化方法進入細胞后，也不容易在受體細胞內(nèi)維持。第五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月載體的概念載體（vector) 基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細胞進行擴增和表達的工具稱為載體。目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細胞，并在其中維持高效表達，在很大程度上決定于載體 。第六張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月載體的功能載體的功能 運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因的擴增

3、或表達提供必要的條件 為外源基因提供整合能力 第七張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月 載體的要求A、復(fù)制起點：能在受體中復(fù)制；B、選擇標(biāo)記和篩選標(biāo)記；C、限制性內(nèi)切酶切割位點（多克隆位點）；D、載體的大?。涸瓌t上要求載體越小越好；E、適當(dāng)?shù)目截悢?shù)；F、載體的安全性：質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移;G、外源基因的表達：啟動子。第八張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌質(zhì)粒載體 pBR322結(jié)構(gòu)圖 復(fù)制起點 選擇標(biāo)記基因克隆位點克隆位點第九張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月載體的分類按功能分類 克隆載體克隆一個基因或DNA片斷 表達載體用于一個基因的蛋白表達 整合載體把一

4、個基因插入到染色體組中 按來源分類 質(zhì)粒載體 噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒載體 人工染色體載體 第十張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月載體的種類和特征質(zhì)粒受體細胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例 E.coli環(huán)狀 8kbpUC18/19 , pBR322等 噬菌體載體E.coli線狀9 - 24kb EMBL系列， gt系列絲狀噬菌體及噬菌粒載體E.coli環(huán)狀 10 kbM13mp系列粘粒載體載體E.coli環(huán)狀35- 45kbpJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)載體E.coli環(huán)狀300 kb

5、 pBeloBAC11YAC (Yeast Artificial chromosome )載體酵母細胞線性染色體 100 - 2000 kbpYAC4MAC (Mammalian Artificial Chromosome)載體哺乳類細胞線性染色體 1000 kbpCXLamIntWT, pCXLamIntR and pCXLamIntROK病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40 載體，昆蟲 桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞 和細菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV, Ti質(zhì)粒第十一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 克隆載體第十二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、質(zhì)粒載體1.質(zhì)粒

6、的概念 質(zhì)粒（plasmid)是一種存在于細菌或真菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA 分子，可自主復(fù)制和表達。 并不是寄主生長所必需的，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力（帶有抗性基因等） 。 分子量在1-200kb之間 。第十三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、質(zhì)粒載體大腸桿菌的質(zhì)粒第十四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體2.質(zhì)粒的空間構(gòu)型 共價閉合環(huán)狀DNA（Covalent close circular DNA，cccDNA) 呈超螺旋（SC）（super coil） 第十五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體

7、開環(huán)DNA（ open circular， ocDNA） 一條鏈上有一至數(shù)個缺口。 線形DNA （ linear ，LDNA）第十六張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同： SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。 SC OC L 第十八張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體3.質(zhì)粒的基本特性 質(zhì)粒的自主復(fù)制性 質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進行自主復(fù)制。 質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系。根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷

8、貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringent plasmid） (拷貝數(shù)少，為1-5個)和松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（relaxed） (拷貝數(shù)多，可達10-200個拷貝) 因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。 質(zhì)粒 復(fù)制子 拷貝數(shù) pBR322 及其衍生質(zhì)粒 pMB1 1520 pUC 系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒 突變的 pMB1 500700 pSC101 及其衍生質(zhì)粒pSC101 5 ColE1ColE11520第十九張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒的不相容性(incompatibility,又稱質(zhì)粒的不親和性) 兩種質(zhì)粒在同一宿主中不能

9、共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性。具有不相容性的質(zhì)粒組成的群體稱為不相容群，一般具有相同的復(fù)制子。 以大腸桿菌的質(zhì)粒為例： ColE1、pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 pSC101、F、RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 第二十張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性 接合型質(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用）。 非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用。 值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由 mob、tra

10、基因、順式作用原件bom及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點nic決定。第二十一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體Tra protein from conjugative plasmidbom siteMob genemob mRNAMob proteinopen recipient cellhelper plasmid即mob基因的產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的oriT位點，借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物，使非接合質(zhì)粒被動遷移到受體細胞中，這種現(xiàn)象稱為遷移作用(mobilization)。質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性第二十二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、質(zhì)粒載體大腸桿菌接合（conj

11、unction）質(zhì)粒DNA的tra基因E.Coli產(chǎn)生菌毛宿主與受體細胞結(jié)合遺傳物在細胞之間轉(zhuǎn)移（指令）（遷移）第二十三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體攜帶特殊的遺傳標(biāo)記 野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)記基 因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括： 物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物 物質(zhì)合成 抗生素、細菌毒素、有機堿 這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義第二十四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體遺傳標(biāo)記基因 定義:在基因工程中用來篩選導(dǎo)入了重組DNA的細胞的基因。 選擇標(biāo)記基因、篩選標(biāo)記

12、基因標(biāo)記基因的作用 1. 指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞 2. 指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子 第二十五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體遺傳標(biāo)記基因的種類 1. 抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） a. 抗生素抗性基因: Apr ，Tcr ，Cmr，Kanr，G418r，Hygr ，Neor b. 重金屬抗性基因: Cur ，Znr ，Cdr c. 代謝抗性基因: TK，抗除草劑基因 2. 營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子） 主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因， 這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1

13、，URA3，LEU2，HIS4等。 3. 生化標(biāo)記基因 其表達產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ（-半乳糖苷酶）， GUS（葡萄糖苷酸酶），CAT（過氧化氫酶） 第二十六張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體第二十七張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法) 第二十八張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體常用的篩選標(biāo)記基因 -半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZ） 一種能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。 -半乳糖苷酶基因的優(yōu)點: a.催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀 b. lacZ編碼5-端可

14、容許很大的變化而不影響酶活性 c. lacZ和鏈基因的分別表達可使載體小而容量大 第二十九張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體互補（藍白班篩選）野生型大腸桿菌產(chǎn)生的-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍。-半乳糖苷酶缺陷型菌株中編碼-半乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的-半乳糖苷酶失去正常N段一個146個氨基酸的短肽（即肽鏈），從而不具有生物活性，即無法作用于X-gal產(chǎn)生藍色物質(zhì)。用于藍白斑篩選的載體具有一段稱為lacz的基因，lacz中包括：一段-半乳糖苷酶的啟動子；編碼肽鏈的區(qū)段；一

15、個多克隆位點(MCS)。當(dāng)菌體中含有帶lacz的質(zhì)粒后，質(zhì)粒lacz基因編碼的肽鏈和菌株基因組表達的端缺陷的-半乳糖苷酶突變體互補，具有與完整-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成藍色物質(zhì)的能力，這種現(xiàn)象即-互補。操作中，添加IPTG(異丙基硫代-半乳糖苷)以激活lacz中的-半乳糖苷酶的啟動子，在含有X-gal的固體平板培養(yǎng)基中菌落呈現(xiàn)藍色。當(dāng)外源DNA（即目的片斷）與含lacz的載體連接時，會插入進MCS，使肽鏈讀碼框破壞，這種重組質(zhì)粒不再表達肽鏈，將它導(dǎo)入宿主缺陷菌株則無互補作用，不產(chǎn)生活性-半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產(chǎn)生藍色，培養(yǎng)表型即呈現(xiàn)白色菌落。第三十張，PPT共一百

16、六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體 P LacZ LacZ 轉(zhuǎn)錄 翻譯 LacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物第三十一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體lacZ -半乳糖苷酶分解乳糖i P O 調(diào)控蛋白P 大腸桿菌的-半乳糖苷酶基因lacZ系統(tǒng)第三十二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體lacZ -半乳糖苷酶-分解乳糖i P O 調(diào)控蛋白P -肽段分解X-gal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍色誘導(dǎo)劑IPTGa-互補顯色反應(yīng)（藍白斑篩選）-半乳糖苷酶基因lacZ突變體M15 ？第三十三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體X-galX-gal-pe

17、ptideC-terminus of b-galactosiase 第三十四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體互補顯色反應(yīng) 第三十五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體-互補(-complementation) 第三十六張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體常用的篩選標(biāo)記基因 葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 該基因編碼一種可分解各種-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標(biāo)記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。 熒光素酶基因 熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生

18、熒光，若在反應(yīng)中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細菌產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。 發(fā)光蛋白質(zhì)基因 發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍色。 第三十七張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體4.質(zhì)粒的命名原則 人工組建的質(zhì)粒 人工組建的質(zhì)粒的第一個字母是質(zhì)粒英文名字（plasmid）的第一個字符p，用小寫。p后有2個字母是大寫，表示質(zhì)粒的作者和實驗室名稱，再其后為質(zhì)粒的編號。如pBR322，字母p代表質(zhì)粒，BR是構(gòu)建該質(zhì)粒的研究人員的姓名，322代表構(gòu)建的一系質(zhì)粒的編號。 第三十八張

19、，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體 5.質(zhì)粒載體的發(fā)展概況 第一階段（1977年前）天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101, ColE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二階段增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。 第三階段完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達型載體及各種探針型載體。第三十九張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體6.質(zhì)粒載體構(gòu)建 天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷

20、，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進行人工構(gòu)建。 目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的： pSC101 8.8 kb 拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標(biāo)記基因 Tcr ColE1 6.5 kb 拷貝數(shù) 20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因 E1 RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因 Ampr 第四十張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體 第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒, 克隆位點少，Tetr 作為篩選標(biāo)志。 第四十一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月A、刪除不必要的DNA區(qū)域: 盡量縮小質(zhì)粒的分子量

21、，以提高外源DNA片段的裝載量。B、減少限制性酶切點: 缺失突變，限制性酶、核酸外切酶和連接酶的共同作用，質(zhì)粒之間的重組等方法。C、加入易于識別的選擇標(biāo)記：通過質(zhì)粒之間的重組，可以使質(zhì)粒帶有合適的選擇性標(biāo)記。D、安全性能改造：質(zhì)粒載體不能在細菌之間隨便轉(zhuǎn)移。E、改造或加入基因表達的調(diào)控序列：啟動子。質(zhì)粒的改造第四十二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月pBR322:4.3KbApr/TcrPstI/BamHI、SalI/HindIII、EcoRI一、 質(zhì)粒載體第四十三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體7.質(zhì)粒載體的分類 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如

22、下幾類： 高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)1000-3000 擴增基因 低拷貝質(zhì)粒 來自pSC101 拷貝數(shù)小于10 表達某些毒性基因 溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì) 測序質(zhì)粒 含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker 整合質(zhì)粒 裝有整合促進基因及位點 便于外源基因的整合 穿梭質(zhì)粒 裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子 便于基因克隆 表達質(zhì)粒 裝有強化外源基因表達的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件 探針質(zhì)粒 裝有報告基因 便于啟動子等元件的克隆篩選 第四十四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體8.常用質(zhì)粒載體 （1）pBR322 復(fù)制起點 ori：

23、pMB1系列（來源于ColE1）高拷貝型復(fù)制起點 Ampr基因：pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因 Tetr基因：pSC101的Tetr 基因。 長度：4363bp 選擇標(biāo)記：氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。 克隆位點：含有多個克隆位點。 Ampr基因內(nèi)可被Pst I，Pvu I，Sac I切開，而Tetr基因可被BamH I，Hind III切開，通過插入失活篩選重組子。第四十五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體第四十六張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月pBR322質(zhì)粒載體優(yōu)點：第一，具有較小的分子量 4363bp。第二，具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記

24、號。 第三，具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后，每個細胞中可累積10003000個拷貝。一、 質(zhì)粒載體第四十七張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體（2） pUC系列質(zhì)粒載體 在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。其組成如下： 含有pBR322完整的Ampr基因和復(fù)制起始點。 含有大腸桿菌 -半乳糖酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼 -肽鏈的DNA序列，即lacZ基因。 在lacZ基因中靠近5端的一段有MCS區(qū)段，但并不破壞該基因的功能。 pUC18、pUC19 第四十八張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月生命科學(xué)學(xué)院一、 質(zhì)粒載體第四十九張，PPT共一百六十五頁

25、，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點： 具有較小的相對分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，平均每個細胞可達500-700個拷貝。 適用于組織化學(xué)方法檢測重組體，有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補作用，在IPTG誘導(dǎo)和底物X-gal存在下，形成藍色和白色菌落篩選重組體。 具有MCS區(qū)段，便于外源基因的克隆。第五十張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體（3）穿梭質(zhì)粒載體(shuttle vector) ： 這種質(zhì)粒分子上含有兩個親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的選擇性標(biāo)記基因，因此能在兩種不同種屬的受體細胞中復(fù)制并檢測，如大腸桿菌-鏈

26、霉菌穿梭質(zhì)粒、大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒等。第五十一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、質(zhì)粒載體TA克隆載體(補充) 用Taq酶的PCR產(chǎn)物3端加上了一個A。根據(jù)這一特點研制出一種線性質(zhì)粒，其5端突出的T，它們之間可以連接，即TA克隆。 再生TA克隆載體的方法：克隆載體的線性化克隆載體末端補平克隆載體末端加T第五十二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、 質(zhì)粒載體第五十三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體噬菌體（Bacteriophage）即細菌病毒，是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱。其核心是一段DNA(線性)，外圍有一個蛋

27、白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細菌內(nèi)。第五十四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體 噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為： 1.高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細胞； 2.自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增。 第五十五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體(一)噬菌體的生物學(xué)特性 噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體； 噬菌體由外殼包裝蛋白和-DNA組成； DNA在噬菌體中是雙鏈線狀DNA分子，全長 48.5kb，有60多個基因，其中有1/3的區(qū)域是其裂解性生長的非必需區(qū)，這一區(qū)段的缺失，或在此

28、區(qū)段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是噬菌體可作為基因載體的依據(jù) 。 cos位點（cohesive end site): 在DNA兩端各有12nt的5單鏈突出(5-GGGCGGCGACCT-3) ，彼此序列互補。它是包裝時的切割信號。 第五十六張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體噬菌體的生活周期第五十七張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體粘性末端：12bp的互補單鏈 當(dāng)噬菌體進入寄主細胞內(nèi)后, 其粘性末端能通過堿基互補作用, 形成環(huán)狀DNA分子。粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點, 它是包裝蛋白的識別位點。 噬菌體的包裝與DNA特性

29、和其它序列無關(guān), 但對包裝的DNA大小有要求, 包裝范圍大約在36kb-51kb。 第五十八張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體噬菌體作為構(gòu)建載體材料的依據(jù)：噬菌體是一種溫和噬菌體； 能承載比較大的外源DNA片段；在噬菌體分子上有許多限制性核酸酶識別位點，便于多種DNA酶切片段的克隆。第五十九張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體(二)構(gòu)建噬菌體的基本原理 (1)噬菌體的缺陷： 基因組太大（48.5kb）； 酶切點太多，它有5個BamH1位點（GGATCC），6個Bg位點（AGATCT），5個EcoR位點（GAATTC）。 野生型只能接納一定長度的

30、DNA。若相當(dāng)于噬菌體的75-105%，那么只能接納48.5kb5%=2.425kb的DNA。 重組的DNA分子難于直接導(dǎo)入宿主細胞，需在體外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNA。第六十張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體(三)構(gòu)建噬菌體的基本內(nèi)容 構(gòu)建噬菌體克隆載體的基本策略： 切去部分非必須的區(qū)域； 抹去多余的限制性內(nèi)切酶切割位點； 插入可供選擇的標(biāo)記基因； 建立體外包裝系統(tǒng)。第六十一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體選擇標(biāo)記 (1) imm434 imm434基因編碼一種阻止-噬菌體進入裂解循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的-載體進

31、入受體細胞后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，-重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑。 第六十二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體選擇標(biāo)記 (2) lacZ LacZ基因編碼-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍色化合物；而空載體-DNA則產(chǎn)生藍色透明斑。 第六十三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體選擇標(biāo)記 (3) cI基因 cI基因的表達促進噬菌體進入溶原狀態(tài)， cI基因產(chǎn)物活性受到影響會促進噬菌體進入裂解循環(huán)。hfl （high

32、 frequency of lysogenization）高頻溶原突變突變的大腸桿菌 。 第六十四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體(四)噬菌體載體的類型 （1）插入型載體 只有12種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切割位點 篩選標(biāo)記基因：-半乳糖苷酶基因 、cI基因第六十五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體（1）插入型載體 載體長度37kb插入位點體外包裝插入片段大小：0-14kb（5137）插入片段體外包裝第六十六張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體gt10 載體 cI基因內(nèi)有一個EcoR I位點第六十七張，PPT共一百六十

33、五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體(四)噬菌體載體的類型 （2）替換型載體 在其中央部位有一個可以被外源DNA分子取代的DNA片段的克隆載體 。如： EMBL3第六十八張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體第六十九張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體Spi篩選野生型噬菌體在帶有P2原噬菌體的溶原性E.coil的生長會受到限制的表型，稱作Spi+，即對P2噬菌體的干擾敏感。這種生長抑制作用是受噬菌體red和gam這兩個基因編碼的產(chǎn)物控制的。如果噬菌體缺少兩個參與重組的基因red和gam，同時帶有chi位點，并且宿主菌為rec+，則可

34、以在P2溶原性E.coil中生長良好，噬菌體的這種表型稱作Spi-。因此，通過噬菌體載體DNA上的red和gam基因的缺失或替換，可在P2噬菌體溶原性細菌鑒別重組和非重組噬菌體。第七十張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體插入型載體替換型載體red gam第七十一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體(五)常用的噬菌體載體 （一） 半乳糖苷失活插入型載體 （二） 免疫功能失活插入型載體 （三） Charon系列取代型載體 （四） EMBL系列取代型載體 （五） Spi-正選擇取代型載體 （六） ZAP插入型載體 第七十二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作

35、于2022年6月二、噬菌體載體(六)Lambda 噬菌體載體的克隆原理及步驟 第七十三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體(七)-DNA重組分子的體外包裝 噬菌體DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過體外包裝，然后將重組DNA通過噬菌體導(dǎo)入E.coli細胞內(nèi)。 這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組-DNA分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計的。第七十四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體

36、D基因缺失的噬 菌體突變株（D-） E基因缺失的噬 菌體突變株（E-） E proteinD protein重組DNA（裂解物）（裂解物）infectassembleBHB2688-E- 的溶原菌BHB2690-D- 的溶原菌噬菌體的體外包裝系統(tǒng) 第七十五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體-DNA作為載體的優(yōu)點 -DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 -DNA載體的裝載能力為25 kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量 重組-DNA分子的篩選較為方便 重組-DNA分子的提取較為簡便 -DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因 第七十六張，PPT共

37、一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體M13、f1、fd都為絲狀單鏈DNA噬菌體。 優(yōu)越性： 單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復(fù)制形式的 DNA簡稱RF DNA； 2. 不論是RF DNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌； 3. 單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的多寡制約的，不存在包裝限制問題； 4. 容易測定外源DNA片斷的插入取向； 5. 可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。第七十七張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體 M13噬菌體載體 M13噬菌體是一種含單鏈（+）環(huán)狀DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為

38、6.4kb。用作載體時利用其雙鏈狀態(tài)的RF DNA。 這類載體主要用來獲得大量的單鏈DNA片段，主要用來測定DNA序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。第七十八張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體 M13噬菌體的特點 感染Ecoli后，在宿主細胞內(nèi)會形成雙鏈的復(fù)制型DNA （ replication form DNA, RF DNA）?？梢韵筚|(zhì)粒DNA那樣在體外進行純化和操作。 絲狀噬菌體顆粒的大小是根據(jù)其DNA的大小決定的，這一點正好與噬菌體相反，所以M13噬菌體并不存在包裝限制的問題。 第七十九張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于20

39、22年6月二、噬菌體載體 M13噬菌體產(chǎn)生單雙鏈DNA的機制 1、以（+）鏈DNA為摸板，合成互補（）鏈，該雙鏈稱復(fù)制型DNA（RF DNA）。 2、RF DNA在宿主細胞內(nèi)能快速增殖，可增加到每個細胞約200個拷貝。 3、單鏈特異的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合在（+）鏈上，從而阻斷了其互補鏈，即（）鏈的合成，這樣，細胞就會不斷的合成（+）鏈DNA 。 4、游離出來的（+）鏈DNA先與基因V的編碼產(chǎn)物形成特異的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到寄主細胞膜，同時基因V的蛋白質(zhì)從（+）DNA鏈上脫落下來，余下的M13（+）鏈DNA則是從其感染的寄主細胞的細胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。 第八十

40、張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體第八十一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體第八十二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體第八十三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體第八十四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體插入一段lac DNA片段，即帶有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列及其N端頭146個aa編碼信息，宿主F因子攜帶缺失第11-41位氨基酸的lacZ M13mp 載體系列第八十五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月二、噬菌體載體單純以噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建的載

41、體: 裝載量大， 能排斥空載體， 轉(zhuǎn)染效率高, 操作較難， DNA不穩(wěn)定。 單純以質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體: 有天然的抗性選擇標(biāo)記， 操作容易（易于分離和轉(zhuǎn)化）， 較穩(wěn)定, 裝載量小， 轉(zhuǎn)化效率較低； 第八十六張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體 (一)黏粒(cosmid)載體 也稱柯斯質(zhì)粒載體、粘粒。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點、克隆位點、選擇性標(biāo)記以及噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體

42、外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細胞內(nèi)。 第八十七張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體黏粒載體的基本特點 具有噬菌體的特性(體外包裝，高效感染等)； 具有質(zhì)粒載體的特性(易于克隆操作、選擇及高拷貝等)； 具有較高容量（45 kb）的克隆能力； 具有與同源性序列的質(zhì)粒進行重組的能力。 不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細胞，在細胞內(nèi)不能形成噬 菌體顆粒，因而不能形成噬菌斑 。第八十八張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體第八十九張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022

43、年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體應(yīng)用黏粒作載體進行基因克隆的一般程序第九十張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體黏粒載體的克隆原理及步驟 1分離外源DNA片段3545kb 2外源DNA與兩個粘粒相連，且cos方向相同 3體外包裝：在的A蛋白的功能作用下切割cos位點并將其中的DNA包裝到成熟的噬菌體顆粒中去 4感染E.coli：線狀的重組DNA被注入細胞并通過cos位點的環(huán)化，而形成粘粒載體，象質(zhì)粒一樣復(fù)制第九十一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體常用黏粒載體結(jié)構(gòu)圖 79第九十二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、

44、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體缺點：A、多個Cosmid 分子自連，降低陽性率；B、多個DNA分子同時插入，失真。第九十三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體(二) 噬菌粒載體 由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列。 它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點、選擇性標(biāo)記、多克隆位點等，方便DNA的操作，可在細胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點，在輔助噬菌體的存在下，可進行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。 第九十四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體常用的噬菌粒載體pUC118和pUC119 1. 具有較小分子量的共價、閉合、環(huán)形的基

45、因組DNA，可 克隆10kb的外源DNA片段，并易于進行分離與操作； 2. 編碼一個ampr基因作為選擇記號，便于轉(zhuǎn)化子的選擇； 3. 拷貝數(shù)含量高，每個寄主可高達500個； 4. 存在著一個多克隆位點區(qū)； 5.可進行藍白斑篩選；第九十五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體6. 插入的外源基因以融合蛋白質(zhì)的形式表達； 7. 含有質(zhì)粒的復(fù)制起點，克隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)的方式，復(fù)制形成大量的雙鏈DNA分子；8. 帶有一個M13噬菌體的復(fù)制起點，在有輔助噬菌體感染的寄主細胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中； 9. 在pUC118

46、和pUC119這兩個載體中，多克隆位點區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈DNA，另一個則可轉(zhuǎn)錄出負鏈DNA； 10. 可以直接對克隆的DNA片斷進行核苷酸的序列測定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。第九十六張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體第九十七張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體pBluescript噬菌粒載體 基本結(jié)構(gòu)： 1. 在多克隆位點的兩側(cè)，有一對T3和T7噬菌體的啟動子，可以定向指導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)錄活動； 2.同時具有一個單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點和一個來

47、自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點，在不同的情況下，可以采取不同的復(fù)制形式，分別合成單鏈或雙鏈的DNA； 3.編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，供作轉(zhuǎn)化子記號； 4.含有l(wèi)acZ基因，可用Xgal-IPTG組織顯色反應(yīng)法篩選噬菌粒載體。第九十八張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體用于體外轉(zhuǎn)錄pBluescript噬菌粒載體T7T3第九十九張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、人工染色體及其應(yīng)用 人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb 的DNA片段， 此時柯斯質(zhì)粒(45kb)和噬菌粒載體的裝載量也遠遠不能滿足需要。 將細菌接合因子或酵母染

48、色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體， 它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。 第一百張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、人工染色體及其應(yīng)用 人工染色體載體（artificial chromosome vector）:利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動外源DNA片段復(fù)制的載體。 實際上是一種“穿梭”克隆載體，含有質(zhì)粒克隆載體所必備的第一受體(大腸桿菌)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(ori)，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點、端粒和復(fù)制起始位點的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。

49、與其他的克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特點是能容納長達1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。 第一百零一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、人工染色體及其應(yīng)用 (一)酵母人工染色體 酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。 YAC具有自主復(fù)制序列、克隆位點以及可在細菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。可以接受350-400kb的外源DNA片段。 四膜蟲的端粒序列 酵母染色體的復(fù)制子 酵母染色體的著絲粒序列 酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記 大腸桿菌的復(fù)制子 大腸桿菌的選擇標(biāo)記第一百零二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月

50、四、人工染色體及其應(yīng)用(一)酵母人工染色體酵母人工染色體的使用第一百零三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、人工染色體及其應(yīng)用 用pYAC3進行克隆策略如下： 載體用BamHI和SnaBI雙酶切，形成3個片段。 移去BamHI之間的片段，留下另外兩段，每一段的兩端都分別是TEL序列和SnaBI位點。 被克隆的DNA，兩端必須切成平末端(SnaBI是一個平末端內(nèi)切酶，識別TACGTA序列)。 把三者連接起來，形成了人工染色體。 用原生質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法把人工染色體轉(zhuǎn)入釀酒酵母。用作宿主的菌株是雙營養(yǎng)缺陷型Trp1-ura3- ，可以被人工染色體上的篩選標(biāo)記基因恢復(fù)成Trp1+ura3+

51、。 在基本培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，只有含有結(jié)構(gòu)正確的人工染色體的轉(zhuǎn)化體可以生存。 如果染色體構(gòu)建錯誤，如在被克隆的DNA兩側(cè)連接了相同的兩段載體DNA片段，則因缺少一種篩選標(biāo)記，使得轉(zhuǎn)化體不能在基本成分培養(yǎng)基上存活。 外源DNA的是否插入，可由SUP4的插入失活判斷，即可以很簡單地由菌落的顏色看出：紅色的菌落是重組體，而白色的菌落則不是。第一百零四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、人工染色體及其應(yīng)用(一)酵母人工染色體酵母人工染色體的使用pYAC3第一百零五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、人工染色體及其應(yīng)用 (二)細菌人工染色體 細菌人工染色體(bacterial

52、artificial chromosome，BAC)通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 - 300 kb之間。 pBACs主要適用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu) 構(gòu)建動植物基因文庫 缺點：會出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不 穩(wěn)定，導(dǎo)致克隆DNA部分的缺失或重排。第一百零六張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月四、人工染色體及其應(yīng)用 (三)P1噬菌體人工染色體 結(jié)合了 P1 載體和 BAC 載體的最佳特性，包括陽性選擇標(biāo)記 sacB 及噬菌體 P1 的質(zhì)粒復(fù)制子和裂解性復(fù)制子。 sacB：蔗糖果聚糖酶 第一百零七張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2

53、022年6月 第二節(jié) 表達載體第一百零八張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體克隆載體（cloning vector）：主要是對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復(fù)制子即可； 表達載體（expression vector）：能使目的基因在宿主細胞中表達的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強啟動子； 穿梭載體（shuttle vector）：這類載體可以在原核細胞中復(fù)制，也可在真核細胞中擴增和表達。 第一百零九張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體第一百一十張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體表達載體構(gòu)建

54、的一般原則 1.閱讀框架與外源基因高效表達 2.啟動子與外源基因高效表達 3.轉(zhuǎn)錄的有效延伸和終止與外源基因高效表達 4.有效的翻譯起始與外源基因高效表達 5.終止密碼子選擇與外源基因高效表達 6.外源蛋白的穩(wěn)定性與外源基因高效表達第一百一十一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體真核基因在原核細胞中表達，載體必須具備的條件： 載體能夠獨立復(fù)制，具有復(fù)制起點。 應(yīng)具有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆 鑒定和篩選。 應(yīng)具有很強的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。 應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進行轉(zhuǎn)錄。應(yīng)具有很強的終止子，只轉(zhuǎn)錄

55、克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD(Shine-Dalgarnosequence)序列，以便轉(zhuǎn)錄后順利翻譯。第一百一十二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體大腸桿菌表達載體的基本成分第一百一十三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體啟動子：影響表達效率的主要因素之一是啟動子的強弱。 常見啟動子見下表。 啟動子的強弱取決于啟動子本身的序列，尤其是10和35區(qū)的堿基組成及彼此的間隔長度，同時也與啟動子和外源基因轉(zhuǎn)錄起始位點間的距離有很大關(guān)系。第一百一十四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年

56、6月第二節(jié) 表達載體啟動子-35 區(qū)序列-10 區(qū)序列 P lacT T T A C A T A T A A T P trp T T G A C AT T A A C T P tacT T G A C AT A T A A T P traA T A G A C A T A A T G T P lLT T G A C A G A T A C T P recAT T G A T A T A T A A T 啟動子第一百一十五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體 最佳啟動子具備的條件： 第一 必須是強啟動子 第二 啟動子應(yīng)是誘導(dǎo)型的（熱或化學(xué)誘導(dǎo)）第一百一十六張，PPT共一

57、百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達。終止子 強終止子的選擇與使用 目前外源基因表達質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA 操縱子上的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌體 DNA 上的 Tf。 對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用。第一百一十七張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體 外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與 mRNA 的翻譯起

58、始效率密切相關(guān)。 大腸桿菌細胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS） 核糖體結(jié)合位點第一百一十八張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個部分： 位于翻譯起始密碼子上游的 68 個核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3 端區(qū)域 3 AUUCCUCC 5 并與之專一性結(jié)合，將mRNA 定位于核糖體上，從而啟動翻譯； 翻譯

59、起始密碼子 大腸桿菌絕大部分基因以 AUG 作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作為翻譯起始密碼子 ； SD 序列與翻譯起始密碼子之間的堿基組成 基因編碼區(qū) 5 端若干密碼子的堿基序列核糖體結(jié)合位點第一百一十九張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體第一百二十張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體 不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性。密碼子生物體對密碼子的偏愛性密碼子偏愛性對外源基因表達的影響 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大的差異性，因此外源基

60、因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。 構(gòu)建Ecoli.表達載體時要考慮所表達基因的種類和性質(zhì)，或?qū)ν庠椿虻膲A基進行適當(dāng)置換，或?qū)寺≥d體上的調(diào)控序列進行適當(dāng)調(diào)整。第一百二十一張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體第一百二十二張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體第一百二十三張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體第一百二十四張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 表達載體第一百二十五張，PPT共一百六十五頁，創(chuàng)作于2022年6月一、質(zhì)粒表達載體(一)原核表達載體 適用