基因重組技術(shù)生產(chǎn)胰島素

1、關(guān)于基因重組技術(shù)生產(chǎn)胰島素第一張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第七章 克隆基因的表達(dá)第二張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因表達(dá)載體重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞在宿主細(xì)胞中 表達(dá)出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞或真核細(xì)胞?？寺』虻谋磉_(dá)：第三張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)植物生物反應(yīng)器常見(jiàn)表達(dá)系統(tǒng)的類(lèi)型第五張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月用原核生物作宿

2、主A dividing E. coli 第一節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)原核或噬菌體啟動(dòng)子MCSSD序列終止子第六張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月識(shí)別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所有的RNA合成。很多功能上相關(guān)的基因前后相連成串，由一個(gè)共同的控制區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的控制。一、原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)2. 以操縱子為單位1. 只有一種RNA聚合酶第七張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進(jìn)行。第八張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4. 不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)5. 調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上位于mRNA的起始密碼AUG的上游510個(gè)堿基處，同核糖體16S rRNA3

3、末端序列互補(bǔ)，幫助從起始AUG處開(kāi)始翻譯 。6. mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有SD序列Shine-Dalgarno（SD）sequence:第九張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 外源基因不能帶有內(nèi)含子2. 一般用cDNA，不能直接用真核基因組DNA3. 必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和 SD序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)4. 利用宿主細(xì)胞的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)對(duì)宿主菌的毒害為何？二、原核表達(dá)系統(tǒng)的注意事項(xiàng)第十張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、原核生物基因表達(dá)的調(diào)控大腸桿菌基因表達(dá)載體基本結(jié)構(gòu)特征第十一張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月是

4、DNA上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。 大腸桿菌的所有啟動(dòng)子中都有兩段一致順序（consensus sequence）。 1. 啟動(dòng)子TTGACA TATAAT 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)17bp5 核糖體結(jié)合位點(diǎn)-35 Box 和 -10 Box第十二張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 核糖體結(jié)合位點(diǎn)（ RBS）Shine-Dalgarno（SD） sequence翻譯起始階段，與核糖體16sRNA的3端相互作用，正確定位起始密碼子SD 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCASD序列距離AUG的距離影響翻譯第十三張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3.

5、 轉(zhuǎn)錄終止子 在表達(dá)載體克隆位點(diǎn)的下游一般設(shè)計(jì)一段轉(zhuǎn)錄終止子，mRNA轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。第十四張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)部位包涵體（inclusion body） 是存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。1. 細(xì)胞質(zhì)中表達(dá) 第十五張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人生長(zhǎng)激素（human growth hormone, hGH）。例： 使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細(xì)胞回收的蛋白生物活性差。 優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)第十六張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月周質(zhì)（periplasm） 革蘭氏陰性菌位于內(nèi)膜和

6、外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。優(yōu)點(diǎn)：2. 周質(zhì)中表達(dá) 容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。第十七張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月由于需要穿過(guò)兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。用溶血素基因構(gòu)建分泌性融合蛋白 使在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的外源蛋白分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中?；蚺c細(xì)菌素釋放蛋白共表達(dá)3. 胞外表達(dá)第十八張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十九張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）一致順序1. 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響五、影響外源基因表達(dá)效率的因素TTGACA TATAAT 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)17bp5 核糖體結(jié)合位點(diǎn)-35 Box 和 -

7、10 Box第二十張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 （2）-35區(qū)與-10區(qū)之間的距離間隔為17bp時(shí)，啟動(dòng)子最強(qiáng)。（3）-35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序越接近一致順序，啟動(dòng)子越強(qiáng)。5-TTGACA TATAAT 一致順序lactrpPL recAtac Itac II5-TTTACA TATGTT 5-TTGACA TTAACT 5-TTGACA GATACT 5-TTGATA TATAAT 5-TTGACA TATAAT 5-TTGACA TTTAAT -35box-10box第二十一張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）SD序列2. 翻譯起始序列對(duì)表達(dá)效率的影響 翻譯起始階段

8、，與核糖體16sRNA的3端相互作用，正確定位起始密碼子SD 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCA SD序列距離AUG的距離影響翻譯第二十二張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5-UAAGGAGG-3 如果是A（T），翻譯效率最高；如果是G（C），效率只有50%或25%。 mRNA-rRNA互補(bǔ)區(qū)域長(zhǎng)短影響基因的翻譯5-AGGAGGU-3 ？5-AAGGA-3 SD序列后面的4個(gè)堿基第二十三張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月AUG左側(cè)的三個(gè)堿基也有影響 （2）起始密碼AUGAUG左側(cè)如果是UAU或CUU時(shí)，最為有效；AUG右側(cè)的三個(gè)堿基也有影響。-半乳糖苷酶的m

9、RNA中：是UUC、UCA或AGG時(shí)下降20倍。第二十四張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 啟動(dòng)子與外源基因之間的距離第二十五張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會(huì)轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費(fèi)資源和能量、不會(huì)干擾正常表達(dá)。 增加載體的拷貝數(shù)會(huì)增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目，增加表達(dá)效率。4. 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)表達(dá)效率的影響5. 載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響6. 外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對(duì)表達(dá)效率的影響但過(guò)度的外源基因的表達(dá)會(huì)影響宿主的正常生長(zhǎng)第二十六張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)錄水平的優(yōu)化（1）使用強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子（2）強(qiáng)終止子，或?qū)蓚€(gè)終

10、止子串聯(lián)（3）提高mRNA的穩(wěn)定性 如：在外源基因的下游插入“重復(fù)性基因外回文序列六、提高表達(dá)水平常用的方法第二十七張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 翻譯水平的優(yōu)化（1）優(yōu)化翻譯起始區(qū) 起始密碼子ATG mRNA-rRNA互補(bǔ)區(qū)域長(zhǎng)短， SD序列距離AUG的距離，及堿基種類(lèi) 翻譯增強(qiáng)子第二十八張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）翻譯的終止 三個(gè)終止密碼子，防止核糖體跳躍 終止密碼子后的核苷酸類(lèi)型，如UAAU為大腸桿菌最有效的翻譯終止序列。（3）密碼子的選擇 受體菌中共表達(dá)稀有密碼子tRNA基因 將稀有密碼子改為偏愛(ài)密碼子第二十九張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1

11、）表達(dá)分泌蛋白 細(xì)胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”：蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過(guò)內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中。 “分泌”：蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過(guò)內(nèi)膜到周間質(zhì)中。3. 提高目的產(chǎn)物穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解。第三十張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。 大腸桿菌的htp R基因突變也減少蛋白酶的降解作用。 T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶?？砂裵in增加到載體上。（2） 使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解 減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。第三十一張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）強(qiáng)啟動(dòng)子提高轉(zhuǎn)錄效率；（2）使用高拷貝表達(dá)載體。 4.

12、 質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加mRNA數(shù)量，提高核糖體與mRNA的結(jié)合速度宿主大量生長(zhǎng)后，誘導(dǎo)載體質(zhì)粒復(fù)制，增加拷貝數(shù)宿主大量生長(zhǎng)時(shí)，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制可調(diào)控的誘導(dǎo)型復(fù)制子第三十二張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）培養(yǎng)基（2）環(huán)境因素（3）誘導(dǎo)時(shí)間和劑量 5. 宿主菌的選擇表達(dá)載體與宿主相互匹配6. 培養(yǎng)條件優(yōu)化第三十三張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、缺乏翻譯后蛋白質(zhì)的加工修飾系統(tǒng)，如糖基化、氨基酸修飾等。2、原核表達(dá)外源蛋白常以包涵體形式存在，必須經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性處理才能獲得有生物活性的蛋白，并且其表達(dá)量非常低。七、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷第三十四張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月

13、4、原核細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，無(wú)法識(shí)別內(nèi)含子，故原核細(xì)胞無(wú)法表達(dá)沒(méi)有加工過(guò)的真核基因組。5、重組原核細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的毒素難以排除，污染表達(dá)產(chǎn)物，影響產(chǎn)品純度。3、原核細(xì)胞中表達(dá)的真核蛋白不穩(wěn)定，容易被細(xì)菌蛋白酶降解。七、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷第三十五張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成2. 人胰島素的生產(chǎn)方法3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建七、利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素第三十六張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 胰島素的結(jié)構(gòu)及其生物合成SSSSCNSSB 肽（30）C 肽（31）A 肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)的特異

14、性肽酶NC信號(hào)肽B 肽C 肽A 肽信號(hào)肽酶第三十七張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 人胰島素的生產(chǎn)方法（1）直接提取法制人胰島素迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：早期人的胰島素是從人的胰臟中直接分離純化的，由于原料供應(yīng)的限制，其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足日益增多的糖尿病人的臨床需求。第三十八張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）化學(xué)合成法制人胰島素 根據(jù)人胰島素A鏈和B鏈的序列，由單個(gè)氨基酸從頭合成。這條化學(xué)全合成的路線(xiàn)從技術(shù)上來(lái)說(shuō)是能夠做到的，但其生產(chǎn)成本奇高，從而也限制了產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用。2. 人胰島素的生產(chǎn)方法迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：第三十九張，PPT共

15、八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）化學(xué)轉(zhuǎn)型法制人胰島素 豬的胰島素可從原料豐富的豬胰臟中提取獲得，而且豬胰島素與人胰島素只在B鏈的C末端有一個(gè)氨基酸的差異，豬的為Ala，人的為T(mén)hr，因此將豬胰島素在體外酶促轉(zhuǎn)化為人胰島素不失為一種選擇。2. 人胰島素的生產(chǎn)方法迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：第四十張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 人胰島素的生產(chǎn)方法迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法： 上述思路的技術(shù)路線(xiàn)是：在pH為6-7的有機(jī)相中使胰蛋白酶催化其逆反應(yīng)，該酶在過(guò)量的蘇氨酸叔丁酯的存在下，將豬胰島素B鏈C末端的丙氨酸交換下來(lái)，所形成的人胰島素叔丁酯再用三氯乙酸脫去叔

16、丁酯基團(tuán)，最終獲得人胰島素。該過(guò)程的總轉(zhuǎn)化率為60%，但工藝路線(xiàn)耗時(shí)，分離純化操作復(fù)雜，產(chǎn)品的價(jià)格不菲。（3）化學(xué)轉(zhuǎn)型法制人胰島素第四十一張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 人胰島素的生產(chǎn)方法迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法： 1982年，美國(guó)Ely LiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。1987年，Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。（4）基因工程法制人胰島素第四十二張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 上述由基因工程菌合成的重組人胰島素在體外胰島素受體結(jié)合性能、淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的應(yīng)答能力、降血糖作用、

17、血漿藥代動(dòng)力學(xué)等指標(biāo)上均與天然胰島素沒(méi)有任何區(qū)別，而且還具有無(wú)免疫原性、注射吸收迅速等優(yōu)點(diǎn)，充分展示了基因工程在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的巨大潛力。2. 人胰島素的生產(chǎn)方法迄今為止，有四種大規(guī)模生產(chǎn)人胰島素的方法：（4）基因工程法制人胰島素第四十三張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建（1）A鏈和B鏈分別表達(dá)法化學(xué)合成:A、B鏈的編碼序列第四十四張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線(xiàn)：（1）A鏈和B鏈分別表達(dá)法第四十五張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)： 由于A鏈和B鏈上共存在六個(gè)半胱氨酸殘基，體外二硫鍵的正確配對(duì)率較低

18、，通常只有10% - 20%，因此采用這條工藝路線(xiàn)生產(chǎn)的重組人胰島素每克成本高達(dá)100美元以上。 為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，美國(guó)Ely LiLi公司隨后又建立了第二條生產(chǎn)重組人胰島素的工藝路線(xiàn)。（1）A鏈和B鏈分別表達(dá)法第四十六張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）人胰島素原表達(dá)法3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建第四十七張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）人胰島素原表達(dá)法表達(dá)產(chǎn)物的后處理路線(xiàn)：第四十八張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二硫鍵的正確配對(duì)率相應(yīng)提高，折疊率高達(dá)80%以上。雖然這條工藝路線(xiàn)并不比AB鏈分別表達(dá)法更為簡(jiǎn)捷，而且還要使用兩種高純度的酶制劑，但

19、理想的折疊率在很大程度上彌補(bǔ)了工藝繁瑣的缺陷，使得每克最終產(chǎn)品的成本僅50美元。目前美國(guó)Ely LiLi公司采用此工藝年產(chǎn)十幾噸的重組人胰島素。（2）人胰島素原表達(dá)法生產(chǎn)技術(shù)的評(píng)價(jià)：第四十九張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）A鏈和B鏈同時(shí)表達(dá)法3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建第五十張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（4）分泌型重組人胰島素表達(dá)法 上述三種重組大腸桿菌的構(gòu)建路線(xiàn)均采用胰島素或胰島素原編碼序列與大腸桿菌b-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所產(chǎn)生的融合型重組蛋白表達(dá)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但不能分泌，只要以包涵體的形式存在于胞質(zhì)中。3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建

20、第五十一張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 一種能促進(jìn)融合蛋白分泌的工程菌構(gòu)建策略，是將胰島素或胰島素原編碼序列與b-內(nèi)酰胺酶基因拼接，b-內(nèi)酰胺酶通常能被大腸桿菌分泌到胞外。由此獲得的工程菌同時(shí)具備了穩(wěn)定高效表達(dá)可分泌型融合蛋白的優(yōu)良特性，為胰島素的后續(xù)分離純化工序減輕了負(fù)擔(dān)。（4）分泌型重組人胰島素表達(dá)法3. 重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建第五十二張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)酵母菌、植物原生質(zhì)體、動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞等。真核或病毒啟動(dòng)子MCSPolyA信號(hào)終止子外源基因第五十三張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、真核生物表達(dá)的優(yōu)越性和

21、必要性1、真核生物具有轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)，可識(shí)別并刪除基因中的內(nèi)含子，剪切加工為成熟mRNA2、具備完善的翻譯后加工系統(tǒng)，可進(jìn)行糖基化、乙?；刃揎?，使蛋白形成正確的天然構(gòu)型，因而真核生物表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白更接近天然狀態(tài)，有利于其功能、生物活性的研究。第五十四張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、某些真核細(xì)胞可將基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中，簡(jiǎn)化了純化工藝，降低了生產(chǎn)成本。4、另外，真核生物表達(dá)的調(diào)控方式非常復(fù)雜，有助于我們深入了解基因調(diào)控機(jī)制。一、真核生物表達(dá)的優(yōu)越性和必要性第五十五張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一） 外源基因在酵母中表達(dá)（二）植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（三）昆蟲(chóng)培養(yǎng)細(xì)

22、胞表達(dá)系統(tǒng)（四） 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)二、真核生物表達(dá)系統(tǒng)第五十六張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（一）外源基因在酵母中表達(dá)酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)的一般過(guò)程在啤酒酵母中表達(dá)的重組蛋白廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第五十七張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1. 酵母菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢(shì)全基因組測(cè)序，基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)便；具有原核細(xì)菌無(wú)法比擬的真核蛋白翻譯后加工系統(tǒng)；已經(jīng)分離出很強(qiáng)的啟動(dòng)子；能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中；生長(zhǎng)迅速、大規(guī)模發(fā)酵歷史悠久、技術(shù)成熟、工藝簡(jiǎn)單、成本低廉；不含有特異性的病毒、不產(chǎn)內(nèi)毒素,美國(guó)F

23、DA認(rèn)定為安全的基因工程受體系統(tǒng)。第五十八張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2 PEG整合到染色體上或獨(dú)立在酵母細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化Ura3+營(yíng)養(yǎng)缺陷型 培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子克隆生長(zhǎng)帶有目的基因的重組載體鑒定克隆發(fā)酵表達(dá)外源基因產(chǎn)物分離、純化2. 酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)的一般過(guò)程 第五十九張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月將目的基因克隆至載體1. 基因及載體分別用限制酶切割；2. 回收切割的基因和載體，然后用T4 DNA連接酶連接；3. 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌受體菌；4. 提取重組質(zhì)粒DNA，酶切鑒定重組質(zhì)粒，篩選出陽(yáng)性重組菌株。第六十張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2

24、022年6月HIV-1抗原丙肝病毒蛋白診斷試劑HIV-1外殼蛋白瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白乙肝病毒表面抗原疫苗名稱(chēng)種類(lèi)凝血因子VIIIa1抗胰蛋白酶 集落刺激因子成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子胰島素前體血小板源生長(zhǎng)因子類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子胰島素上皮生長(zhǎng)因子人類(lèi)治療用蛋白藥物3. 在啤酒酵母中表達(dá)的重組蛋白第六十一張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4. 廣泛用于外源基因表達(dá)的酵母宿主菌酵母屬 如釀酒酵母克魯維酵母屬 如乳酸克魯維酵母畢赤酵母屬 如巴斯德畢赤酵母裂殖酵母屬 如非洲酒裂殖酵母漢遜酵母屬 如多態(tài)漢遜酵母 其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡， 但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想。第六十二張，PP

25、T共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月5. 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗（1）乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)蛋白包裹的雙鏈DNA病毒，具有感染力的病毒顆粒呈球面狀，直徑為42 nm，基因組僅為3.2 kb。病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽。顆粒內(nèi)的蛋白成份包括核心抗原（ HBcAg ）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。第六十三張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的22nm的空殼亞病毒顆粒，其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白：S、M、L多肽。5. 利用重組酵母生產(chǎn)乙

26、肝疫苗第六十四張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因5. 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第六十五張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來(lái)的。雖然這種質(zhì)膜來(lái)源的疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。（3）傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備5. 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第六十六張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（4）產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母 20世紀(jì)80年代開(kāi)始選擇釀酒酵母表達(dá)重組HBsAg，將S多肽的編碼置于ADH1啟動(dòng)子控制下，轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活

27、性的重組蛋白，它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在，平均顆粒直徑為 22 nm，其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中的病毒顆粒相同。5. 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第六十七張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 目前，由釀酒酵母生產(chǎn)的重組HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化，重組產(chǎn)物的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的1%2%。進(jìn)一步的研究表明，M多肽和L多肽對(duì)S型疫苗具有顯著的增效作用，由三者（或兩者）構(gòu)成的復(fù)合型乙肝疫苗還可以誘導(dǎo)那些對(duì)S抗原缺乏響應(yīng)的人群的免疫反應(yīng)。（4）產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母5. 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第六十八張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（5）產(chǎn)乙肝

28、表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母第六十九張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月重組菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)HBsAg，最終S蛋白的產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞可溶性蛋白總量的23%，在大規(guī)模的生產(chǎn)過(guò)程中，巴斯德畢赤酵母工程菌在一個(gè)240L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，最終可獲得90克 22nm的HBsAg顆粒，足夠制成900萬(wàn)份乙肝疫苗。（5）產(chǎn)乙肝表面抗原的重組巴斯德畢赤酵母5. 利用重組酵母生產(chǎn)乙肝疫苗第七十張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1. 植物受體系統(tǒng)的特點(diǎn)（1）細(xì)胞具有全能性（2）光合作用，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低（3）表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性和生物活性（4）靈活性及實(shí)用性強(qiáng)（5）穩(wěn)定的外植體來(lái)源第七十一張，PPT共八十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2. 在植物品種改良中的應(yīng)用（1）控制果實(shí)成熟 乙烯由S-腺苷甲硫氨酸經(jīng)氨基環(huán)丙烷羧酸合成酶和乙烯合成酶催化裂解而成。（2）抗病蟲(chóng)害的轉(zhuǎn)基因植物 蘇云金芽孢桿菌的BT基因、蛋白酶抑制劑基因、凝集素基因、脂肪氧化酶基因、幾丁質(zhì)酶基因、蝎毒素、蜘蛛毒素基因等40多個(gè)。 第七十二張，