《生物制藥》課程實(shí)驗(yàn)大綱講解學(xué)習(xí)

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。生物制藥課程實(shí)驗(yàn)大綱-生物制藥課程實(shí)驗(yàn)大綱編號(hào)：1300901課程名稱(chēng)：生物技術(shù)制藥英文名稱(chēng)：BiologicalPharmaceuticalTechnology實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)名稱(chēng)：生物制藥實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)一、學(xué)時(shí)學(xué)分總學(xué)時(shí)：32學(xué)分：2實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)：8二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋菊n程實(shí)驗(yàn)的目的是使學(xué)生掌握生物技術(shù)制藥中的基因工程制藥、抗體制藥、細(xì)胞工程制藥、酶工程制藥、微生物工程制藥的基本原理、主要方法和技術(shù)，從而使學(xué)生能夠?qū)⒗硇灾R(shí)與感性認(rèn)識(shí)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，在實(shí)驗(yàn)中更深地理解基礎(chǔ)理論，提高學(xué)生的綜合能力與創(chuàng)新意識(shí)以及分析問(wèn)題和

2、解決問(wèn)題的能力。同時(shí)通過(guò)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力，實(shí)事求是，嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度，以及勤儉節(jié)約、愛(ài)護(hù)公物的良好作風(fēng)。三、實(shí)驗(yàn)基本原理純培養(yǎng)技術(shù)、無(wú)菌操作技術(shù)、分子生物學(xué)基本原理及技術(shù)、免疫學(xué)原理及技術(shù)、細(xì)胞工程原理及技術(shù)、蛋白質(zhì)工程原理。四、實(shí)驗(yàn)基本要求在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的安排上，注意使學(xué)生加深對(duì)生物制藥工藝基本理論的理解。實(shí)驗(yàn)的難易程度適中，嚴(yán)謹(jǐn)全面。根據(jù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)完成課內(nèi)實(shí)驗(yàn)任務(wù)，客觀認(rèn)真填寫(xiě)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行結(jié)果分析、每次實(shí)驗(yàn)及時(shí)上交實(shí)驗(yàn)報(bào)告。五、考核與報(bào)告實(shí)驗(yàn)考核以平時(shí)實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)報(bào)告、實(shí)驗(yàn)態(tài)度、實(shí)驗(yàn)操作及實(shí)驗(yàn)處理幾部分組成，占該門(mén)課程成績(jī)30，實(shí)驗(yàn)報(bào)告按實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)提供的統(tǒng)一格

3、式進(jìn)行書(shū)寫(xiě)。六、主要儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱、20W紫外燈、紅燈、血球記數(shù)板、攪拌器、高速冷凍離心機(jī)、冷凍干燥箱、真空干燥箱、高壓滅菌裝置、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、冰箱、液氮罐、精密天平、微量加樣器、烤箱、細(xì)菌過(guò)濾器、10L氣升式發(fā)酵罐、搖床、顯微鏡（帶油鏡）、紫外及可見(jiàn)光分光光度計(jì)、電泳儀、pH計(jì)等。七、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目與內(nèi)容提要序號(hào)實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)內(nèi)容提要每組人數(shù)實(shí)驗(yàn)時(shí)數(shù)實(shí)驗(yàn)要求實(shí)驗(yàn)類(lèi)別備注01甲甲殼質(zhì)、殼聚糖的制備采用蝦殼做原料，制備甲殼質(zhì)和殼聚糖34選開(kāi)驗(yàn)證02液體深層發(fā)酵生產(chǎn)抗生素學(xué)習(xí)微生物制藥的液體深層發(fā)酵技術(shù)，掌握抗生素效價(jià)的檢測(cè)及發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定34選開(kāi)綜合03抗生素的分離和鑒定（薄層層析法）采用薄

4、層層析法分離各種抗生素（如鏈霉素、卡那霉素等），以枯草芽孢桿菌作為生物顯影菌株確定斑點(diǎn)位置，求得Rf值，進(jìn)行鑒定。34必開(kāi)綜合04植物細(xì)胞/組織培養(yǎng)與細(xì)胞活性鑒定采用無(wú)菌操作的方法，培養(yǎng)植物愈傷組織（MS培養(yǎng)基），和采用液體懸浮培養(yǎng)的方法培養(yǎng)植物懸浮細(xì)胞，掌握鑒定細(xì)胞死活的方法。34選開(kāi)驗(yàn)證八、適用專(zhuān)業(yè)生物技術(shù)九、實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)生物與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)一甲殼質(zhì)、殼聚糖的制備【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹苛私庵苽浼讱べ|(zhì)、殼聚糖的工藝流程；掌握甲殼質(zhì)的提取、制備原理及殼聚糖的檢測(cè)方法。【實(shí)驗(yàn)原理】甲殼質(zhì)存在于甲殼類(lèi)動(dòng)物(如蝦、蟹)的外殼，昆蟲(chóng)表皮，軟體動(dòng)物(如貝類(lèi)、烏賊)的器官、菌類(lèi)(如菇類(lèi)、霉菌)的細(xì)胞壁。自然界每

5、年合成量高達(dá)100億噸，僅次于植物纖維素。甲殼質(zhì)是1823年法國(guó)科學(xué)家Odier首次從蟹殼中提取出來(lái)的，由于甲殼質(zhì)的性質(zhì)非常穩(wěn)定，溶解性很差，限制了它的應(yīng)用。經(jīng)一個(gè)多世紀(jì)世界各地科學(xué)家對(duì)它在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行改良、修飾，并開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究，它的衍生物殼聚糖在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜產(chǎn)、漁業(yè)、食品、化妝品及醫(yī)藥行業(yè)上得到廣泛應(yīng)用，尤其是近十多年來(lái)，殼聚糖的動(dòng)物試驗(yàn)及臨床觀察得到科學(xué)家們的肯定，譽(yù)為人類(lèi)第六生活要素(蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)和殼聚糖)。是一種功能性食品。從蝦殼提取甲殼質(zhì)，工藝主要是將蝦殼的成份分離，蝦殼中含有無(wú)機(jī)鹽(主要為碳酸鈣)蛋白質(zhì)和甲殼質(zhì)。利用碳酸鈣能溶于鹽酸的機(jī)理，將其離析。蛋白質(zhì)在堿性條件

6、下能被水解生成短肽及氨基酸，它們能溶于水，與甲殼質(zhì)分離。本實(shí)驗(yàn)首先采用鹽酸浸泡蝦殼除去鈣質(zhì)，接著利用氫氧化鈉煮沸除去蛋白，之后水洗；用高錳酸鉀與硝酸氧化脫色干燥得白色制品為甲殼質(zhì)。甲殼質(zhì)在堿性條件下脫去乙酰基，生成聚胺糖。工業(yè)上很難100脫去乙酰基，所以工業(yè)制得的實(shí)際上是甲殼質(zhì)和聚葡胺糖兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元的結(jié)合，稱(chēng)為殼聚糖。殼聚糖結(jié)構(gòu)中有胺基(NH2)，具堿性，因此，它能溶于很多酸，如硫酸、鹽酸、胃酸等，可以用游離氨基含量的來(lái)檢測(cè)乙?；拿撊コ潭取！緝x器、材料與試劑】1實(shí)驗(yàn)材料與試劑蝦殼；34%的氫氧化鈉；50的氫氧化鈉；56%的鹽酸；5%的高錳酸鉀；1%的硝酸；1mol/L的鹽酸；0.1mol/L

7、的氫氧化鈉；溴酚蘭指示劑。2儀器設(shè)備燒杯1000mL；三角瓶500mL；三角瓶100mL；大試管夾；水浴鍋；烘箱；堿式滴定管；鐵架臺(tái)；磁力攪拌器；電爐等?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1蝦殼處理：將蝦殼洗凈，粉碎，稱(chēng)重。2甲殼質(zhì)制備：用56%的鹽酸于室溫（20）浸泡蝦殼24小時(shí)，不斷攪拌。鹽酸體積（ml）與蝦克重量（g）比為10（V/W=10）；取沉淀水洗3次后加入34%的氫氧化鈉（V/W=10）煮沸12小時(shí)，取沉淀水洗；加0.5%的高錳酸鉀攪拌反應(yīng)約1小時(shí)，沉淀水洗;再加入1%的硝酸于6070反應(yīng)3040分鐘，產(chǎn)物水洗、干燥、稱(chēng)重。3殼聚糖的制備：于燒瓶中加入上述甲殼質(zhì)10克再加入90-100ml的濃度為10

8、的NaOH，沸水浴反應(yīng)30-40分鐘后，停止反應(yīng)干燥稱(chēng)重。4游離氨基含量的測(cè)定：方法1：精確稱(chēng)取殼聚糖0.30克，置于20ml的錐瓶中，移取30ml0.1mol/L的鹽酸溶液，室溫下溶解（若粘度太大可加少許蒸餾水）。加入2滴溴酚蘭指示劑，以0.1mol/L的氫氧化鈉溶液滴定至紫色，平行滴定三份，按下式計(jì)算游離氨基含量：方法2：采用分光光度法檢測(cè)殼聚糖的含量，檢測(cè)殼聚糖的含量/純度（選做）?！窘Y(jié)果與分析】計(jì)算甲殼質(zhì)的提取率和游離氨基含量并分析與理論值之間的差異。【思考題】甲殼質(zhì)的提取過(guò)程中用了哪些試劑，各起到了什么作用？實(shí)驗(yàn)二液體發(fā)酵法生產(chǎn)鏈霉素（選做）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)液體發(fā)酵的方法；學(xué)習(xí)鏈霉素

9、的發(fā)酵方法及抗生素的檢測(cè)和鑒定方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】瓦克斯曼（SelmanA.Waksman）于1943年分離到一株灰色鏈霉菌（Streptomycesgriseus），能產(chǎn)生對(duì)革藍(lán)氏陽(yáng)性細(xì)菌和藍(lán)氏陰性細(xì)菌都有抗菌作用的一種新的抗生素鏈霉素。鏈霉素和其它抗生素一樣氏微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。鏈霉素屬于氨基糖苷類(lèi)抗生素?；疑溍咕谙率鰲l件下產(chǎn)生鏈霉素。對(duì)細(xì)胞足夠的供氧；存在低濃度無(wú)機(jī)磷酸鹽；足夠的葡萄糖和足夠高濃度的含氮物質(zhì)。在發(fā)酵培養(yǎng)基上，鏈霉素的發(fā)酵分3個(gè)階段：生長(zhǎng)階段，菌絲形成，需氧量極大，在兩天內(nèi)形成鏈霉素不多；成熟階段，菌絲及重量保持穩(wěn)定，葡萄糖及其他碳源在培養(yǎng)基中消失，形成鏈霉素；老化階段

10、，有許多鏈霉素形成，然后鏈霉素產(chǎn)生停止，濃度下降，pH上升，菌絲自溶，需氧量減少，此時(shí)停止發(fā)酵。在中性溶液中，鏈霉素成為3價(jià)陽(yáng)離子故可用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附，然后進(jìn)行洗脫和收集。二次洗脫液要通過(guò)高交聯(lián)度的氫型樹(shù)脂，以除去陽(yáng)離子、無(wú)機(jī)雜質(zhì)和小分子的有機(jī)雜質(zhì)。精制液用硫酸或氫氧化鋇調(diào)至pH4.55.0，再加入適量的活性碳，常溫下脫色，可得到鏈霉素精制液。紙層析是鑒別抗生素的方法之一，常用8個(gè)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行紙層析，層析后進(jìn)行生物顯色并繪制層析圖譜，根據(jù)層析圖譜對(duì)未知抗生素進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)采用其中一個(gè)溶劑系統(tǒng)，并用標(biāo)準(zhǔn)鏈霉素溶液作為對(duì)照對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行鑒定?！緝x器、材料與試劑】?jī)x器5L發(fā)酵罐恒溫?fù)u床冷凍離心機(jī)

11、高壓滅菌鍋等材料灰色鏈霉菌StreptomycesgriseusAS4.1095（鏈霉素產(chǎn)生菌，中國(guó)菌種保藏中心）大腸桿菌E.coliK12S（用于生物顯色）金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus,用于生物顯色）豌豆正丁醇三角瓶（50Ml）新華3號(hào)濾紙層析缸（30cm10cm）搪瓷盤(pán)（25cm15cm5cm）毛細(xì)管培養(yǎng)皿試劑牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂20g，水1000mL，pH7.47.6，121高壓蒸汽滅菌30min豌豆培養(yǎng)基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，豌豆提取液1L（以NH2計(jì)，100mL含1214mg），pH7.07.2。高壓蒸

12、汽滅菌（105，30min）查氏培養(yǎng)基鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（10mg/mL）：將鏈霉素溶于去離子水中，無(wú)菌濾膜過(guò)濾后備用展層溶劑系統(tǒng)：水飽和的正丁醇【實(shí)驗(yàn)步驟】斜面孢子的制備用接種環(huán)挑取冰箱中保藏的菌種接種于豌豆培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基上，于27恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)67d，即可得到斜面孢子。母瓶培養(yǎng)液的制備用接種環(huán)挑取斜面培養(yǎng)基表面上的孢子接種于滅菌的含有50mL豌豆培養(yǎng)基的三角瓶中，于27搖瓶200r/min培養(yǎng)72h即成母瓶培養(yǎng)液。種子培養(yǎng)液的制備無(wú)菌操作取2mL母瓶培養(yǎng)液接種于含有100mL豌豆培養(yǎng)基的三角瓶中，于27恒溫?fù)u床200r/min培養(yǎng)34d。發(fā)酵培養(yǎng)三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)：取4mL種子培養(yǎng)液接種于含有

13、200mL豌豆培養(yǎng)基的500mL大三角瓶中，于28恒溫?fù)u床200r/min培養(yǎng)1215d進(jìn)行鏈霉素發(fā)酵。發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)：在5L發(fā)酵罐中裝入3L豌豆培養(yǎng)基，滅菌后接入60mL種子培養(yǎng)液，在控制條件下進(jìn)行鏈霉素發(fā)酵。發(fā)酵液預(yù)處理發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液在低溫條件下12000r/min離心，上清即為含有鏈霉素的樣品，如果不進(jìn)行鏈霉素的分離純化，可直接對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行抗生素抑菌實(shí)驗(yàn)和紙層析生物顯色分析鑒定。發(fā)酵液抑菌實(shí)驗(yàn)在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上均勻涂布大腸桿菌或金黃色葡萄球菌，待其表面干燥后將小鋼管垂直置于平板表面，取發(fā)酵液0.1mL注入小鋼管中，于37恒溫培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。鏈霉素的紙層析鑒定點(diǎn)樣：

14、在距新華濾紙（25cm19cm）底端2.5cm處劃一道橫線，用毛細(xì)管將發(fā)酵清液和標(biāo)準(zhǔn)鏈霉素溶液（10mg/mL）點(diǎn)在濾紙的橫線上。每個(gè)樣品之間距離2cm。層析：將點(diǎn)好樣的濾紙做成圓筒狀，置于含有展層溶劑系統(tǒng)的層析缸中，于2025上行擴(kuò)展2025cm后取出，揮發(fā)除凈溶劑。顯影（生物顯影法）：將濾紙貼在接種有大腸桿菌或金黃色葡萄球菌的瓊脂平板上，置冰箱中(10，4h)，使濾紙上的抗生素滲透到平板上，然后于3035培養(yǎng)1620h，根據(jù)平板上樣品抑菌區(qū)的位置判斷抗生素的類(lèi)型?！窘Y(jié)果與分析】觀察鏈霉素發(fā)酵液對(duì)細(xì)菌的抑制作用及鏈霉素紙層析生物顯色圖譜。發(fā)酵液離心上清抑菌結(jié)果，可觀察到明顯的抑菌圈，說(shuō)明發(fā)酵

15、液中含有抗菌物質(zhì)。發(fā)酵液和標(biāo)準(zhǔn)鏈霉素紙層析后經(jīng)生物顯色結(jié)果，可觀察到抑菌圈的位置在相同的位置，初步說(shuō)明發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)為鏈霉素?！緦?shí)驗(yàn)安排】第一天：配制試劑、滅菌，接種斜面孢子（斜面孢子的制備、母瓶培養(yǎng)液的制備、種子培養(yǎng)液的制備、發(fā)酵培養(yǎng)液的接種：在教師指導(dǎo)下由學(xué)生利用課余時(shí)間完成。全過(guò)程大約需要2628d）。第二天：發(fā)酵液預(yù)處理、發(fā)酵液抑菌實(shí)驗(yàn)（24h后觀察記錄結(jié)果）和鏈霉素的紙層析及觀察記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)三抗生素的分離和鑒別（薄層層析法）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆毡訉游龇ǚ蛛x抗生素的原理與方法；了解生物顯影法在抗生素鑒定中的應(yīng)用?！緦?shí)驗(yàn)原理】薄層層析是一種微量而快速的層析方法。把吸附劑或支持劑均勻的

16、涂布于玻璃板（或滌綸片基）上成一薄層，把要分析的樣品加到薄層上，然后用合適的展層劑進(jìn)行展開(kāi)而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。為了使要分析的樣品中的各組分得到分離，必須選擇合適的吸附劑。硅膠、氧化鋁和聚酰胺由于它們的吸附性能良好，是應(yīng)用最廣泛的吸附劑，硅藻土和纖維素則是分配層析中最常用的支持劑。在吸附劑或支持劑中添加合適的粘合劑后再涂布，可使薄層粘牢在玻璃板上。在吸附層析中，雖用相同的吸附劑和溶劑系統(tǒng)，但不同性質(zhì)的抗生素由于其吸附能力的差異，比移植（Rf）也不同。因此，即使是性質(zhì)極為接近的同組抗生素的各個(gè)組分，在合適的溶劑系統(tǒng)中展開(kāi)，也能達(dá)到分離的目的。通過(guò)薄層色譜分離后的化合物經(jīng)生物顯跡確定斑點(diǎn)的

17、位置后，可求得其Rf值，將該Rf與同一薄層上標(biāo)準(zhǔn)品的Rf作比較就可初步鑒別樣品中的抗生素。【實(shí)驗(yàn)用品】器材硅膠GF254玻璃板（100mm200mm）層析缸（20個(gè)）測(cè)度盤(pán)（19.5cm34cm的玻璃板筐）微量注射器、濾紙、玻璃等烘箱（2臺(tái)）、培養(yǎng)箱（2臺(tái)）、滅菌鍋（1臺(tái)）、超凈工作臺(tái)（1臺(tái)）試劑配制展層溶劑系統(tǒng)：正丁醇：乙酸：水（3：1：1）生物顯影用培養(yǎng)基：蛋白胨6g，酵母膏3g，牛肉膏1.5g，瓊脂20g，水1000mL，pH6.5（滅菌后）。生物顯影時(shí)，測(cè)度盤(pán)內(nèi)培養(yǎng)基分上下兩層，上層培養(yǎng)基須另加0.5%的葡萄糖。生物顯影用枯草桿菌芽孢懸浮液將枯草桿菌（Bacillussubtilis1

18、ATTC6633）接種在肉湯瓊脂大斜面培養(yǎng)基上（2支），37培養(yǎng)7d。用0.85生理鹽水將枯草桿菌芽孢洗下，再用滅菌玻璃珠將芽孢分散，用0.85生理鹽水稀釋成12108/mL芽孢懸液。將此懸液于65水液中保溫30min，冷卻后保存于冰箱內(nèi)，可使用一個(gè)月。使用前，最好先作抑菌試驗(yàn)，以確定每100mL上層培養(yǎng)基需加入芽孢懸液的量。材料枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisTATTC6633)；鏈霉素、卡那霉素等抗生素純品及粗制抗生素樣品若干種（鏈霉素或卡那霉素粗制品）?！緦?shí)驗(yàn)步驟】薄層的制備制薄層用的玻板預(yù)先用洗液洗凈并烘干，玻板表面要求光滑。將硅膠GF254和雙蒸水（硅膠：雙蒸水10：2

19、5）于燒杯中攪拌均勻后用玻棒迅速涂布鋪平，輕輕振動(dòng)玻板，使其分布均勻，鋪成厚度0.25mm的薄層板，在空氣中涼干（或在60烘箱中烘干）后移至110烘箱中活化1h，取出置干燥器中備用。點(diǎn)樣距薄板一端2cm處每隔2cm作一記號(hào)(用鉛筆輕輕點(diǎn)一下，切不可將薄層刺破)，用50uL微量注射器取抗生素純品或粗制品（分別溶于少量的甲醇中，濃度為0.5mg/mL）溶液在記號(hào)處點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為20uL。注意控制樣點(diǎn)擴(kuò)散直徑不超過(guò)3mm。展開(kāi)將薄板點(diǎn)樣一端放入盛有展開(kāi)劑的層析缸中（注意樣點(diǎn)不可直接與展開(kāi)劑相接觸），展層至溶劑前沿距頂端12cm處時(shí)取出薄板，在溶劑前沿處作記號(hào)?？諝庵袥龈?，除盡溶劑。生物顯影往測(cè)定盤(pán)內(nèi)

20、倒入生物測(cè)定培養(yǎng)基150mL，放平。待凝固后再倒入60mL帶枯草桿菌的上層培養(yǎng)基，完全凝固后，將層析過(guò)的層析板（點(diǎn)樣的一面）直接貼在瓊脂表面，放置15min，取下層析板，將盤(pán)置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約16h后取出觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果處理用筆描下抑制圈所在的位置和形狀，計(jì)算各抗生素樣品的Rf值?！舅伎碱}】薄層色譜的Rf值是鑒別化合物的主要參數(shù)，請(qǐng)指出再薄層色譜過(guò)程中影響化合物Rf值的主要因素有哪些？假設(shè)某試樣的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)品相同，請(qǐng)問(wèn)能否據(jù)此確定該試樣與標(biāo)準(zhǔn)抗生素同質(zhì)？實(shí)驗(yàn)四植物細(xì)胞/組織培養(yǎng)（略）與細(xì)胞活性的鑒定一、目的練習(xí)以堿性染料中性紅和熒光染料（FDA，F(xiàn)M4-64）進(jìn)行活體染色的方法。

21、通過(guò)活體染色及質(zhì)壁分離，進(jìn)行細(xì)胞死活的鑒定。二、原理用某種對(duì)植物無(wú)害的染料稀溶液對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色稱(chēng)活體染色。中性紅是常用的活體染料之一。在中性或微堿性環(huán)境下，植物的活細(xì)胞能大量吸收中性紅并向液泡排泄，液泡一般呈酸性，進(jìn)入液泡的中性紅解離出大量陽(yáng)離子而呈櫻桃紅色,原生質(zhì)及壁不染色。死細(xì)胞的液泡已消失因而不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象，中性紅陽(yáng)離子卻與帶一定負(fù)電荷的原生質(zhì)及細(xì)胞核結(jié)合而使原生質(zhì)及細(xì)胞核染色。細(xì)胞的熒光染色是目前細(xì)胞生物學(xué)常用的方法，F(xiàn)DA與FM4-64在酯酶的作用下水解釋放出熒光素，從而發(fā)出熒光?；罴?xì)胞細(xì)胞膜酯酶活性較高，能水解FDA釋放熒光素，從而顯示出熒光；而死細(xì)胞的酯酶喪失活性，不能水解

22、FDA，不能顯示出熒光。FM4-64在熒光顯微鏡下紅色，經(jīng)酯酶水解后，顯示無(wú)色。因而，活細(xì)胞紅色消失或較暗，死細(xì)胞紅色較強(qiáng)，以區(qū)分細(xì)胞的死活。成長(zhǎng)的細(xì)胞是一個(gè)滲透系統(tǒng)，活的原生質(zhì)具有選擇透性，原生質(zhì)內(nèi)部包含著一個(gè)大液泡，具有一定的溶質(zhì)勢(shì)。當(dāng)細(xì)胞與外界低水勢(shì)溶液接觸時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的水分外滲，原生質(zhì)隨著液泡一起收縮而發(fā)生質(zhì)壁分離；其后，當(dāng)與清水（或高水勢(shì)溶液）接觸，細(xì)胞又因液泡的吸水膨脹而發(fā)生質(zhì)壁分離復(fù)原。死細(xì)胞因其原生質(zhì)的選擇透性已遭破壞，故與低水勢(shì)溶液接觸時(shí)不產(chǎn)生質(zhì)壁分離。三、材料、儀器設(shè)備及試劑1.材料：洋蔥鱗莖；大麥種子。2.儀器設(shè)備：刀片；鑷子；吸水紙；酒精燈；載玻片；蓋玻片；膠頭滴管；顯微鏡；熒光顯微鏡或熒光燈。3.試劑：0.8mol/