利用參考資料不同的方法篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子

1、生物工程上游技術(shù)綜合設(shè)計實(shí)驗(yàn)利用不同的方法篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子生命科學(xué)學(xué)院生揚(yáng)工程09級1班同紐成員:指導(dǎo)教師:摘要：通過轉(zhuǎn)化子酈選、苗落直接PCR.重組質(zhì)粒大小鑒定、重組質(zhì)粒酶切鑒定、磴紐質(zhì)粒 的進(jìn)一步PCR鑒定等一系列步驟，我組成功篩選并鑒定了含有pET32-CaM5轉(zhuǎn)化子的兩個葡 落，基本掌握了轉(zhuǎn)基因生物篩選鑒定的基本方法。關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)化子；篩選：鑒定；PCR;凝膠電泳引言：在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆時，由于量少，連接產(chǎn)物沒有也不可能再經(jīng)過分離純化而獲得 純的重組質(zhì)粒，連接產(chǎn)物中混有載體自連而成的空載體.載體與目的片段連接而成的目的重 組質(zhì)粒和載體與非目的片段連接而成的非目的重組質(zhì)粒。同吋，細(xì)葡（宿

2、主）的轉(zhuǎn)化效率極 低，即轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)后絕大部分細(xì)菌（宿主）是沒有被轉(zhuǎn)化的，因此有必要對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行篩選 和鑒定。首先，通過抗生素抗性從轉(zhuǎn)化后代中篩選出轉(zhuǎn)化子。然后，通過菌落直接PCR從轉(zhuǎn) 化子中弼選出候選轉(zhuǎn)基因生物。靈后，從候選瑩組子中提取質(zhì)粒。一. 使用儀器、材料1、材料實(shí)驗(yàn)九裝備好的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物：含pET32-CaM5或pET32的E co DH5 u菌株（R , M , Amp ）2、設(shè)備用具PCR儀、恒溫?fù)u床、臺式高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、瓊脂糖凝膠電泳裝置、電熱恒 溫培養(yǎng)箱、電泳儀、超凈工作臺、微量移液搶、cppendorf管（1.5mL離心管）等。3、主要試劑大腸桿菌培養(yǎng)試劑、質(zhì)粒提取試劑.

3、酶切試劑、PCR反應(yīng)試劑、電泳試劑以及其他 常規(guī)試劑。實(shí)驗(yàn)步驟1、轉(zhuǎn)化子篩選（已做）（1）每組連接反應(yīng)轉(zhuǎn)化原液取100 u L用無菌玻璃棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上,37C 下培養(yǎng)半小時以上，直至液體被完全吸收。（2）倒置平板于37C繼續(xù)培養(yǎng)1216h，平板上所長出的單菌落即為轉(zhuǎn)化子。因?yàn)椴?帶質(zhì)粒的細(xì)胞無Amp抗性，不能在含有Amp的培養(yǎng)基時成活。2、菌落直接PCR 用無菌牙簽分別挑取4個白色轉(zhuǎn)化子菌落和一個已知的pET32- CaM5菌落,先在編 好號的5支PCR反應(yīng)管中的底部分別涂搽，然后點(diǎn)在新的含有Amp的篩選平板上, 在其背面編號，置37C過夜后保存于4C。在PCR反應(yīng)管中加入PCR反應(yīng)

4、混合液, 進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)混合液的配制（50 u 1）lOxPCR buffer5uldNTP mixture4 u 1前向引物（Pl）2ul2ul0.5 u 136.5 u 1反向引物（P2） rTaq 酶滅菌蒸憾水（注：dNTP mixtures： dATR dTTR dGTP. dCTP 各 2.5mM前向引物（lOuM）為：5 -CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3，反向引物（lOuM）為:5 -AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3）所有試劑按量仔細(xì)添加后，輕輕混勻，稍離心后即可，然后分為5份，每份10

5、ul加 入上述5支PCR反應(yīng)管。為了防I上反應(yīng)混合液蒸發(fā)，每份可添加20卩1礦物油覆蓋。（3）PCR儀的參數(shù)設(shè)置94C94 C62 C72 C72 C2 min30sec30sec30sec5 min（4）瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)結(jié)朿后，取5 u 1 PCR產(chǎn)品，加入21 6或10 x loading buffer,混勻后點(diǎn)樣. 電泳15min,觀察產(chǎn)品的大小。3、-重組質(zhì)粒大小鑒定（1）用無菌牙簽從上述新的篩選平板上挑取PCR反應(yīng)陽性菌落、，接種于含 Amp 50 u g/mL的5mLLB液體培養(yǎng)基中，37C下振蕩培養(yǎng)12h。（2）配制試劑：溶液 I： 50mM 葡萄糖，lOmMEDTA, 2

6、5 mMTris-HCl （pH8.0）,用前加溶菌酶 4mg/L；溶液 II： NaOH 溶液（內(nèi)含 1 %SDS）： 0.2 M：溶液 III （pH4.8） : 60 mL 5 mol/L 醋酸鉀,11.5 mL冰醋酸，2&5 mL H2O：飽和酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）氯仿TE 緩沖液（pH8.0） : lOmMTris-HCb 1 mMEDTA,其中含 RNA 酶（RNascA）:20 pg/ml醋酸鞍（pH75&0） :75 mol/L異丙醇；70%乙醇：無水乙醇。（3）吸取1.4 ml菌液至l5ml離心管中。（4）離心（8 OOOrpm，分鐘）,棄上淸液。（如想提取多一點(diǎn)

7、DNA,再吸取1.4ml菌 液至同一離心管中，離心，棄上淸液）（5）加入150ML溶液I ,用旋渦振蕩器充分懸浮菌體。（6）加入200 pL溶液II,加蓋后溫和顛倒56次，直至呈透明狀。此步驟在5分鐘 內(nèi)完成。（7）加入150 pL預(yù)冷的溶液【II,加蓋后反復(fù)顛倒混勻，直至岀現(xiàn)白色絮狀沉淀，冰 浴5分鐘。（8）離心（14OOOrpm, 10分鐘,4 C）,移取上淸液于另一干凈離心管。（9）向上清液中加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）,振蕩混勻抽提，離心（14 000 rpm, 5分鐘），溶液將出現(xiàn)分層。（10）移取上層水相溶液（約450pL）于另一干凈離心管，加等體積氯仿，振蕩混勻

8、 抽提，離心（14 000 rpm, 5分鐘），溶液將岀現(xiàn)分層。（11）移取上層水相溶液于另一干凈離心管，加入1/10體積的醋酸鈉（pH5.2）和2 倍體積無水乙醇混勻，冰浴30分鐘。（12）離心（14 000rpm, 10分鐘,4C）,倒掉上淸液。（13）力n 0.5 ml預(yù)冷的70%灑精振蕩，洗DNA沉淀一次，離心5分鐘，倒掉上淸 液。（14）真空抽干或室溫自然干燥（15）力n 30M0pLTE緩沖液使DNA完全溶解,室溫放置10分鐘，降解RNA雜質(zhì), 瓊脂糖凝膠電泳或-20C保存?zhèn)溆?。?6）瓊脂糖凝膠電泳（1%）：稱取0.5g瓊脂糖粉末，加入50ml 0.5倍TBE溶液, 加熱熔化，稍

9、降溫后，加入5pL澳化乙錠（EB）,混勻，制備凝膠板，冷卻后 備用。（17）每位同學(xué)各取5pL質(zhì)粒DNA加入lpL6Xloading buffer混勻，進(jìn)行點(diǎn)樣。（18）電泳條件：120v, 25分鐘：電泳完成后，膠塊通過凝膠成像系統(tǒng)檢測，觀察實(shí) 驗(yàn)結(jié)果，并拍照記錄。（19）以pGEM-T作對照，有插入片段的重組質(zhì)粒電泳時遷移速度較慢。4、-重組質(zhì)粒酶切鑒定利用CaM5片段上的特異酶切位點(diǎn)旳汕11來檢驗(yàn)，該片段上兩個位點(diǎn)間的DNA 是 219bp.（1）酶切反應(yīng)酶切反應(yīng)液的配制：Wwdlll1 ul10XM buffer2ul質(zhì)粒5ulddH2012ul酶切反應(yīng)條件：37C水浴23小時。（2）

10、電泳檢測反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入2.2 u 1 10Xloading buffer,混勻以停止酶切反應(yīng)，所 有22.2 U 1樣品均點(diǎn)在同一個點(diǎn)樣孔中。電泳條件：120V.45分鐘左右。電泳后，觀察 酶切結(jié)果是否與預(yù)期的相符，即觀察產(chǎn)品的大小。5、重組質(zhì)粒的進(jìn)一步PCR鑒定（1） PCR反應(yīng)混合液的配制（10 P1）10 x PCR bufferl.OuldNTP mixture0.8 ul前向引物（Pl）0.4 ul反向引物（P2）0.4 u I質(zhì)粒0.2 ulrTaq 酶0.1 ul火菌蒸懈水7.1 ul(注：dNTP mixtures： dATR dTTR dGTP. dCTP 各 2

11、.5mM前向引物(lOuM)為:5 -CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3 反向引物(lOuM)為：5 AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3)所有試劑按量仔細(xì)添加后，輕輕混勻，稍離心后即可，為了防止反應(yīng)混合液蒸發(fā)，可 添加20 ul礦物油覆蓋。94C2 min94 C30sec35 cycles 4 62 C30secI 72 C30sec72 C5 min瓊脂糖凝膠電泳檢測(2) PCR儀的參數(shù)設(shè)置加入1 ul 6或10 x loading buffer混勻后點(diǎn)樣,反應(yīng)結(jié)束后，取5 u 1 PCR產(chǎn)品, 電泳15min

12、,觀察產(chǎn)品的大小。三、結(jié)果與分析1、菌落直接PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1。marker 圖1菌落直接PCR的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖1中，為已知的pET32CaM5菌落質(zhì)粒，對比可知，、 為陽性轉(zhuǎn)化子，為陰性轉(zhuǎn)化子，因此，四個菌落(、)中有3 個(、)呈陽性。再對比marker可知，、與的窄條帶大 小均為6130bp,與pET32質(zhì)粒大小相符：寬條帶大小均為219bp,與CaM5 ) 段大小相符。綜上初步判斷，、所代表的菌落為所需鑒泄的轉(zhuǎn)化子， 即含pET32CaM5的菌落。2、重組質(zhì)粒大小鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2. *77圖2重組質(zhì)粒大小鑒定的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果 marke

13、r圖2中，對比marker可知，、條帶大小均為6130bp,符 合pET32-CaM5質(zhì)粒的理論大小，表明、兩個菌落都是成功 的pET32CaM5轉(zhuǎn)化子。3、重組質(zhì)粒酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3的、。markerI 1【 圖3重組質(zhì)粒酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果圖3中，、均岀現(xiàn)了兩條同步的條帶，對比marker可知，在上而 的條帶大小約為6130bp,在下面（較暗）的條帶大小約為219bp,與預(yù)期 的相符，表明、兩個菌落都是成功的pET32-CaM5轉(zhuǎn)化子，至此，可 認(rèn)定已篩選出目的重組子。4、重組質(zhì)粒的進(jìn)一步PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3的I、1【。圖3中，I、II均有條

14、帶，且大小均為443bp,與預(yù)期的相符，進(jìn)一步表明 所對應(yīng)的.兩個菌落都是成功的pET32-CaM5轉(zhuǎn)化子。四、結(jié)論本實(shí)驗(yàn)中，首先通過抗生素抗性從轉(zhuǎn)化后代中篩選出編號為、的含 轉(zhuǎn)化子pET32-CaM5的菌落：然后通過菌落直接PCR從轉(zhuǎn)化子中篩選岀候選轉(zhuǎn)基因 生物、：最后從候選重組子、中提取質(zhì)粒進(jìn)行重組質(zhì)粒大小鑒定及重組 質(zhì)粒酶切鑒左，此兩個鑒左均表明、兩個菌落都是成功的pET32-CaM5轉(zhuǎn)化子。 另外，為進(jìn)一步檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化已成功，對重組質(zhì)粒進(jìn)一步進(jìn)行PCR鑒左，結(jié)果亦進(jìn)一步表 明、兩個菌落都是成功的pET32-CaM5轉(zhuǎn)化子。五、問題與討論1、做實(shí)驗(yàn)時應(yīng)有團(tuán)隊(duì)精神，注意分工合作，發(fā)揮最大效率。

15、例如可讓一個同學(xué)做輔助 性步驟（如先配好要用的液、調(diào)好移液槍等），另一個同學(xué)專心做主要的步驟，這 樣可節(jié)省許多時間。2、做實(shí)驗(yàn)前應(yīng)充分準(zhǔn)備，了解實(shí)驗(yàn)原理，弄淸每一個步驟，為實(shí)驗(yàn)?zāi)苡袟l不紊地進(jìn)行 打好基礎(chǔ)。例如有的同學(xué)因?yàn)闆]有弄淸每一個步驟是怎樣的，最終要看我組的預(yù)習(xí) 報告，否則不知道怎樣具體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可見實(shí)驗(yàn)前的充分準(zhǔn)備是十分重要的。3、實(shí)驗(yàn)時要細(xì)心，注意不要加錯試劑、防止細(xì)菌污染樣品、調(diào)準(zhǔn)儀器等，否則實(shí)驗(yàn)將 不能順利進(jìn)行甚至失敗。例如重組質(zhì)粒酶切鑒泄時由于粗心，我把10 x loading buffer 當(dāng)成10XM buffer用，結(jié)果水浴2小時多后才發(fā)現(xiàn)，于是不得不重做。4、應(yīng)懂得利用身邊的各種資源。例如本次實(shí)驗(yàn)由學(xué)生自行設(shè)il，難度比較大，但