體外三維細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)在組織工程中的運用

1、體外三維細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)在組織工程中的運用楊清松生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院0909501162 生物制藥09摘 要：本文主要介紹了體外三維細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)的三大基礎(chǔ)原件一一細(xì)胞、支持材料、培養(yǎng)基，及目前該技 術(shù)在皮膚組織工程、血管組織工程、骨組織工程中的主要運用。關(guān)鍵詞：三維細(xì)胞培養(yǎng)術(shù)；組織工程；應(yīng)用Application of Three-Dimensional Cell Culture inTissue EngineeringAbstract: This paper mainly introduced three basic elements of Three-Dimensional Cell Cultu

2、recells,support materials, culture medium. Also the application of Three-Dimensional Cell Culture in Bone Tissue Engineering, Skin Tissue Engineering and Vessel Tissue Engineering are introduced detailedly.Keywords: Three-Dimensional Cell Culture ； Tissue Engineering； Application1引言組織工程學(xué)是20世紀(jì)80年代末期發(fā)

3、展起來的一門新興邊緣學(xué)科1。組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、生 物材料和工程學(xué)的原理，研究開發(fā)用于修復(fù)或改善人體病損組織或器官的結(jié)構(gòu)、功能的生物活性替代物的 一門科學(xué)。組織工程的三要素為細(xì)胞、支架、生長信息，其核心目的在于使細(xì)胞按既定的設(shè)計生成具有特 定的生物學(xué)功能的組織2】。不同于傳統(tǒng)的二維化單層細(xì)胞培養(yǎng)，三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(three-dimensional cell culture, TDCC)是指將 具有三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與各種不同種類的細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)，使細(xì)胞能夠在載體的三維立體空間 結(jié)構(gòu)中遷移、生長，構(gòu)成三維的細(xì)胞2載體復(fù)合物。2基礎(chǔ)介紹2.1細(xì)胞細(xì)胞是體外構(gòu)建工程組織、器官最為重要

4、的材料。從組織工程學(xué)的應(yīng)用角度出發(fā)考慮，用于體外構(gòu)建工 程組織、器官的細(xì)胞需滿足以下三個基本前提:(1)具有特定的分化表型或定向分化潛能3; (2)可靠的細(xì)胞 來源;(3)不引發(fā)移植排斥反應(yīng)。目前用于體外構(gòu)建工程組織、器官的細(xì)胞按其來源分為自體細(xì)胞、同種異 體細(xì)胞和異種細(xì)胞三類。這三類細(xì)胞均不能同時滿足上述的三個基本要求。其中自體細(xì)胞存在來源嚴(yán)重短 缺的限制;異種細(xì)胞存在移植排斥反應(yīng)、傳染動物源性病毒和倫理的制約;同種異體細(xì)胞同時存在著來源受 限和移植排斥反應(yīng)的問題。2.2支持材料生物材料在組織工程中起著替代細(xì)胞外基質(zhì)或組織、器官的基質(zhì)的作用。其主要功能包括以下兩點 其一，為體外構(gòu)建工程組織或

5、器官提供三維的細(xì)胞生長支架，使細(xì)胞間形成適宜的空間分布和細(xì)胞聯(lián)系;其二, 提供特殊的生長和分化信號，誘導(dǎo)細(xì)胞的定向分化和維持細(xì)胞分化4。隨著對材料-生物體相互作用機(jī)理 研究的深入，對生物材料的要求，已從包括機(jī)械強(qiáng)度、親水性、可降解性和易加工程度等理化性能和生物相 容性的基本要求,發(fā)展到對生物材料的形狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行精密的設(shè)計和加工及對生物材料表面的改造和修飾賦 予生物材料特定的生物活性和功能。三維骨架由基質(zhì)材料構(gòu)建,主要作用是提供物理強(qiáng)度和張力,理想的基質(zhì)材料應(yīng)具備以下特點:(1)良好 的組織兼容性及生物可降解性;(2)良好的細(xì)胞界面,利于細(xì)胞黏附、增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì);(3)具有三維 空間結(jié)構(gòu)，有

6、利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的交換;(4)具有一定的強(qiáng)度和可塑性。三維骨架結(jié)構(gòu)除了提供足夠 的機(jī)械強(qiáng)度外，還必須為種子細(xì)胞提供三維空間結(jié)構(gòu).生物材料的三維結(jié)構(gòu)可在三個尺度水平上控制工程組織、器官的生長發(fā)育過程(1)在cm -mm級水平 決定工程組織的形狀和大小;(2)在|J m級水平通過生物材料的空隙大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移和生 長;(3)在nm級水平通過生物材料的表面化學(xué)性質(zhì)調(diào)節(jié)與其接觸的細(xì)胞的粘附和基因表達(dá)。2.3培養(yǎng)基培養(yǎng)基是細(xì)胞三維培養(yǎng)中對細(xì)胞分化起著關(guān)鍵性作用，但尚未引起足夠重視的環(huán)境因素。迄今為止, 商品化的細(xì)胞培養(yǎng)基是為支持細(xì)胞的體外增殖而設(shè)計的。由于細(xì)胞在體外增殖的同時往往伴隨著

7、不同程度 的去分化而失去某些分化表型，以體外構(gòu)建組織、器官為目的的細(xì)胞三維培養(yǎng)一般需經(jīng)歷細(xì)胞增殖、細(xì)胞分 化和組織或器官型形成三個階段。細(xì)胞體外培養(yǎng)常規(guī)使用的細(xì)胞培養(yǎng)基、生長因子或胎牛血清完全適用于 細(xì)胞三維培養(yǎng)的細(xì)胞增殖階段。在細(xì)胞分化階段應(yīng)盡可能減少生長因子和或胎牛血清的用量減少培養(yǎng)環(huán) 境的促細(xì)胞有絲分裂壓力。商品化的細(xì)胞培養(yǎng)基的電解質(zhì)成分與動物或人血清的電解質(zhì)成分不相同培養(yǎng)基 中Na +濃度較高而K+濃度較低。提高培養(yǎng)基中的Na +濃度和/或降低培養(yǎng)基K+濃度，均能促進(jìn)細(xì)胞增 值，降低培養(yǎng)基中的Na +濃度和/或提高其K+濃度，有利于細(xì)胞分化的誘導(dǎo)和維持。調(diào)整或重新設(shè)計用于 細(xì)胞三維培養(yǎng)

8、的培養(yǎng)基電解質(zhì)組成、設(shè)計含有適宜的分化因子和/或激素的無血清培養(yǎng)基，有助于控制細(xì)胞 的去分化和誘導(dǎo)細(xì)胞的定向分化。3三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要應(yīng)用3.1軟骨組織工程采用密度梯度離心法加貼壁培養(yǎng)方法得到的MSCs具較高的純度回，且體外培養(yǎng)具有較強(qiáng)的增殖能力，短 時間內(nèi)可大量擴(kuò)增,達(dá)到組織工程需要的種子細(xì)胞數(shù)量要求，且細(xì)胞保持未分化狀態(tài)，具有良好的生物安全 性。經(jīng)過三維培養(yǎng)后能表達(dá)II型膠原和蛋白多糖等椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)，因此MSCs是椎間盤組織工程理想的 種子細(xì)胞。為探討通過MSCs組織工程學(xué)方法修復(fù)退變椎間盤提供了實驗基礎(chǔ)。軟骨細(xì)胞的表型特征體現(xiàn)為II型膠原和聚集素(aggrecan)等軟骨特異性基質(zhì)

9、的合成、沉積與維持。體 外單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞將逐漸發(fā)生退化,形態(tài)上轉(zhuǎn)變?yōu)楸馄健⑺笮蔚某衫w維細(xì)胞樣外觀。而II型膠原和軟骨 白合成的降低則說明了其生化和遺傳特性的改變。其原因可能是體外培養(yǎng)時與體內(nèi)條件迥異的力學(xué)、營養(yǎng) 微環(huán)境和受其影響的細(xì)胞間及細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用。這種退化現(xiàn)象將限制工程化軟骨的獲得。研究者 已經(jīng)嘗試了多種方法以克服此障礙:選擇合適的細(xì)胞接種密度。Panossian等7 比較了不同來源的軟骨 細(xì)胞、不同的細(xì)胞密度與培養(yǎng)時間對于軟骨生長的影響。認(rèn)為細(xì)胞種植密度為40 X1Q6/ mL時，耳和關(guān)節(jié) 軟骨細(xì)胞均可生成合適的新生軟骨組織。將經(jīng)過14代的單層細(xì)胞培養(yǎng)(密度2 X1Q6/

10、mL)后的退化軟骨 細(xì)胞引入高密度培養(yǎng)系統(tǒng)(密度2 X 106/p L)，可使其重新獲得軟骨細(xì)胞表型，分泌軟骨細(xì)胞特異性基質(zhì)。其 機(jī)制可能是高密度培養(yǎng)條件推動了軟骨標(biāo)志物基因-Sox9基因的表達(dá)，以及特異性受體(如整合素受體a 3) 的出現(xiàn)，從而促進(jìn)了細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用。(2)構(gòu)建合適的培養(yǎng)體系。將利于細(xì)胞擴(kuò)增的單層培養(yǎng)體系與 可以有效保持軟骨細(xì)胞表型的三維培養(yǎng)系統(tǒng)聯(lián)合運用，并在三維培養(yǎng)中選擇合適的支架。此外還可以運用微 載體培養(yǎng)技術(shù)推動退化軟骨細(xì)胞的再分化。(3)應(yīng)用合適的生長因子。包括bFGF. PDGF、IGF - 1在內(nèi)的 生長因子有維持軟骨細(xì)胞表型、促使退化軟骨細(xì)胞重新表達(dá)軟骨細(xì)胞

11、表型的能力。3.2皮膚組織工程研究皮膚組織工程學(xué)是應(yīng)用組織工程學(xué)的方法，先在體外培養(yǎng)高濃度的角阮細(xì)胞，并轉(zhuǎn)種在細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu) 成的三維支架上培養(yǎng)擴(kuò)增，將這種角阮細(xì)胞-ECM生物復(fù)合體種植于創(chuàng)面,ECM可被人體逐步降解吸收，角 骯細(xì)胞繼續(xù)增殖，達(dá)到修復(fù)創(chuàng)面，重建功能的目的冏。細(xì)胞懸液：5xDMEM：膠原溶液按1:2:7的容積比例，置冰上充分混勻，用0.1mol/L的氫氧化鈉中和至 pH值為中性。取1 mL加入35mm培養(yǎng)皿中，37度培養(yǎng)箱中放置10min，混懸液便形成凝膠固定于培養(yǎng)皿中。 加入適量的完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)。并用纖維細(xì)胞膠原網(wǎng)架的制作方法得到皮膚組織工程用組 織。單純應(yīng)用培養(yǎng)

12、的角阮細(xì)胞因無真皮而攣縮，故基質(zhì)三維支架是皮膚組織工程的必要成分?；|(zhì)三維支 架，既是培養(yǎng)角骯細(xì)胞的附著場所，又是良好的創(chuàng)面覆蓋物，要求理化性能好，能被降解吸收，隔離病菌， 防止水分丟失，便于手術(shù)應(yīng)用，無抗原性，價格低廉，柔韌耐用，生產(chǎn)制備方便，易消毒、貯存。因此基質(zhì) 的研究開發(fā)一直是細(xì)胞培養(yǎng)的重要方面9。3.3血管組織工程動脈缺血性疾病以動脈硬化性血管疾病為主要代表是當(dāng)今世界人群死亡的重要病因10。目前主要的治 療方式為動脈旁路術(shù)，移植材料有自體血管和人工血管。由于可利用的自身血管來源有限而人工血管(特別 是直徑46 mm)的遠(yuǎn)期通暢率不夠理想，因而尋找新的治療方法和移植材料成為重要的研究課

13、題由此 引發(fā)血管組織工程學(xué)研究。細(xì)胞三維培養(yǎng)物的血管形成細(xì)胞三維培養(yǎng)所形成的人工組織樣或器官樣結(jié)構(gòu)需達(dá)到一定的大小才有 實際應(yīng)用價值，某些工程組織或器官的表型與其大小緊密相關(guān)。肝細(xì)胞的三維培養(yǎng)物所能表達(dá)的蛋白質(zhì)的 種類和水平隨其大小呈正相關(guān)。一般情況下細(xì)胞三維培養(yǎng)形成直徑大于1 mm的球形結(jié)構(gòu)時，由于受營養(yǎng) 物質(zhì)傳遞和氧擴(kuò)散的限制，位于中心的細(xì)胞易于發(fā)生壞死。因此，細(xì)胞三維培養(yǎng)要求培養(yǎng)體系中的所有細(xì) 胞均能得到充足的營養(yǎng)和氧的供給。誘導(dǎo)細(xì)胞三維培養(yǎng)物的血管形成可有效地克服因傳質(zhì)傳遞受限所致的 細(xì)胞壞死11。實驗證明:將具有刺激血管形成的可溶性信號因子，如堿性成纖維細(xì)胞因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生 長因

14、子等固定于生物材料支架,能觸發(fā)細(xì)胞三維培養(yǎng)物的血管形成。進(jìn)一步的研究應(yīng)確定血管生成因子的釋 放方式及對其活性實施有效控制的方式，使細(xì)胞三維培養(yǎng)物的血管形成能根據(jù)細(xì)胞三維培養(yǎng)物生長的需要 在特定的時間和位置形成血管。4展望目前以實現(xiàn)生物醫(yī)藥規(guī)?；a(chǎn)為目的的大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)雖已取得了顯著的發(fā)展但以體外 構(gòu)建與各類組織、器官相應(yīng)的細(xì)胞三維生長類似物或等同物為主要目的的細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)尚處于不成熟 的早期發(fā)展階段,諸如起細(xì)胞外基質(zhì)和/或生物支架作用的人造生物材料、培養(yǎng)基、培養(yǎng)裝置、不同類型細(xì) 胞的共同培養(yǎng)和細(xì)胞三維培養(yǎng)物的血管形成等問題均有待進(jìn)一步研究解決。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，細(xì)胞三維培養(yǎng)

15、在組織工程中的應(yīng)用必將帶來醫(yī)學(xué)變革，并為造福人類作出 巨大貢獻(xiàn)。參考文獻(xiàn)(References)Xiangping Meng，Yan Gao. Electric Systems Analysis M. Beijing: Higher Education Press，2004. 3-21.盛治國體外細(xì)胞三維培養(yǎng)技術(shù)在藥理毒理學(xué)研究中的應(yīng)用，中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2007年10月;21 (5) : 444 -448Nerem RM_Sambanis A. Tissue engineerning .1995，l :3Minuth WW.Sittinger M.Kloth S. Cell Tissu

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