動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-SPA技術(shù)

1、PAGE PAGE 12 第十六章 SPA技術(shù)(Staphylococcal protein A technique)一、概述金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、簡稱SPA)是細(xì)胞壁抗原的主要成分，幾乎90%以上的菌株均含有這種成分，但不同的菌株含量差別十分懸殊。SPA占整個(gè)細(xì)胞壁蛋白成分的6.7%，通過胞壁肽聚糖以共價(jià)鍵與之結(jié)合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA。SPA的理化性質(zhì) SPA是一種蛋白質(zhì),由亮、纈、脯、丙、蘇、甘、絲、谷丙、天門冬及賴氨酸等十種氨基酸組成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以無二硫鍵。紫外光譜和吸收系數(shù)為A275n

2、m %=1.65，等電點(diǎn)為pH5.1。SPA十分穩(wěn)定，用4mol/L尿素、硫氰鹽酸、6mol/L的鹽酸胍和pH2.5的酸性條件，以及加熱煮沸均不影響其活性。其分子量因測定方法不同而有所差異。SPA的部分理化參數(shù)見表161。表161 SPA部分理化參數(shù)分子量42 000沉降系數(shù)S 20w(S )2.10擴(kuò)散系數(shù)D20W(cm2/s)4.3107Stocks半徑(nm)5.00摩擦比f/f,min2.10粘度(n) (ml/g)2.90Hggins常數(shù)0.66比容V(ml/g)0.72SPA的免疫學(xué)性質(zhì) SPA能與人及多種哺乳動(dòng)物血清IgG分子中的Fc片段結(jié)合，結(jié)合的親和性次序依次是豬、狗、兔、人

3、、猴、鼠、小鼠及牛；對(duì)大白鼠、綿羊的親和力差；對(duì)馬、犢牛、山羊等無親和力；對(duì)所有的魚類、兩棲類、爬行類、鳥類（除少數(shù)例外）均不能與之結(jié)合。雞的IgG必須與相應(yīng)的抗原形成復(fù)合物才能與SPA結(jié)合，原因可能是AgAb復(fù)合物改變了IgG的Fc片段的構(gòu)象。SPA與IgG結(jié)合的亞類主要是IgG1、IgG2和IgG4。SPA除與IgG結(jié)合外，還能與血清中少量的IgM和IgA結(jié)合，SPA菌對(duì)各類免疫球蛋白的吸附率：IgG為90%98%，IgM為2%30%，IgA為1.5%20%。出現(xiàn)共沉反應(yīng)的SPA與IgG必須有兩個(gè)結(jié)合部位，它們分別在Fc和Fab段上,缺一雖能與SPA結(jié)合，但不出現(xiàn)共沉反應(yīng)，這種Fab的參與

4、并非SPA抗體反應(yīng)?，F(xiàn)已研究表明，IgG與SPA的結(jié)合部位是CH2和CH3的交界處。（三）SPA的生物學(xué)特性1免疫原性與過敏原性 SPA做為免疫原能刺激免疫活性細(xì)胞合成Ig，又能與其相應(yīng)抗體的Fab段結(jié)合呈現(xiàn)抗原抗體的特異性反應(yīng)。SPAIgG注射家兔皮下可引起Arthus樣反應(yīng)，還可引起豚鼠的遲發(fā)性超敏反應(yīng)。SPA體外試驗(yàn)，能刺激豚鼠離體回腸收縮。2抗吞噬作用 由于IgG的Fc段結(jié)合點(diǎn)既是lgG調(diào)理活性結(jié)合點(diǎn)，又是SPA反應(yīng)點(diǎn)。因此，SPA可與吞噬細(xì)胞競爭，結(jié)果抑制了多形核白細(xì)胞的吞噬作用，也可能是SPA阻斷調(diào)理素與吞噬細(xì)胞作用的結(jié)果。3固定補(bǔ)體 SPAIgG和免疫復(fù)合物一樣可以固定人和某些動(dòng)

5、物(如豚鼠、豬、狗等)血清中的補(bǔ)體，主要是通過補(bǔ)體傳統(tǒng)激活途徑。4促有絲分裂因子 SPA是一種B細(xì)胞激活劑，固相SPA作用明顯，并不需要T細(xì)胞輔助,可容性SPA作用微弱，必須有T細(xì)胞參與。5去封閉作用 固相SPA能部分去除腫瘤病人和帶瘤動(dòng)物血清中的封閉活性，從而降低了血清對(duì)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒的封閉作用。（四）SPA的應(yīng)用 SPA應(yīng)用很廣，但所有應(yīng)用的原理都離不開SPA具有與IgG的Fc段的結(jié)合能力，主要應(yīng)用方面如下：1SPA菌的協(xié)同凝集作用用已知的標(biāo)準(zhǔn)血清，吸附到SPA菌的表面,使之成為吸附抗體的載體,再以此去診斷相應(yīng)的未知抗原而產(chǎn)生肉眼可見的凝集顆粒,診斷的抗原可以是顆粒性的,也可以是可溶

6、性的。此種凝集相當(dāng)于反向間接血凝,但省去間接血凝中的抗體純化,紅血球鞣化等復(fù)雜手續(xù),而只需要 SPA菌體及粗制免疫血清即可。所以此法簡單、快速,特異性敏感性均較滿意。目前已用于許多細(xì)胞和病毒的檢測及分型。協(xié)同凝集只適用于檢測抗原，未見應(yīng)用于檢測抗體的報(bào)道。2作為廣譜第二抗體 用SPA代替抗體IgG的第二抗體，有如下優(yōu)點(diǎn)：SPA制備容易，性質(zhì)穩(wěn)定，易純化，對(duì)人和多種哺乳動(dòng)物的IgG都能應(yīng)用,不受種屬限制。而第二抗體的制備比較麻煩，且需多次免疫動(dòng)物，在應(yīng)用上要受同種屬的限制；SPA的結(jié)合力強(qiáng)，相當(dāng)于游離抗體與抗原的結(jié)合力，對(duì)人和兔的親和常數(shù)均為103 L/克分子，結(jié)合后對(duì)IgG的活性無影響。無論在

7、0、37、44及56幾乎均能立即結(jié)合而無需長時(shí)間的孵育，因此可以縮短試驗(yàn)時(shí)間，第二抗體在較長的孵育中，出現(xiàn)抗原分解的問題也可以得到解決；SPA容易標(biāo)上125 I、熒光素、辣根過氧化物酶、鐵蛋白等，因此可與多種技術(shù)相結(jié)合；在檢查細(xì)胞上的病毒抗原時(shí)，第二抗體往往特異性不強(qiáng)，會(huì)非特異性地與細(xì)胞膜上的Fc受體結(jié)合。SPA分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受Fc受體影響，所以有較高的抗IgG特異性；用第二抗體做免疫沉淀試驗(yàn)時(shí)，必須將抗免疫球蛋白的濃度調(diào)整至等價(jià)，才能產(chǎn)生最佳的沉淀作用。而用SPA菌沉淀，不受此限制，能保證徹底的沉淀；SPA與lgG結(jié)合是可逆的，用4mol/L尿素、4mol/L硫氰酸、鹽酸

8、(pH2.5)或鳥嘌呤鹽酸鹽等都可以使之重新解離。3用于提取純化IgG 利用SPA與IgG的結(jié)合特性提取IgG，比常規(guī)采用硫酸銨、Sephadex柱，DEAE柱或免疫梯度離心等法要簡便得多，而且純度好。4檢測和提純IgM IgM在病毒的早期診斷中具有重要意義，為了檢測特異性IgM抗體，必須首先在血清中除去IgG。采用SPA菌吸附IgG是目前快速而又理想的辦法，利用此法也為IgM的提純開辟了道路。5其它方面 用于免疫復(fù)合物的檢測、體外激活補(bǔ)體功能試驗(yàn)、細(xì)胞表面標(biāo)記以及腫瘤表面抗原的檢測等。（五）標(biāo)準(zhǔn)菌種 目前國內(nèi)使用的大致如下：1含A蛋白的葡萄球菌菌株 No 1800株：系中國科學(xué)院微生物研究所

9、保存的由上海市分離出的菌株，其SPA含量、活性及濕菌體收獲量與Cowan 1株相似，且不易出現(xiàn)自凝現(xiàn)象。 Cowan 1株：為SPA豐富的日本引進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)株，中國科學(xué)院微生物研究所編號(hào)為ASI 1476 799型菌株：從化膿性骨科病人的骨標(biāo)本中分離出含SPA豐富的菌株。 丹麥1972株：由丹麥引進(jìn)。2不含SPA的葡萄球菌株 Wood 46株：由日本引進(jìn)，編號(hào)為ASI 1477。 乙5株：遵義醫(yī)學(xué)院保存的SPA菌株。（六）培養(yǎng)基常用的培養(yǎng)基配方如下：配方一 蛋白胨 10.00g葡萄糖 1.00g氯化鈉 3.00gNa2HPO412H2O 2.00g牛肉浸液(或5%牛肉膏) 1 000.0ml混合，調(diào)

10、pH 7.8欲配固體培養(yǎng)基則另加瓊脂25.00g配方二 胰酶消化酪蛋白 17.00g大豆胨 3.00g氯化鈉 5.00g葡萄糖 25.00gK2HPO4 25.00g混和，調(diào)pH 7.3 配方三 水解蛋白胨 10.00g氯化納 5.00g牛肉膏 10.00g酵母膏 25.00g色氨酸 5.00mg半胱氨酸 100.00mg瓊脂 40.0gH2O pH 7.6 1 000.00ml二、SPA的提取、純化與鑒定SPA的提取 SPA提取的方法很多，包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等。現(xiàn)將常用的方法介紹如下：1煮沸提取法 將菌株接種于蛋白胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)20h

11、24h。 以0.15mol/L pH5.9PB液將菌苔洗下，配成10%(V/V)的懸液。 水浴中煮沸1h，迅速冷卻至4，4 000r/min離心20min，去沉淀。 以1mol/LHCl將上清液調(diào)pH至3.03.5，然后4 000r/min離心30min。 沉淀以pH5.9PB溶解，然后12 000r/min離心20min。 上清液加4.7倍量的95%酒精，充分混合后，.4 000r/min離心20min。 沉淀(可直接凍干為粗提SPA制品)加PH7.4PBS液溶解，12 000r/min離心20min。 上清液即為粗提SPA液。 Sephadex G100過柱，上樣后用0.05mol/L p

12、H7.4 PBS液洗脫，流速控制在每管2ml3ml/20min，收集流出液。 測OD275nm值及用對(duì)流免疫電泳檢測每管的活性，將有活性的各管合并、濃縮或凍干。2溶菌酶消化法 將培養(yǎng)的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L TrisHCl緩沖液配成10%15%的懸液。 按20:1(W/W)的量加入SPA菌液與溶菌酶(活力為1萬U/mg蛋白)37水溶攪拌24h。 置4冷卻后，以12 000g離心30min。 取上清，調(diào)pH值至7.0。 加硫酸銨，邊加邊攪拌，使溶液呈80%的飽和度，4過夜。 12 000g離心30min。 以少量蒸餾水將沉淀溶解。 透析或過Sephadex G50除鹽，即為粗

13、制的SPA制品。（二）SPA的純化1DEAESephadex A25離子交換層析法 用0.1mol/L NH4HCO3緩沖液平衡DEAESephadex A25柱。 加樣后，用0.1mol/L NH4HCO3緩沖液洗脫12h14h。 改用0.4mol/L NH4HCO3緩沖液洗脫，流速0.15ml0.2ml/min，收集流出液，測OD275nm。 測SPA活性(以對(duì)流免疫電泳)，能與人及豬正常血清產(chǎn)生沉淀線的各管合并。 濃縮或凍干保存。2Sphadex G100凝膠過柱法裝柱、加樣，以0.05mol/L pH7.4 PBS洗脫，收集洗脫液，如上法測定活性和蛋白含量。3親和層析法(1) 豬IgG

14、的制備：取正常豬血清，硫酸銨提取球蛋白，再過DEAE纖維素32柱，制得純化的IgG，以0.1mol/L NaHCO3液平衡，配成4mg5mg/ml溶液。(2) 偶聯(lián)：將固體溴化氰1.2g溶于20ml蒸餾水中，傾入容積為15ml的Sepharose4B中，攪拌，同時(shí)滴加2mol/L NaOH使pH維持在11.0，反應(yīng)8min，用500ml預(yù)冷的0.1mol/L NaHCO3在2號(hào)砂芯漏斗上洗脫已活化的Sepharose4B(在90Sec內(nèi)洗脫完畢)，迅速加入IgG液15ml，于4緩慢攪拌過夜，次日以PBS充分洗滌，至洗出液OD280nm0.02為止。加入30ml 1.0mol/L乙醇胺洗柱，以封

15、閉殘余活性基團(tuán)，再以PBS洗至中性為止。(3) PBS親和層析：將粗制SPA溶于PBS液中，加入IgGSepharose4B柱，流速0.2ml/min，以PBS洗至OD280nm0.02為止，換用0.1mol/L pH2.3甘氨酸鹽酸緩沖液洗脫，流速0.2ml/min，收集洗脫液，即為純化的SPA，對(duì)流電泳檢查SPA活性，收集，濃縮，保存。（三）純化SPA的鑒定用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定，只出現(xiàn)一條沉淀帶為純品。據(jù)報(bào)道，常出現(xiàn)一條雜蛋白染色帶。以親和層析法提純的純度高。三、SPA菌協(xié)同凝集試驗(yàn)基本原理 由于SPA能與IgG的Fc片段非特異性結(jié)合，同時(shí)不影響Fab片段的活性,所以當(dāng)帶有SPA的金黃

16、色葡萄球菌與抗體混合，再加入適量的相應(yīng)抗原，結(jié)果會(huì)使出現(xiàn)的凝集反應(yīng)更易于觀察。它對(duì)顆粒性抗原和可溶性抗原抗體反應(yīng)都有協(xié)同凝集作用。此方法簡便、快速、便于推廣應(yīng)用。（二）材料與試劑1金黃色葡萄球菌(1) SPA陽性株：NO.1800株(國內(nèi)分離株)比Cowan株(國際標(biāo)準(zhǔn)株)更為優(yōu)越，在加熱過程中，不易出現(xiàn)自家凝集，更適用于協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)。(2) SPA陰性株：Wood 46株。2試用菌種 炭疽桿菌、枯草桿菌及蠟樣芽胞桿菌。3炭疽免疫血清。4正常免疫血清。5培養(yǎng)基。60.01Mol/L pH 7.4 PBS液，0.1%NaN3的0.01Mol/L pH7.4 PBS液，0.5%福爾馬林的0.01M

17、ol/L pH 7.4 PBS液。7生理鹽水。8磁力攪拌器等。（三）操作方法1將N0.1800株接種瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)20h24h。2以少量生理鹽水洗下菌體，4 000r/min離心20min。3將沉淀的菌體用0.01mol/L pH7.4 PBS液洗3次，然后用含0.5%福爾馬林的0.01mol/L pH 7.4PBS液制成10%(V/V)懸液，置室溫下3h。4將懸液56水浴30min，離心，用PBS液洗2次。最后用含0.1%NaN3的PBS液制成10%懸液，即為SPA菌穩(wěn)定液，置4冰箱備用。5將SPA懸液1ml(如從冰箱拿出，可再用PBS液洗一次)，加滅活的炭疽陽性血清0.1ml，

18、3730min。64 000r/min離心20min，去上清，沉淀用PBS液洗2次，最后用含0.1%NaN3的PBS液制成10%懸液，共10ml，此即為SPA菌的凝集用試劑。7取干凈載玻片，用接種環(huán)取1滴已標(biāo)記的SPA凝集用試劑，然后再從瓊脂斜面上取少量待試細(xì)菌，充分混合，2min內(nèi)紀(jì)錄結(jié)果。8對(duì)照組的設(shè)置(1) SPA陰性菌標(biāo)記免疫血清對(duì)照。(2) SPA陽性菌標(biāo)記正常血清對(duì)照。(3) SPA穩(wěn)定液與炭疽桿菌凝集對(duì)照。(4) 抗炭疽血清與炭疽菌凝集對(duì)照。(5) 其它芽胞桿菌凝集試驗(yàn)對(duì)照。（四）結(jié)果判定強(qiáng)度以“”表示： 2min內(nèi)，菌體凝集成大顆粒，液體透明。 ： 2min內(nèi)，菌體凝集成較大顆

19、粒，液體透明。 ： 2min內(nèi)，菌體凝集成較小顆粒，液體輕度透明。 ： 2min菌體部分凝集成細(xì)小顆粒,液體混濁。 ：2min內(nèi)，無凝集現(xiàn)象，或2min以上才能出現(xiàn)細(xì)小顆粒者。四、SPA 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（SPA-ELISA）(一) SPAELISA技術(shù)原理SPA 能天然地與人及某些哺乳動(dòng)物的IgG分子上的Fc片段結(jié)合，一個(gè)分子的SPA可以同2個(gè)IgG分子以化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合(這不是真正的免疫反應(yīng)，又稱為假免疫反應(yīng))，利用這個(gè)特性，以SPA代替IgG抗體而應(yīng)用于ELlSA中。(二) 材料與試劑1SPAHRP結(jié)合物,可向有關(guān)生物制品廠購買，也可自制，制法如下：(1) 取5mg HRP(RZ=3.0)

20、溶于1ml新配制的0.3mol/L pH8.1 NaHCO3液中。(2) 加入0.1ml用無水乙醇配制的1%的1熒光2，4二硝基苯，室溫(20)溫和攪拌1h。(3) 加入1ml0.16mol/L 乙二醇，室溫?cái)嚢?h。(4) 以0.01mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液充分透析。(5) 加入經(jīng)0.01mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液平衡的SPA 5mg/ml，于20溫和攪拌2h3h。(6) 加入5mg KBH4，混勻后，4放置3h。(7) 以0.05mol/L pH 7.4 PBS透析過夜。(8) 過Sephadex G100柱(100cm2cm)，以0.5mol/L pH7.4 PBS液

21、洗脫，流速10ml/h。(9) 測OD403nm，集SPAHRP活性部分。(10) 將高活性組分合并，加入甘油(含30%)置低溫保存。也可以采用過碘酸鈉法，制法如下：5mg HRP溶于1ml新配制的0.3mol/L pH 8.1的NaHCO3液中；加入無水乙醇配制1%1熒光2,4二硝基苯0.1ml，室溫混合1h；加入1ml0.6mol/L NalO4(蒸餾水配制)室溫中混合30min；加入1ml0.6mol/L乙烯乙二醇(蒸餾水配制)，室溫緩慢混合1h；以0.01mol/L pH9.6 NaHCO3緩沖液于4透析過夜；加入透析液平衡的SPA液5mg/ml,室溫緩慢混合3h即可。(11) SPA

22、HRP活性測定：取豬血清IgG10g/ml 0.1ml包被反應(yīng)板，4過夜，33min沖洗；加入適量稀釋的SPAHRP溶液0.1ml，置372h，沖洗33min；加入底物顯色，顯色的深淺應(yīng)與SPAHRP的活性成正比。2稀釋液 0.05Mol/L pH7.4PBS液。3包被液 pH9.6碳酸鹽緩沖液。4洗滌液 0.02Mol/L7.4TrisHCl緩沖液。5底物溶液 pH 5.6磷酸鹽檸檬酸緩沖液：0.2mo l/L Na2 HPO4(28.40g/L) 25.70ml0.1mol/L 檸檬酸(19.20g/L) 24.30mlH2O 50.00ml用前加40mg鄰苯二胺,溶解后加30%H2O20

23、.15ml。6終止液 2mol/L H2SO4 1滴。（三）操作方法1檢測抗體 包被：用pH9.6碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋成50g100g/ml，每孔加0.1ml，37感作2h后置4過夜。 洗滌：以pH 7.4 TrisHCl液洗滌33min。 加樣：用pH 7.4PBSTween液稀釋被檢樣品，每孔0.1ml，37感作2h。 洗滌33min。 加SPA SPA經(jīng)pH7.4 PBSTween液稀釋后，每孔加入0.1ml，3730min。 洗滌33min。 加底物：每孔加底物0.1ml，置室溫15min(避光)，再加2mol/L H2SO40.05ml(1滴)終止反應(yīng)。2檢測抗原 包被：以抗體包被

24、,此抗體必須用SPA不能結(jié)合的那些動(dòng)物的lgG,否則會(huì)因?yàn)镾PA同包被抗體結(jié)合而產(chǎn)生假陽性結(jié)果,包被條件同上。 洗滌。 加樣。 洗滌。 加抗體：此抗體必須選用能與SPA結(jié)合的動(dòng)物IgG，否則可因?yàn)镾PA不能同此層抗體結(jié)合而發(fā)生假陰性結(jié)果。 洗滌。 加SPA。 洗滌。 加底物及終止反應(yīng)。3檢測培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)病毒抗原 蓋玻片培養(yǎng)單層細(xì)胞。 接種易感病毒。 用甲醇固定細(xì)胞。 加抗血清于蓋玻片上,37孵育1h。TrisHCl液33min洗滌。 將PPA滴加在蓋玻片上,37孵育30min。 洗滌33min。 將蓋玻片置底物溶液中,室溫15min。 以pH7.4 TrisHCl液稍加沖洗后即可鏡檢。(四) 結(jié)

25、果判定1檢測抗體或抗原 眼觀判定：在對(duì)照組成立的前提下,和標(biāo)準(zhǔn)陽性孔相近顏色者,均判為陽性()。 酶標(biāo)儀測定：以空白對(duì)照孔調(diào)零，標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品校正至某一規(guī)定值，測定待測孔，當(dāng)待測孔OD值或計(jì)算值達(dá)某一規(guī)定閾值時(shí)，判為陽性。2檢測培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)抗原 鏡下觀察，凡細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒者，判為陽性。（五）注意事項(xiàng)1目前使用的聚苯乙烯塑料板對(duì)抗體的吸附性能較好,，因此對(duì)于抗原，特別是大分子(分子量100萬)的抗原應(yīng)該進(jìn)行一些適當(dāng)?shù)奶幚?如DNA,應(yīng)將其事先凍融，使其變成較小分子再包被，如脂蛋白則應(yīng)改變包被的溫度，可在37包被過夜。2由于SPAELISA的敏感性極高，因此也很容易出現(xiàn)非特異性顯色,排

26、除非特異性顯色的方法除了純化抗原抗體外，還應(yīng)該注意：抗原包被后，再以牛血清白蛋白包被一次或稀釋液中加入1%的牛血清白蛋白均可，以占據(jù)未包被的一些空隙。檢測血清抗體時(shí)，需事先檢測大標(biāo)本量的正常血清效價(jià)水平，在檢測待檢標(biāo)本時(shí)，減去正常的血清效價(jià)。ELISA法加入標(biāo)記物后往往37孵育2h，SPA同IgG的結(jié)合不是免疫反應(yīng)，而是一種化學(xué)反應(yīng)，一般認(rèn)為，這種結(jié)合可能在極短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生,所以加PPA后，孵育時(shí)間可以縮短到0.5h。孵育過久，反而可因?yàn)镾PA本身吸附到反應(yīng)板上，造成非特異性顯色。3疊氮鈉對(duì)SPA顯色影響較大，所以在SPA-ELISA過程中，不宜加疊氮鈉做防腐劑，在組織細(xì)胞培養(yǎng)固定，也不適宜用甲醛固定，而需采取甲醇或乙醇。五、SPA提取IgG(一) 原理 將SPA偶聯(lián)至Sepharose4B上后，利用親和層析來提取人和某些動(dòng)物的IgG，這樣可以省去制備