生物技術(shù)概論：第六講(2)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)

1、植物體細(xì)胞雜交技術(shù)1植物體細(xì)胞雜交的意義 有性雜交是植物遺傳改良的一種傳統(tǒng)手段。 作用空間：主要限于種內(nèi)的品種之間。 種及種以上分類(lèi)單位之間的雜交，例如種間或?qū)匍g雜交，則常常遭遇有性不親和性障礙。2 在無(wú)性繁殖植物和性不育植物中，如在馬鈴薯、甘薯、木薯、甘蔗和香蕉中，更是難以通過(guò)有性雜交進(jìn)行遺傳改良。 因此，建立在原生質(zhì)體全能性基礎(chǔ)上的體細(xì)胞雜交和胞質(zhì)雜交技術(shù)，對(duì)于植物的遺傳改良具有重要的意義。3體細(xì)胞雜交（somatic hybridization): 在離體條件下通過(guò)兩個(gè)親本體細(xì)胞原生質(zhì)體的融合以及隨后將融合產(chǎn)物培養(yǎng)成雜種植株的過(guò)程。 1972年，Carlson首次獲得粉藍(lán)煙草和郎氏煙草的

2、細(xì)胞雜種，這也是第一個(gè)植物體細(xì)胞雜種。 4 1978年梅爾徹斯(Melchers)等首次獲得了番茄和馬鈴薯的屬間體細(xì)胞雜種“Potamato”。 56去掉細(xì)胞壁原生質(zhì)體融合7 白菜甘藍(lán)8 體細(xì)胞雜交步驟：1 原生質(zhì)體的制備2 原生質(zhì)體的融合3 雜種細(xì)胞選擇4 雜種細(xì)胞培養(yǎng)5 由愈傷組織再生植株6 雜種植株的鑒定9雜交的兩個(gè)細(xì)胞用纖維素酶、果膠酶處理細(xì)胞壁原生質(zhì)體、經(jīng)離心、振動(dòng)、電刺激用聚二乙醇（）誘導(dǎo)融合后的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁雜種細(xì)胞脫分化細(xì)胞分裂愈傷組織雜種植株再分化（植物體細(xì)胞融合完成的標(biāo)志）植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)102 原生質(zhì)體融合2.1自發(fā)融合2.2 誘發(fā)融合2.2.1 NaNO3處

3、理2.2.2 高PH-高濃度鈣離子處理2.2.3 PEG（聚乙二醇）處理2.2.4 電融合112 原生質(zhì)體融合2.1自發(fā)融合 在酶解細(xì)胞壁的過(guò)程中，有些相鄰的原生質(zhì)體能彼此融合形成同核體(homokaryon)，每個(gè)同核體包含240個(gè)核。 形成的原因：由不同細(xì)胞間胞間連絲的擴(kuò)展和粘連造成的。 減少自發(fā)融合的措施：在用酶液處理之前，使細(xì)胞受到強(qiáng)烈的質(zhì)壁分離藥物的作用，切斷胞間連絲。 122 原生質(zhì)體融合 2.2 誘發(fā)融合 2.2.1 NaNO3處理 1909年，Kuster在一個(gè)發(fā)生了質(zhì)壁分離的表皮細(xì)胞中，低滲NaNO3溶液可以引起2個(gè)亞原生質(zhì)體的融合。 缺點(diǎn)：異核體(heterokaryon)

4、形成頻率不高。 132 原生質(zhì)體融合 2.2.2 高PH-高濃度鈣離子處理 1973年，Keller和Melchers，用強(qiáng)堿性(PH10.5)的高濃度鈣離子（50mmol.L-1)溶液在37下處理約30min，兩個(gè)品系的煙草葉肉原生質(zhì)體很容易融合。 但對(duì)于有些原生質(zhì)體系統(tǒng)，這樣高的PH值是有毒的。 142 原生質(zhì)體融合 2.2.3 PEG(聚乙二醇)處理 PEG的作用機(jī)理： Kao等認(rèn)為，由于PEG分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質(zhì)體之間形成分子橋，其結(jié)果是使原生質(zhì)體發(fā)生粘連進(jìn)而促使原生質(zhì)體的融合。 另外，PEG能增加類(lèi)脂膜的流動(dòng)性，

5、也使原生質(zhì)體的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。152 原生質(zhì)體融合 2.2.3 PEG(聚乙二醇)處理 PEG作為融合劑的優(yōu)點(diǎn): 異核體形成的頻率高，可重復(fù)性強(qiáng)，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞低毒； 形成雙核異核體的頻率高。162 原生質(zhì)體融合 2.2.3 PEG(聚乙二醇)處理 據(jù)Burgess和Flenming（1974年）報(bào)道： 在37下用高鈣離子的強(qiáng)堿性溶液處理時(shí)，產(chǎn)生的聚集體 很大，每個(gè)包含很大原生質(zhì)體。 以PEG為融合劑時(shí)，多數(shù)聚集體包含23個(gè)原生質(zhì)體。172 原生質(zhì)體融合 2.2.3 PEG (聚乙二醇)處理融合基本過(guò)程 182 原生質(zhì)體融合 2.2.3 PEG(聚乙二醇)處理 注意事項(xiàng)： PEG的分

6、子量 （MW 15006000） 酶溶液濃度 原生質(zhì)體來(lái)源 PEG的稀釋逐步進(jìn)行 在PEG溶液中，加入鈣離子可以提高融合效率） 192 原生質(zhì)體融合 2.2.3 PEG(聚乙二醇)處理 高溫（3537） 4%5%（V/V）的原生質(zhì)體懸浮液 所用酶種類(lèi)和濃度，一般用崩潰酶。 材料預(yù)培養(yǎng) 融合地點(diǎn)（在離心管中，在小液滴中） 在PEG溶液中的保溫時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)降低異核體形成頻率。202 原生質(zhì)體融合 2.2.4 電融合 將一定密度的原生質(zhì)體懸浮液置于一個(gè)融合小室中，小室兩端有電極，在不均勻的交變電場(chǎng)的作用下，原生質(zhì)體彼此靠近，在兩個(gè)電極間排列成串珠狀。這時(shí)，如果有足夠強(qiáng)度的電脈沖，就可以使質(zhì)膜發(fā)生可逆性

7、電擊穿，從而導(dǎo)致融合。 21兩個(gè)電極間串珠狀原生質(zhì)體2223 細(xì)胞電融合儀242.3 融合產(chǎn)物的細(xì)胞學(xué) 在膜融合以后的數(shù)小時(shí)內(nèi)，2個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)混在一起，形成一個(gè)雙核異核體。 在雙親親緣關(guān)系較近的異核體中，兩個(gè)核有可能同步進(jìn)行第一次有絲分裂，而且在這個(gè)過(guò)程中，二者的染色體被一個(gè)共同的紡錘體所牽引，在有絲分裂末期形成兩個(gè)雜種子細(xì)胞。最終分化出體細(xì)胞雜種，其核內(nèi)具有雙親的染色體組。252.3 融合產(chǎn)物的細(xì)胞學(xué) 在雙親親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)的雜種細(xì)胞中，兩個(gè)來(lái)源不同的染色體組常常不能完全結(jié)合在一起。 在動(dòng)物體細(xì)胞雜種細(xì)胞系中，已知雙親之一的染色體會(huì)逐漸消除，在植物中也看到這種現(xiàn)象。263 雜種細(xì)胞的選擇系統(tǒng)

8、3.1 根據(jù)物理特性選擇3.2 突變互補(bǔ)選擇3.3 根據(jù)生長(zhǎng)和再生能力的差別選擇273.1 根據(jù)物理特性選擇3.1.1 根據(jù)可見(jiàn)標(biāo)志選擇 主要用于非綠色原生質(zhì)體與含有葉綠體的原生質(zhì)體的融合。（半綠半白）3.1.2 根據(jù)熒光標(biāo)記選擇 將2種原生質(zhì)體群體分別用不同的熒光染料標(biāo)記，然后通過(guò)熒光顯微鏡鑒別異核體。3.1.3 低密度植板選擇 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行追蹤選擇。 283.2 突變互補(bǔ)選擇3.2.1 隱性突變互補(bǔ)選擇3.2.2 顯性抗性互補(bǔ)選擇3.2.3 隱性突變與野生型互補(bǔ)選擇3.2.4 顯-隱性雙突變體選擇 293.3 根據(jù)生長(zhǎng)和再生能力的差別選擇3.3.1 根據(jù)愈傷組織生長(zhǎng)差別選擇3.3.2 植株再

9、生能力的差別選擇3.3.3 根據(jù)生長(zhǎng)和分化對(duì)培養(yǎng)基要求的差別選擇303.3 根據(jù)生長(zhǎng)和再生能力的差別選擇3.3.1 根據(jù)愈傷組織生長(zhǎng)差別選擇 在曼陀羅和煙草種間體細(xì)胞雜交以及在小麥和某些其他禾谷類(lèi)植物屬間體細(xì)胞雜交中，發(fā)現(xiàn)雜種愈傷組織表現(xiàn)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象，因此融合處理后只要挑選生長(zhǎng)快、長(zhǎng)的最大的愈傷組織，就會(huì)從中分化出體細(xì)胞雜種。 313.3 根據(jù)生長(zhǎng)和再生能力的差別選擇3.3.2 植株再生能力的差別選擇 不同來(lái)源的原生質(zhì)體分化再生植株的能力不同。 在體細(xì)胞雜交中，只要有一個(gè)親本的原生質(zhì)體能夠再生植株，融合產(chǎn)生的雜種細(xì)胞就能再生植株。 323.3 根據(jù)生長(zhǎng)和再生能力的差別選擇3.3.3 根據(jù)生長(zhǎng)和

10、分化對(duì)培養(yǎng)基要求的差別選擇 不同來(lái)源的原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分和激素的要求不同。 設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基只有雜種細(xì)胞能夠生長(zhǎng)。334 胞質(zhì)雜交和胞質(zhì)雜種 有性雜交，細(xì)胞質(zhì)基因組來(lái)源于母本。體細(xì)胞雜交，雜種有兩個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)基因組。胞質(zhì)雜種(cybrid): 兩種來(lái)源不同的核外遺傳成分（細(xì)胞器）與一個(gè)特定的核基因組結(jié)合在一起。核質(zhì)雜種(nucleo-cytoplasmic hybrid): 一個(gè)親本的細(xì)胞核與另一個(gè)親本的細(xì)胞質(zhì)基因組結(jié)合。 344 胞質(zhì)雜交和胞質(zhì)雜種獲得胞質(zhì)雜種的方法： 常先把異種胞質(zhì)供體物種原生質(zhì)體的核滅活，然后再將它與異種胞質(zhì)受體物種的原生質(zhì)體融合。通過(guò)射線輻照滅活胞質(zhì)供體細(xì)胞核胞質(zhì)體和原

11、生質(zhì)體的融合 354 胞質(zhì)雜交和胞質(zhì)雜種 通過(guò)射線輻照滅活胞質(zhì)供體細(xì)胞核 阻止沒(méi)融合的胞質(zhì)供體細(xì)胞的分裂，細(xì)胞核部分或完全失活。 阻止沒(méi)融合的受體細(xì)胞的分裂 胞質(zhì)體和原生質(zhì)體的融合 利用細(xì)胞質(zhì)供體細(xì)胞的去核原生質(zhì)體與受體親本的完整原生質(zhì)體融合。 365 體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定5.1 形態(tài)和育性鑒定5.2 細(xì)胞學(xué)和分子細(xì)胞學(xué)鑒定5.3 生化鑒定5.4 分子生物學(xué)鑒定375 體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定5.1 形態(tài)和育性鑒定 株型、葉形、花形，莖、葉茸毛的有無(wú) 或多或少有雙親的特點(diǎn) 育性取決于雙親親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，雜種或是育性很低，或是完全不育。 385 體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定 5.2 細(xì)胞學(xué)

12、和分子細(xì)胞學(xué)鑒定 通過(guò)確定雜種染色體數(shù)和染色體形態(tài)395 體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定 5.3 生化鑒定 同工酶譜分析法： 將體細(xì)胞雜種的同工酶譜與其雙親的酶譜比較： 雜種植株的酶譜可能是雙親酶譜帶的總和 可能只出現(xiàn)雙親的部分酶帶 或缺少雙親的某些酶譜而出現(xiàn)新的譜帶。 405 體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種的鑒定 5.4 分子生物學(xué)鑒定 RAPD (Random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA) AFLP ( Amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性) SRAP(sequence-related amplified polymorphism,序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性) SSR （Simple sequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)） 416 體細(xì)胞雜種在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用6.1 對(duì)無(wú)性繁殖植物或性不育植物進(jìn)行遺傳重組 對(duì)2個(gè)不能進(jìn)行有性繁殖的物種之間實(shí)現(xiàn)遺傳重組，體細(xì)胞融合目前看來(lái)是唯一途徑。 性不育植物（單倍體、三倍體和非整倍體），融合后產(chǎn)生可育的二倍