15：15-15：35 陳長(zhǎng)蘭-微波法蟲(chóng)草素提取

1、 微波法與超聲破碎法提取蛹蟲(chóng)草菌絲體中蟲(chóng)草素的比較研究 Comparison of the Extration of Cordycepin from Cordyceps militaris by Ultrasonic and Microwave method 黃子琪，賁松彬 1所從事研究方向一.分子生物學(xué)方面:1.動(dòng)物硒蛋白的細(xì)胞定位和分子功能研究.主要在研課題有:國(guó)家自然基金課題(30671176) ,果蠅硒蛋白G-rich的細(xì)胞定位和分子功能研究2.食藥用真菌的富硒和有效成分研究.主要在研課題有:遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2009S046)；蛹蟲(chóng)草液體培養(yǎng)提高菌絲體及培養(yǎng)液中蟲(chóng)草素含量配

2、套技術(shù)研究.2 1 硒的作用 硒是哺乳動(dòng)物自身不可缺少的一種微量元素，硒具有多重生物學(xué)功能，人和動(dòng)物的多種疾病被證實(shí)與硒缺乏密切相關(guān)，硒和維生素E都是抗氧化劑，二者相輔相成，硒參與甲狀腺激素代謝、抗氧化系統(tǒng)使機(jī)體發(fā)揮正常免疫功能。缺硒會(huì)引起如衰老組織硬化、肝壞死、發(fā)生克山病，大骨節(jié)病、精神萎靡不振，精子活力下降，易患感冒生長(zhǎng)遲緩等10 (近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)缺硒與許多常見(jiàn)的慢性病有關(guān)，如引發(fā)心肌病、心肌衰竭疾病、癌癥、HIV 感染等11 。3 2 硒蛋白的分類(lèi)、分布及功能 研究證實(shí)，硒以?xún)煞N形式存在于蛋白質(zhì)中，一種是以富硒植物和富硒微生物為代表，通過(guò)隨機(jī)取代蛋白質(zhì)中的硫的形式進(jìn)入蛋白質(zhì)，所形成的蛋白質(zhì)

3、叫做含硒蛋白12、13（Se-containing protein），這一類(lèi)蛋白質(zhì)往往沒(méi)有確定的生理功能。 另一種是硒以一套高度特化的編碼和合成機(jī)制合成蛋白質(zhì)，利用三個(gè)終止密碼子之一的UGA 作為密碼子，通過(guò)以硒代半胱氨酸（Sec）的形式進(jìn)入到蛋白質(zhì)中，所形成的蛋白質(zhì)叫做硒蛋白（Selenoprotein），這類(lèi)硒蛋白在生物體內(nèi)具有特定的生理功能。因此有人認(rèn)為Sec被認(rèn)為是生物體內(nèi)的第21種氨基酸 。4 在已知的哺乳動(dòng)物硒蛋白中大多可以分成六大類(lèi)：碘甲腺原氨酸脫氫酶（ID）家族、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）家族、硫氧還蛋白還原酶（TR）、硒蛋白P （Se-P）、硒代磷酸合成酶（SPS）和

4、硒蛋白W （Se-w）。 5 在已知的哺乳動(dòng)物硒蛋白中大多可以分成六大類(lèi)：碘甲腺原氨酸脫氫酶（ID）家族、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）家族、硫氧還蛋白還原酶（TR）、硒蛋白P （Se-P）、硒代磷酸合成酶（SPS）和硒蛋白W （Se-w）。 6在參會(huì)的另一篇論文蛹蟲(chóng)草富硒條件優(yōu)化及硒對(duì)其中主要活性成分的影響賁松彬，黃子琪，王 瑩，侯 瀟，陳長(zhǎng)蘭 發(fā)現(xiàn)在最優(yōu)化富硒培養(yǎng)條件下，菌絲體中兩種主要藥用活性成分：蟲(chóng)草多糖和蟲(chóng)草素，其含量分別為226.3mg/g和2.22mg/g，是非富硒菌絲體中的3.4倍和5.8倍，能大幅提高蛹蟲(chóng)草的藥用價(jià)值，為富硒可促進(jìn)蟲(chóng)草多糖和蟲(chóng)草素等活性成分增加的機(jī)理研究提

5、供一定的理論依據(jù)。 本論文側(cè)重于對(duì)從蛹蟲(chóng)草中提取蟲(chóng)草素條件的研究. 7目 錄一.蛹蟲(chóng)草與蟲(chóng)草素簡(jiǎn)介二.蟲(chóng)草素提取方法的研究現(xiàn)狀三.微波法與超聲破碎法簡(jiǎn)介四.微波法提取蟲(chóng)草素的單因素實(shí)驗(yàn)五.微波法提取蟲(chóng)草素的正交試驗(yàn)六.超聲破碎法提取蟲(chóng)草素的單因素實(shí)驗(yàn)七.超聲破碎法提取蟲(chóng)草素的正交試驗(yàn)八. 微波提取法和超聲波提取法的比較8一.蛹蟲(chóng)草與蟲(chóng)草素簡(jiǎn)介9 冬蟲(chóng)夏草和蛹蟲(chóng)草是近年來(lái)食藥用真菌中的研究熱點(diǎn)之一.它們都具有提高人體免疫力和抗癌抗氧化等重要生理功能.其主要藥用成分都是蟲(chóng)草多糖和蟲(chóng)草素. 50年代即從蛹蟲(chóng)草人工培養(yǎng)液的菌絲中分離出蟲(chóng)草素(Cordycepin) ，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-脫氧腺苷(3-De

6、oxyadenosine)。 蟲(chóng)草素是一種具有抑制細(xì)胞分裂作用和抗生素作用的生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抑菌、抗瘧原蟲(chóng)、抑制病毒、防治心腦血管疾病、增強(qiáng)免疫等功能。由于蟲(chóng)草素為具有重要藥用價(jià)值的生物活性物質(zhì)，近年來(lái)對(duì)于它的研究受到廣泛重視。 : : 10二.蟲(chóng)草素提取方法的研究現(xiàn)狀 蟲(chóng)草素溶于水、熱乙醇、甲醇，所以一般采用水、乙醇或甲醇等作為溶劑提取蟲(chóng)草素。 目前常用的提取方法有：浸提法、超聲法、索氏提取法和回流法和微波提取法。傳統(tǒng)的提取方法如浸提法、索氏提取法和回流法存在著耗時(shí)長(zhǎng)、被提取成分損失大、工序多不利于下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行、提取效果一般等缺點(diǎn) 11三.蟲(chóng)草素的高效液相色譜測(cè)定分別稱(chēng)取0.20

7、g蛹蟲(chóng)草菌絲體干粉，加入100ml超純凈水，調(diào)節(jié)pH值為5、6、7、8、9，采用微波功率為500W提取3min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮至50ml，濃縮液濾紙過(guò)濾，上清液過(guò)0.2nm微孔濾膜，濾液靜置一夜，10000r/min離心5min，經(jīng)過(guò)超聲清洗后進(jìn)高效液相色譜柱檢測(cè)蟲(chóng)草素提取率。12三.蟲(chóng)草素的高效液相色譜測(cè)定1.6.1 蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)液的配制 準(zhǔn)確稱(chēng)取蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)品0.0050g，超純水溶解定容至10.0ml，配制成500mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再將其稀釋成10、20、30、50、70、100g/ml蟲(chóng)草素標(biāo)準(zhǔn)液，待測(cè)定?；貧w方程為：y=-58391.8720930233+58011.315

8、1162791.x ,相關(guān)系數(shù) r0.99971.6.2 蟲(chóng)草素的HPLC 測(cè)定色譜條件：色譜柱Waters Nova-pak C18 4.6mm 250mm，5m；流動(dòng)相為超純水-乙腈；流速1.00ml/min；柱溫為35；檢測(cè)波長(zhǎng)260nm；進(jìn)樣20l。梯度洗脫。13四.微波法提取蟲(chóng)草素單因素實(shí)驗(yàn)1. 不同提取液pH值的提取效果pH=5.0 、pH=6.0的酸性浸提液和pH=9.0、pH=8.0堿性提取液明顯提高蟲(chóng)草素的浸出率。 采取方式：首先確定提取液適宜pH，其次提取溶劑，其次提取時(shí)間、其次功率。14四.微波法提取蟲(chóng)草素單因素實(shí)驗(yàn)2.不同提取溶劑的提取效果 從表4 可知，當(dāng)以微波輔助提

9、取時(shí)，當(dāng)提取溶劑為乙醇時(shí)蟲(chóng)草素的提取得率明顯的比提取溶劑為純凈水時(shí)要低。在水與乙醇以不同比例混合為提取溶劑的實(shí)驗(yàn)中，水和乙醇比例為1:3時(shí)提取效果最好。表4 不同提取溶溶劑的提取效果數(shù)據(jù)表Table 4 Extraction ratio of different solvents 提取液 水 乙醇 水:乙醇=1:1 水:乙醇=1:3 水:乙醇=3:1蟲(chóng)草素得率(mg/g)1.357 1.242 1.279 1.447 1.20715四.微波法提取蟲(chóng)草素單因素實(shí)驗(yàn)3.不同提取時(shí)間的提取效果 表5 不同處理時(shí)間的提取效果數(shù)據(jù)表 Table 5 Extraction ratio of differe

10、nt extraction time提取時(shí)間(min) 1 2 3 4 5 蟲(chóng)草素得率(mg/g) 1.303 1.486 1.668 1.497 1.324從表5 可以看出，用500w微波處理時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲(chóng)草素的提取率逐步增長(zhǎng)，若繼續(xù)延長(zhǎng)處理時(shí)間蟲(chóng)草素的提取率有小幅回落。其中微波爐功率為500W，提取3.0min時(shí)蟲(chóng)草素提取效果最好。 16四.微波法提取蟲(chóng)草素單因素實(shí)驗(yàn)4.不同微波功率的提取效果 2.1.4 不同功率的提取效果表6 不同處理功率的提取效果數(shù)據(jù)表Table 6 Extraction ratio of different microwave power微波功率 300

11、W 500W 1000W蟲(chóng)草素得率(mg/g) 1.570 2.431 2.031從表6 中可以看出，在微波提取中，功率為500W時(shí)蟲(chóng)草素的提取得率較另兩個(gè)功率下的蟲(chóng)草素含量提取得率明顯要高?？梢?jiàn)提取時(shí)間為3.0min，微波功率為500W提取效果最佳。17五.微波法提取蟲(chóng)草素正交實(shí)驗(yàn)表11 微波法提取蟲(chóng)草素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 11 Analysis of orthonogal design for microwave extraction 實(shí)驗(yàn)號(hào) 提取液pH值 提取液 微波功率 提取時(shí)間 蟲(chóng)草素得率 (W) (min) (mg/g)1 5 水 300w 1 1.1672 5 水:

12、乙醇=1:3 500w 2 1.6483 5 水:乙醇=1:1 1000w 3 0.9374 7 水 500w 3 1.6005 7 水:乙醇=1:3 1000w 1 1.2916 7 水:乙醇=1:1 300w 2 1.2017 9 水 1000w 2 0.7138 9 水:乙醇=1:3 300w 3 1.2659 9 水:乙醇=1:1 500w 1 1.199K1 3.752 3.480 3.633 3.657K2 4.092 4.204 4.447 3.562K3 3.177 3.337 2.941 3.802R 0.915 0.867 1.506 0.240 18五.微波法提取蟲(chóng)草素正

13、交實(shí)驗(yàn)從表11極差R分析結(jié)果可知：微波法R值由大到小依次為微波功率，提取溶液的pH值，提取溶劑和提取時(shí)間。從正交分析表直觀(guān)分析可以看出，各因子單因素的不同水平中， 分別以A2(pH7.0) 、B2(水：乙醇=1：3) 、C3 (500w)、D3(3min)水平的極差最大，為最優(yōu)水平，但其組合A2B2C2D3 未包括在參加試驗(yàn)的9個(gè)組合為此， 加做一個(gè)該組合處理， 測(cè)得蟲(chóng)草素含量為1.731mg/g，證明該組合確實(shí)優(yōu)于組合2和4。19六.超聲波法提取蟲(chóng)草素單因素實(shí)驗(yàn)1. 不同提取液pH值的提取效果pH=5.0 、pH=6.0的酸性浸提液和pH=9.0、pH=8.0堿性提取液明顯提高蟲(chóng)草素的浸出率

14、。 表7 不同提取液pH值的提取效果數(shù)據(jù)表Table 7 Extraction ratio of different solvent pH提取液pH值 5 6 7 8 9蟲(chóng)草素得率(mg/g) 1.117 0.714 0.479 1.423 1.40120六.超聲波法提取蟲(chóng)草素單因素實(shí)驗(yàn)2.不同提取液的提取效果 從表8 可以看出，乙醇作為提取溶劑的提取效率反而比純凈水要低，水和乙醇比例為1:3時(shí)提取效果最好。超聲波破碎法中水和乙醇比例為1:3的混合溶劑提取效果最佳，此點(diǎn)與微波法相似。 表8 不同提取溶液的提取效果數(shù)據(jù)表 Table 8 Extraction ratio of different

15、 solvents提取液 水 乙醇 水:乙醇=1:1 水:乙醇=1:3 水:乙醇=3:1蟲(chóng)草素得率(mg/g) 1.214 1.119 1.207 1.231 1.20121六.超聲波法提取蟲(chóng)草素單因素實(shí)驗(yàn)3.不同提取時(shí)間的提取效果 表9 不同處理時(shí)間的提取效果數(shù)據(jù)表Table 9 Extraction ratio of different extraction time提取時(shí)間(min) 20 25 30 35 40 蟲(chóng)草素得率(mg/g) 1.117 1.211 1.347 1.225 1.119 從表9 可以看出，當(dāng)超聲波功率為600W處理時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲(chóng)草素的提取率逐步增長(zhǎng)，

16、若繼續(xù)延長(zhǎng)處理時(shí)間蟲(chóng)草素的提取率有小幅回落。其中提取時(shí)間為30min時(shí)蟲(chóng)草素提取效果最好。 22六.超聲波法提取蟲(chóng)草素單因素實(shí)驗(yàn)4.不同微波功率的提取效果從表10 中可以看出，800W時(shí)超聲破碎法提取蟲(chóng)草素含量測(cè)定值最大。從表10 中可以看出，800W時(shí)超聲破碎法提取蟲(chóng)草素含量測(cè)定值最大。 表10 不同處理功率的提取效果數(shù)據(jù)表 Table 10 Extraction ratio of different ultrasonic power超聲功率（W） 200 400 600 800 1 000 蟲(chóng)草素得率(mg/g) 1.102 1.119 1.123 1.323 1.207 23七.超聲波法

17、提取蟲(chóng)草素正交實(shí)驗(yàn)表12 超聲破碎法提取蟲(chóng)草素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Table 12 Analysis of orthonogal design for ultrasonic extraction 實(shí)驗(yàn)號(hào) 提取液pH值 提取液 超聲波功率 提取時(shí)間 蟲(chóng)草素得率 (W) (min) (mg/g)1 5 水 400 25 0.854 2 5 水:乙醇=1:3 600 30 1.2353 5 水:乙醇=1:1 800 35 1.3974 7 水 600 35 1.435 5 7 水:乙醇=1:3 800 25 1.119 6 7 水:乙醇=1:1 400 30 1.2217 9 水 800 30 1

18、.2238 9 水:乙醇=1:3 400 35 1.2259 9 水:乙醇=1:1 600 20 1.117 K1 3.486 3.512 3.301 3.090K2 3.775 3.579 3.787 3.739K3 3.565 3.735 3.739 4.057R 0.289 0.223 0.486 0.967 24七. 超聲波法提取蟲(chóng)草素正交實(shí)驗(yàn)從表12極差R分析結(jié)果可知：超聲破碎法R值由大到小依次為提取時(shí)間、超聲波功率、提取溶液的pH值和提取溶劑。從正交分析表的直觀(guān)分析可以看出，各因子單因素的不同水平中， 分別以A2(pH7.0) 、B3(水：乙醇=1：1) 、C2 (600W)、D3(35min)水平的極差最大，為最優(yōu)水平，但其組合A2B3C2D3 未包括在參加試驗(yàn)的9個(gè)組合為此， 加做一個(gè)該組合處理， 測(cè)得蟲(chóng)草素含量為1.447mg/g，證明該組合確是優(yōu)于組合4和3。25八. 微波提取法和超聲波提取法的比較 根據(jù)以上確定的微波法和超聲波法提取的最佳提取條件，即微波法的處理組合為A2(pH7.0) 、B2(水:乙醇=1:3) 、C3 (500w)、D3(3min)，超聲波