豬瘟兔化弱毒細(xì)胞苗生產(chǎn)工藝

1、豬瘟兔化弱毒細(xì)胞苗生產(chǎn)工藝（內(nèi)蒙古通遼岳泰集團(tuán)付海江028000）一、 細(xì)胞培養(yǎng)1、 制苗用細(xì)胞牛睪丸細(xì)胞或羊腎細(xì)胞。2、 生長培養(yǎng)液目前的細(xì)胞培養(yǎng)液為乳漢（歐）液，或MEM10%新生牛血清+1%雙抗（青/鏈霉素），pH7.07.2左右。3、 維持液目前的維持液為乳漢（歐）液，或MEM25%新生牛血清+1%雙抗（青/鏈霉素），pH7.47.6。4、 細(xì)胞生長良好的幾個注意事項1）制苗用細(xì)胞應(yīng)選用非豬瘟疫區(qū)，無口蹄疫、粘膜病等傳染病地區(qū)的14日齡健康小公?；?0日齡以內(nèi)的健康羔羊。其家H健康生長的2）培養(yǎng)基和血清的質(zhì)量可靠、穩(wěn)定。應(yīng)確保無外源病毒、支原體、細(xì)菌等污染，無牛病毒性腹瀉病毒（BVDV

2、）及其抗體。用于生產(chǎn)豬瘟細(xì)胞苗的牛血清都要事先檢測有無BVDV中和抗體的存在。3）制備原代牛睪丸細(xì)胞時，防止細(xì)胞消化過度。4）合適、營養(yǎng)豐富的細(xì)胞培養(yǎng)基。豐富的營養(yǎng)成分對細(xì)胞的生長、帶毒狀態(tài)維持和毒價的提高有直接影響。5）轉(zhuǎn)瓶的洗滌應(yīng)遵循嚴(yán)格的清洗程序。轉(zhuǎn)瓶洗滌不干凈，容易導(dǎo)致細(xì)胞不貼壁生長。二、 病毒感染、維持和收獲生產(chǎn)用毒種有脾毒和細(xì)胞毒，脾毒是用選擇定型熱反應(yīng)兔脾臟冷凍或凍干保存制備的；細(xì)胞毒是將用新鮮脾毒制成0.3%0.5%的病毒懸液接種生長良好的牛睪丸細(xì)胞或羊腎單層細(xì)胞，取二收、三收的細(xì)胞培養(yǎng)液作為生產(chǎn)用毒種。脾毒應(yīng)選擇兔體反應(yīng)在36小時之前，同時防止脾毒采集過程的污染。該病毒不產(chǎn)生

3、細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，可連續(xù)多次收液。取已形成良好單層的牛睪丸細(xì)胞（或羊腎細(xì)胞），棄去培養(yǎng)液，接種含3%5%細(xì)胞毒種或0.2%0.3%脾毒種的維持液。接毒后4或5日第一次收獲換液，以后每46日收獲換液1次，可連續(xù)1215收左右，有的廠家可收更多。一般來說，1215收前的毒價合格率高，疫苗質(zhì)量好。接毒時，細(xì)胞生長狀態(tài)的好壞影響細(xì)胞產(chǎn)毒。也可對細(xì)胞帶毒分散，分散比率1：4左右，可增加收次和產(chǎn)量。將檢驗合格的病毒培養(yǎng)液和5%蔗糖脫脂牛奶穩(wěn)定劑按一定比例混合，分裝，進(jìn)行凍干。三、 病毒特征1、 豬瘟病毒（HCV）感染細(xì)胞超薄切片的電子顯微鏡觀察表明，該病毒顆粒在膜結(jié)合的胞漿內(nèi)空胞中裝配并成熟，然后經(jīng)

4、胞外釋放。2、 56處理60分鐘或6010分鐘可滅活細(xì)胞培養(yǎng)液中的HCV。HCV在pH510時穩(wěn)定，pH5.2時最適宜生長，但在低于pH4或高于pH11時快速滅活。3、 豬瘟病毒的抗原性和血清學(xué)與牛粘膜/病毒性腹瀉病毒(MD/BVDV)密切相關(guān)，兩者同源性很高，能互相誘導(dǎo)一定程度的同源病毒抗體，細(xì)胞或培養(yǎng)液中若存在牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)及其抗體，可與豬瘟病毒發(fā)生中和反應(yīng)，造成疫苗生產(chǎn)的失敗。四、 病毒收獲液毒價不高的可能原因如果病毒收獲液毒價不高，即病毒家兔感染量（RID）較低，制成的疫苗易造成免疫失敗。豬瘟疫苗生產(chǎn)中毒價不高的可能原因：1）細(xì)胞培養(yǎng)液（乳漢液）營養(yǎng)不足，尤其是使用高壓滅

5、菌液，高溫可使一些營養(yǎng)成分損失，造成細(xì)胞生長狀態(tài)不良；2）細(xì)胞培養(yǎng)液較多存在外源病毒，尤其是牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）會直接造成病毒滴度降低；3）成熟釋放的病毒在維持液中耐受性較差，造成病毒滴度較低；4）病毒毒種毒力較低，并在傳代過程中弱化。舊規(guī)程要求每1 ml病毒原液含病毒50,000個家兔感染量（RID）方可配苗，現(xiàn)要求提高至每1 ml含病毒500,000個家兔感染量。所以，提高疫苗單位毫升病毒量是提高疫苗質(zhì)量的關(guān)鍵，進(jìn)行豬瘟疫苗生產(chǎn)工藝的改進(jìn)或者濃縮疫苗，顯得非常必要、急迫?！靖健浚河貌煌瑒┝康腃株苗免疫豬，證實免疫劑量與保護(hù)水平密切相關(guān)。我國豬瘟細(xì)胞苗出廠檢驗以5萬倍稀釋能致兔體熱反

6、應(yīng)為合格，即每毫升原液含5萬RID。規(guī)定的免疫劑量為150RID（37PD50）。劑量不足時，攻毒后不能阻止強毒在體內(nèi)復(fù)制和帶毒。免疫劑量提高到80100PD50（約320400RID），攻毒后能制止亞臨床感染，所有耐過豬均不帶毒。目前歐洲為消滅HC亞臨床感染，多采用加大免疫劑量的方法。歐洲藥典規(guī)定用C株疫苗免疫時，肌肉注射劑量為100PD50（400RID）。五、 豬瘟疫苗生產(chǎn)工藝改進(jìn)的幾點考慮1、 使用化學(xué)成分明確的細(xì)胞培養(yǎng)基化學(xué)成分明確的細(xì)胞培養(yǎng)基一方面能提供足夠的營養(yǎng)，供細(xì)胞生長，同時避免動物來源成分（如由水解乳蛋白）帶來外源病毒（如BVDV）及其抗體的污染。2、 使用低血清細(xì)胞培養(yǎng)基

7、，減少血清使用量，提高細(xì)胞維持時間清大天一有適合細(xì)胞培養(yǎng)生長的低血清MEM（MD611）細(xì)胞培養(yǎng)基，可使血清使用量減少50左右，減少了外源因子污染的幾率；并且由于該細(xì)胞培養(yǎng)基營養(yǎng)成分較傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)基豐富，可提高細(xì)胞活力水平，增加細(xì)胞維持時的營養(yǎng)供給。3、 使用改良的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞使用多層轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞可使單位體積溶液內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量增加，一方面提高了細(xì)胞密度，病毒增殖數(shù)量較大；另一方面也對病毒液進(jìn)行了濃縮，提高了病毒原液的病毒量。4、 盡量減少水解乳蛋白的批間差，防止疫苗生產(chǎn)過程的不穩(wěn)定情況。5、 使用質(zhì)量保證的牛血清血清是牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）的主要來源，使用質(zhì)量可靠、無外源病毒的血清可減少此類污染。6