中藥材鞣質(zhì)含量測(cè)定

1、中藥材中鞣質(zhì)含量測(cè)定方法的研究與優(yōu)化摘要：參照藥典，采用磷鉬鎢酸-干酪素比色法，以沒食子酸為對(duì) 照測(cè)定五倍子、地榆藥材中鞣質(zhì)的含量。探討藥典中規(guī)定的條件合理 性，并增加了超聲條件優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)，平均加樣回收率為97.39%。本 法可快速、準(zhǔn)確地用于中藥材中鞣質(zhì)的含量測(cè)定，并可作為鞣質(zhì)提取 工藝的優(yōu)化方案。關(guān)鍵詞：鞣質(zhì)測(cè)定;波長(zhǎng)；室溫浸提；干酪素；沒食子酸；超聲鞣質(zhì)又稱單寧(Tannins),是一類復(fù)雜的具有沉淀蛋白質(zhì)性質(zhì)的 水溶性多元酚類化合物，廣泛存在于植物藥材，如五倍子、貫眾、兒 茶等。近年來，對(duì)鞣質(zhì)生理活性的研究方興未艾。研究表明，鞣質(zhì)能清 除生物體內(nèi)過剩的自由基，維護(hù)細(xì)胞膜的流動(dòng)和蛋白質(zhì)的

2、構(gòu)象，防止 輻射誘發(fā)的DNA斷裂，從而在抑制脂質(zhì)過氧化、心血管病、抗癌、 抗突變、抗衰老、抗白內(nèi)障等方面有獨(dú)特功效。鞣質(zhì)的經(jīng)典含量測(cè)定 方法有很多種，如重量法、容量法、比色法等。最常用的有皮粉法、 高錳酸鉀法、干酪素法、絡(luò)合量法。皮粉法是國際公認(rèn)的鞣質(zhì)含量測(cè) 定方法。皮粉的主要成分是蛋白質(zhì)，鞣質(zhì)可通過分子中的酚羥基與蛋 白質(zhì)的酰胺基形成氫鍵而結(jié)合成不溶于水的沉淀，以重量法測(cè)定含量。中國藥典一部1鞣質(zhì)含量測(cè)定法一直沿用皮粉法，適用范圍廣。 缺點(diǎn)是耗用樣品多，測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)，且沒有選擇性，測(cè)定結(jié)果偏高，而 且皮粉用量很大。近年來，皮粉試劑的供應(yīng)和質(zhì)量都很難保證,使皮粉 法的應(yīng)用受到很大限制。英國藥典2

3、002版2鞣質(zhì)測(cè)定法附錄采 用的是磷鉬鎢酸-皮粉比色法，即利用鞣質(zhì)在堿性溶液中將磷鉬鎢 酸還原產(chǎn)生深藍(lán)色，其吸收度與含量成正比，采用比色法測(cè)定。其中, 以焦性沒食子酸為對(duì)照，測(cè)定總酚和不被皮粉吸附的酚，二者之差計(jì) 為鞣質(zhì)的含量。羅文毓等報(bào)道了改進(jìn)的干酪素法3,其關(guān)鍵步驟是以干酪素代 替皮粉，采用磷鉬鎢酸比色法測(cè)定；藥材樣品提取采用浸泡過夜代替 加熱回流提取等。本文參照英國藥典和干酪素法,重點(diǎn)對(duì)提取方 法、顯色劑、干酪素用量等進(jìn)行了比較，提出了鞣質(zhì)含量測(cè)定方法， 為藥典相關(guān)附錄方法的修訂提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。中國藥典42015 年版2202鞣質(zhì)含量測(cè)定法已為沒食子酸為對(duì)照，測(cè)定測(cè)定總酚和不 被干酪素吸

4、附的酚,二者之差計(jì)為鞣質(zhì)的含量。并且同時(shí)進(jìn)行干酪素 吸附空白試驗(yàn)，計(jì)算時(shí)扣除空白值。實(shí)驗(yàn)為避光操作。4本研究對(duì)中藥主要的化學(xué)活性成分一鞣質(zhì)提取工藝的優(yōu)化，有利 于地榆資源進(jìn)一步的開發(fā)、利用，并為中藥材有效成分的富集提供理 論依據(jù)。并改進(jìn)鞣質(zhì)含量測(cè)定方法。1儀器與試劑18系列紫外可見分光光度計(jì)【2007（C）北京普析通用儀器有限責(zé)任 公司】；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）。 鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、無水碳酸鈉;磷酸、鹽酸、干酪素、鞣酸 （分析純）；焦性沒食子酸、沒食子酸對(duì)照品（中國藥品生物制品檢 定所，經(jīng)色譜分析，純度98%，）;五倍子、地榆藥材（購自中藥材 市場(chǎng)）。2

5、實(shí)驗(yàn)方法探究1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇探究取對(duì)照品、總酚和不被吸附的多酚比色液，在4001000nm波 長(zhǎng)測(cè)定，結(jié)果三種比色液均在760nm具最大吸收。繪制不同波長(zhǎng)總 酚比色液吸收曲線和不被吸附的多酚比色液吸收曲線。結(jié)果表明，確定測(cè)定鞣質(zhì)含量最大吸收波長(zhǎng)為760nm。2 供試品溶液制備方法的比較探究5英國藥典2000版鞣質(zhì)測(cè)定法藥材供試液提取方法采用加熱提 取，羅文毓等報(bào)道，鞣質(zhì)遇熱不穩(wěn)定，采用室溫浸提過夜的方法操作 簡(jiǎn)單，提取完全。本試驗(yàn)對(duì)加熱和冷浸提取兩種方法進(jìn)行了比較。分 別測(cè)定次數(shù)5次。冷浸過夜提取測(cè)定含量高于加熱提取法，且操作較 簡(jiǎn)單。結(jié)果表明，測(cè)定鞣質(zhì)含量供試品處理應(yīng)采用室溫浸提過夜的提取

6、 方法。3 吸附劑的比較探究5英國藥典法采用皮粉作為吸附劑測(cè)定不被吸附的多酚類。參考 文獻(xiàn)3干酪素對(duì)鞣質(zhì)的吸附更具專屬性，即可選擇性吸附有生理活 性鞣質(zhì)，而鞣酐等非活性鞣質(zhì)則不被吸附，選擇性較皮粉法高。以鞣酸 為例，試驗(yàn)分別采用皮粉和干酪素為吸附劑，測(cè)定含量。結(jié)果皮粉法 測(cè)定值為81118 %，干酪素法測(cè)定值為62126 %。結(jié)果表明,測(cè)定鞣質(zhì)含量吸附劑應(yīng)為干酪素。2. 4干酪素用量的比較探究試驗(yàn)考察了干酪素的用量對(duì)測(cè)定五倍子鞣質(zhì)含量結(jié)果的影響。干 酪素用量的影響：干酪素不同用量時(shí)測(cè)定含量3次取其平均值，測(cè) 得干酪素用量和對(duì)應(yīng)測(cè)得的含平均值為 下：0.15gT8.26%,0.30g-23.24

7、%，0.45g- 32.72%, 0.60%g- 32.82% , 0.75g-32.62 % ,0.90g- 32.86% 結(jié)果表明，對(duì)于測(cè)定樣品， 三倍取樣量的干酪素用量基本可吸附完全。試驗(yàn)使用干酪素0.6克。 5結(jié)果表明,測(cè)定鞣質(zhì)含量干酪素用量為0.6g。2. 5 對(duì)照品的比較探究5英國藥典2000版鞣質(zhì)測(cè)定法附錄采用焦性沒食子酸為對(duì)照 品，試驗(yàn)表明焦性沒食子酸很不穩(wěn)定，溶液在室溫放置很快變色，必 須新鮮配置使用。考慮到?jīng)]食子酸具有相似的結(jié)構(gòu)和顯色行為，且已 有含量測(cè)定用對(duì)照品，可以作為鞣質(zhì)含量測(cè)定對(duì)照物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)比較了 焦性沒食子酸和沒食子酸分別作為對(duì)照的測(cè)定情況。以鞣酸含量測(cè)定 為例，

8、采用不同對(duì)照物比較測(cè)定結(jié)果：以沒食子酸對(duì)照，測(cè)得含量 平均值為62.26 % ,以焦性沒食子酸對(duì)照，測(cè)得含量平均值為45.45 %。 以沒食子酸對(duì)照，含量值較高。結(jié)果表明,測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)對(duì)照品應(yīng)采用沒食子酸。2. 6超聲輔助的優(yōu)化比較探究62.6.1單因素考察2.6.1.1超聲輔助提取的次數(shù)取干燥的地榆根粉末適量，加入15B/V 的60% C2H5OH，分別提取1、2、3、4、5次，每次60分鐘。提取 物經(jīng)測(cè)定吸光度，計(jì)算含量結(jié)果提取次數(shù)對(duì)的總鞣質(zhì)的提取量有一定 差異，但3、4、5次差異不大，故而選定超聲次數(shù)1、2、3次作為 正交試驗(yàn)考察的因素水平，進(jìn)一步考察超聲輔助提取次數(shù)對(duì)提取的影 響。2

9、.6.1.2超聲輔助提取的時(shí)間取干燥的地榆根粉末適量，加入15B/V 的60% C2H5OH溶液，并依此超聲提取20分鐘、40分鐘、60分鐘、 80分鐘、100分鐘。提取物經(jīng)測(cè)定吸光度，計(jì)算含量結(jié)果表明20分 鐘到60分鐘提取量逐漸上升，故而選定45分鐘，60分鐘，75分 鐘作為正交實(shí)驗(yàn)考察的因素水平，進(jìn)一步考察超聲輔助提取的時(shí)間對(duì) 提取的影響。2.6.1.3溶劑濃度取干燥的地榆根粉末適量，分別加入15B/V的30%、 40%、50%、60%、70%、80% C2H5OH，超聲提取 60 分鐘。提取 物經(jīng)測(cè)定吸光度，計(jì)算含量結(jié)果表明70%、60%C2H5OH提取結(jié)果最 好，故而選定50%、60

10、%、70% C2H5OH溶液作為正交實(shí)驗(yàn)考察的因素 水平，進(jìn)一步考察溶劑濃度對(duì)提取的影響。2.6.1.4溶劑用量取干燥的地榆根粉末適量，分別加入5、10、15、 20、25、30B/V的60%C2H5OH，超聲提取60分鐘。提取物經(jīng)測(cè)定吸 光度，計(jì)算含量結(jié)果表明15B/V的60% C2H5OH提取結(jié)果最好，故而 選擇10、15、20B/V的溶劑用量，作為正交實(shí)驗(yàn)考察的因素水平， 進(jìn)一步考察溶劑用量對(duì)提取的影響。2.6.3 L9 （34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果考察，選擇超聲輔助提取次數(shù)A、超聲輔 助提取時(shí)間B、溶劑濃度C、溶劑用量D為考察的四組因素，采用L9 (34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，

11、確定地榆中總鞣質(zhì)的最佳提取方法為 A3C3B2D2，即為超聲波輔助提取3次，每次60分鐘，溶劑為15B/V 的70%C2H5OH。通過顯著性檢驗(yàn)及方法分析，得出各因素對(duì)地榆中總 鞣質(zhì)提取效果影響的主次順序?yàn)锳CBD。依照正交試驗(yàn)的結(jié)果重復(fù) 試驗(yàn)5次，計(jì)算得RSD為1.74%。結(jié)果表明，測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)最佳提取方法為超聲波輔助提取3次， 每次60分鐘，溶劑為15B/V的70%C2H5OH。2. 7顯色劑的穩(wěn)定性探究加入顯色劑磷鉬鎢酸試液，分別于15min、30min、45min、60min、 75min、90min后測(cè)定吸光度，發(fā)現(xiàn)磷鉬鎢酸顯色30分鐘后反應(yīng)完 全，顯色溶液在3小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果表明

12、，測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)自加入磷鉬鎢酸顯色30分鐘后測(cè)定 吸光度較好。2. 8堿性濃度的優(yōu)化探究藥典規(guī)定，測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)所使用的碳酸鈉堿性溶液的濃度為29%， 溫度為碳酸鈉的溶解度影響較大，且高濃度的碳酸鈉較易析出結(jié)晶， 影響測(cè)定結(jié)果，多采用低濃度碳酸鈉溶液，實(shí)驗(yàn)分別用20%，25%， 29%，35%碳酸鈉測(cè)定結(jié)果，取沒食子酸對(duì)照品溶液(0.05mg/ml)2ml, 進(jìn)行顯示測(cè)定，結(jié)果表明，四者吸光度基本一致。結(jié)果表明，測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)應(yīng)采用20%碳酸鈉。2. 9實(shí)驗(yàn)光照度的探究強(qiáng)光照射會(huì)使顯色體系吸光度下降。結(jié)果表明，測(cè)定鞣質(zhì)含量時(shí)需要使用棕色容量瓶并且避光操作。3方法學(xué)驗(yàn)證1 線性關(guān)系考察本法為標(biāo)準(zhǔn)

13、曲線法，每次測(cè)定5個(gè)均隨行測(cè)定，做3次測(cè)定 數(shù)據(jù)，表示線性關(guān)系情況。2重復(fù)性試驗(yàn)取樣品6份，按正文方法測(cè)定，測(cè)得含量結(jié)果，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié) 果測(cè)定次數(shù)6次對(duì)應(yīng)含量(%)分別為：1- 42.80 2 -41.75 3 -41.02 4 -42.49 5 -42.53 6- 42.743回收率試驗(yàn)取同一樣品4份，分別精密稱取約75mg，置250ml量瓶中，分別 精密加入鞣酸溶液27.09mg (以沒食子酸計(jì)含量為62126 %) 50ml , 加水100ml ,按供試品溶液制備方法制備，并按總酚和不被吸附的多 酚測(cè)定法分別測(cè)定含量，計(jì)算回收率?；厥章试囼?yàn)結(jié)果如下：測(cè)定次數(shù)樣品中含量(mg)加入量(mg

14、)測(cè)得量(mg)回收率(%)133.2627.0959.3796.38234.5627.0960.6696.33333.8527.0960.4798.26434.7027.0961.4198.60平均值 97.39% RSD 值 1.24%4 樣品測(cè)定4.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取沒食子酸對(duì)照品50mg ,置100ml棕色量瓶中，加水溶解 并稀釋至刻度，精密量取5ml,置50ml棕色量瓶中，用水稀釋至刻度， 搖勻，作為對(duì)照品溶液。2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml ,分 別置25ml棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液1ml,再分別加水11m

15、l、 10ml、9ml、8ml、7ml,用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻。以相 應(yīng)的試劑為空白，照分光光度法,30分鐘后，在760nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收 度，以吸收度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3供試品溶液制備取地榆藥材，粉碎，過三號(hào)篩，分別稱取0.15g和0.75g,精密稱定, 置250ml棕色量瓶中，加水150ml,放置過夜，超聲波輔助提取3次， 每次60分鐘，溶劑為15B/V的70%C2H5OH,放冷，用水稀釋至刻度，搖 勻，靜置(使固體物沉淀)，濾過,棄去50ml初濾液，精密量取續(xù)濾液 20ml,置100ml棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。4 測(cè)定4.4.1總

16、酚測(cè)定精密量取供試品溶液2ml,置25ml棕色量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 項(xiàng)下的方法，自“加 入磷鉬鎢酸試液1ml”起，加水10ml,同法測(cè)定 吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)，計(jì)算，即得。4.4.2不被吸附的多酚測(cè)定取供試品溶液25ml，加至已盛有0.6g干酪素的100ml具塞錐 形瓶中，密塞，置30 C水浴中保溫1小時(shí)，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷， 搖勻，濾過,棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2ml,置25ml棕色量瓶中， 照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1ml”起，加水 10ml,同法測(cè)定吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的 量（mg），計(jì)算，即得。4.4

17、.3干酪素吸附空白試驗(yàn)取供純化水25ml ,加至已盛有0.6g干酪素的100ml具塞錐形 瓶中，密塞，置30 C水浴中保溫1小時(shí)，時(shí)時(shí)振搖，取出，放冷，搖 勻，濾過,棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2ml,置25ml棕色量瓶中，照 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加入磷鉬鎢酸試液1ml”起，加水10ml, 同法測(cè)定吸收值,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出空白干酪素的量（mg）。鞣質(zhì)含量二總酚量-（不被吸附的多酚量-空白干酪素的量）（減去水分含量，以干燥品計(jì)算）樣品測(cè)定結(jié)果13.96% 13.72%平均值13.848.0%（藥典規(guī)定）以前的中國藥典鞣質(zhì)含量測(cè)定法一直沿用皮粉法，該法確為 經(jīng)典方法，但專屬性不強(qiáng)，皮粉用量大，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，已不適用 于日常分析測(cè)定。2015年版藥典修訂提出了的新方法，在專屬性和 測(cè)定精密度等方面都有了明顯的提高,試驗(yàn)周期也大大縮短（除樣品 過夜提取外，一般僅需要4小