食品中大腸菌群測定

1、關(guān)于食品中大腸菌群的測定第一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1、了解大腸菌群的定義及食品中大腸菌群測定在食品衛(wèi)生檢驗中的意義。 2、練習并掌握大腸菌群的檢驗方法。 一、 目的第二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、原理1、大腸菌群大腸菌群系指一群在37、24小時能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。第三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月主要由腸桿菌科中埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬的一部分及沙門氏屬的亞屬細菌組成。第四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學

2、意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。食品中大腸菌群數(shù)系以每1g（或mL）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)MPN（themostprobablenumber-簡稱MPN）表示2、測定的意義第五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3大腸桿菌的生物學特性基本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。第六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)

3、作于2022年6月在普通營養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37，在42-44 條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46 。第七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、材料1、食品樣品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點、發(fā)酵調(diào)味品或其他食品。2、陽性對照菌大腸桿菌 第八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月除微生物實驗室常規(guī)滅菌及

4、培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、 均質(zhì)器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、菌落計數(shù)器等。3、儀器設(shè)備第九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST ）肉湯、 煌綠乳糖膽鹽（BGLB ）肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ) 、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH ) 、 1mol/L 鹽酸（HCI ) 。 4、 培養(yǎng)基和試劑第十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第一法 大腸菌群MPN計數(shù)法。第二法 大腸菌群平板計數(shù)法。四、 檢驗方法第十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月試驗

5、流程第十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、樣品的稀釋（1） 固體和半固體樣品稱取25g 樣品，放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000r/min-10000r/min 均質(zhì)1 min-2 min ，或放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min-2 min ，制成1:10 的樣品勻液。第一法 大腸菌群MPN計數(shù)法第十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（2） 液體樣品以無菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10 的

6、樣品勻液。 （3） 樣品勻液的pH 值應在6.5-7.5 之間，必要時分別用1mol/L 氫氧化鈉（NaOH ）或1 mol/L 鹽酸（HCI ）調(diào)節(jié)。第十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（4） 用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1mL無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。第十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（5）、 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成1

7、0倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min 。第十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月每個樣品，選擇3 個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3 管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯）, 361 培養(yǎng)24h2h ，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h 。 2、 初發(fā)酵試驗第十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月記錄在24h 和48h 內(nèi)產(chǎn)氣的LST 肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)

8、氣者則進行復發(fā)酵試驗。第十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月用接種環(huán)從所有48h2h 內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物l環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽( BGLB）肉湯管中，361 培養(yǎng)48h2h ，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。3、 復發(fā)酵試驗第二十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN 表（見附錄B ) ，報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN 值。注意：當檢樣的量與表中的量有增加或減少時，表內(nèi)的數(shù)也應相應減少或增加。 4、 大腸菌群最可能數(shù)（MPN ）的報告第二十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二法 大腸菌群平板計

9、數(shù)法第二十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌0157顯色培養(yǎng)基上的菌落第二十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月在伊紅美蘭乳糖瓊脂（EMB）上 第二十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸菌群在去氧膽酸鈉瓊脂上的典型特征典型菌落為紅色 , 菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為 2-3mm 或更大。 第二十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸菌群在結(jié)晶紫中性紅瓊脂(VRBA)上典型特征 典型菌落為紫紅色 , 菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為 0.5mm 或更大。 第二十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌在MFC瓊脂上的典型

10、特征 第二十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月試驗流程第二十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1、 樣品的稀釋按第一法中的稀釋方法進行。第三十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月（1） 選取2個3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿1mL。同時分別取1mL生理鹽水加入兩個無菌平皿作空白對照。（2） 及時將15 mL-20mL冷至46 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA ）約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL-4mLVRBA 覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36l

11、 培養(yǎng)18h-24h 。2、 平板計數(shù)第三十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 （3） 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15-150 之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm 或更大。2、 平板計數(shù)第三十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 （4）、 證實試驗 從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi)，361 培養(yǎng)24h-48h ，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。2、 平板計數(shù)第三十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6

12、月（5）大腸菌群平板計數(shù)的報告 經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以（3）中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。2、 平板計數(shù)第三十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月例：10-4樣品稀釋液1 mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取 其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10104/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL）。第三十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月國標4789.3的08版與03版主要不同1、名稱更改 以大腸菌群計數(shù)代替原來的大腸菌群測定。2、增加了大腸菌群的平板計

13、數(shù)法和紙片檢測法。3、大腸菌群的MPN法以乳糖為主改為以月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯為主的要培養(yǎng)基的MPN法。4、大腸菌群的MPN法中原“報告每100 ml （或g）大腸菌群的MPN值”改為“報告每1 ml （或1g）大腸菌群的MPN值”。第三十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月比較區(qū)別GB/T4789.38 - 2008大腸桿菌的計數(shù)第三十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月03版流程 第三十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、步驟 取樣及稀釋方法與菌落總數(shù)檢驗方法相同，做成1:10的均勻稀釋液為檢樣。第四

14、十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月同一稀釋度在做菌落總數(shù)測定的同時接種乳糖膽鹽發(fā)酵管，并且用大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種作對照 。第四十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、乳糖發(fā)酵試驗 根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z樣污染程度的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。第四十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管，同時用大腸埃希氏菌和產(chǎn)氣腸桿菌混合菌種混合接種于1支作單料乳糖膽鹽發(fā)酵管對照。第四十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月置361溫箱培養(yǎng)242小時，

15、如所有發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則與對照的混合菌種一起按下列程序進行。 第四十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、分離培養(yǎng) 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別在伊紅美蘭瓊脂（EMB瓊脂）平板上劃線分離。然后置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824小時后取出，觀察菌落形態(tài)，并作革蘭氏染色和證實試驗。 第四十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月可疑菌落特點：具有金屬光澤的深紫黑色菌落；不帶或略帶金屬光澤的菌落；中心色較深的淡紫黑色菌落。第四十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3、證實試驗 在上述平板上挑取可疑大腸菌落12個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置361溫

16、箱培養(yǎng)242小時,觀察產(chǎn)氣情況，凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。第四十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 4、報告 根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。 第四十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、結(jié)果根據(jù)證實大腸菌群的陽性管數(shù)，查MPN檢索表(見附錄)報告每100ml(克)大腸菌群的最可能數(shù)。第四十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、注意事項1、第一步乳糖膽鹽發(fā)酵試驗是樣品的發(fā)酵結(jié)果，不是純菌的發(fā)酵試驗，初發(fā)酵陽性管，經(jīng)過后兩步，有可能成為陰性。只做一步，會有相當多的合格樣品作

17、為不合格處理，應注意。第五十張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌的生長，有利于大腸桿菌的生長繁殖。第五十一張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 3、接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。第五十二張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 4、大腸菌群菌落在EMB瓊脂上大多呈紫黑色有金屬光澤或無金屬光澤。應取典型菌落，如無應多取幾個菌落，以免出現(xiàn)假陽性。 一般平板上有較多的大腸桿菌典型菌落，且革蘭氏染色為陰性，可做出判定。第五十三張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 5、對初發(fā)酵時未產(chǎn)氣的發(fā)酵管有疑問

18、時，可用手輕輕敲動或搖動試管，如有氣泡沿管壁上升，應考慮有氣體產(chǎn)生，做進一步試驗。第五十四張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 6、 MPN檢索表是采用三個稀釋度九管法，較理想的結(jié)果是最低3管為陽性，最高3管為陰性。如無法估測樣品中的菌數(shù)時，應做一定范圍的稀釋度。第五十五張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 7、 MPN檢索表只提供了3個稀釋度，若改用其它濃度時，表內(nèi)數(shù)字應相應增加或減少。第五十六張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月醬油（GB/T2717-2003）細菌菌落總數(shù)： 30000cfu/ml大腸菌群： 30MPN/100ml腸道致病菌： 不得檢出第五十七張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月全脂奶粉、脫脂奶粉（GB5410-1999） 特級 一級 二級細菌菌落總數(shù)：20000 30000 50000（cfu/ml）大腸菌群 40 90 90（MPN/100g）腸道致病菌： 不得檢出 不得檢出 不得檢出第五十八張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月巴氏殺菌乳（GB5408.1-1999）細菌菌落總數(shù)： 30000cfu/ml大腸菌群： 90MPN/100ml腸道致病菌： 不得檢出第五十九張，PPT共六十二頁，創(chuàng)作于2022年6月生活飲用水衛(wèi)生標準（GB