酶結(jié)構(gòu)和功能

1、關(guān)于酶的結(jié)構(gòu)與功能第一張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶的發(fā)現(xiàn)及研究歷史人們對酶的認(rèn)識起源于生產(chǎn)與生活實踐。夏禹時代，人們掌握了釀酒技術(shù)。公元前12世紀(jì)周朝，人們釀酒，制作飴糖和醬。春秋戰(zhàn)國時期已知用麴(曲)治療消化不良的疾病。酶者，酒母也第一節(jié) 酶引論第二張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月enzyme (in yeast)enzyme是希臘文 en = in ， zyme = yeast第三張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月什么是酶？酶是生物催化劑生物體一切生化反應(yīng)都需酶催化才能進(jìn)行！性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人造催化劑定義：由活細(xì)胞產(chǎn)生的、 有高度專一性和 高效催化

2、作用的生物大分子。第四張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、酶是生物催化劑 1.只能催化熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng)； 2.提高反應(yīng)速度，不改變平衡點; 3. 只起催化作用，本身不消耗； 4. 降低反應(yīng)的活化能。 （一）與一般催化劑相同的特點第五張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一般催化劑反應(yīng)活化能反應(yīng)總能量變化酶促反應(yīng)活化能非催化反應(yīng)活化能初 態(tài)終 態(tài)能 量 改 變活 化 過 程酶促反應(yīng)活化能的改變過渡態(tài)第六張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 活化能(activation energy) 指在一定溫度下，1mol底物全部進(jìn)入活化態(tài)所需要的自由能 單位：KJ/mo

3、l酶催化反應(yīng)的實質(zhì)：降低反應(yīng)的活化能第七張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 高效性且無副反應(yīng)反應(yīng)速度是無酶催化/普通人造催化劑催化反應(yīng)速度的1051017倍。（二） 生物催化劑的特點第八張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月鐵屑 肝糜 肝糜(煮) 2 H2O2 2 H2O + O2例：雙氧水裂解第九張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.專一性Specificity: 酶對催化的反應(yīng)和反應(yīng)物有 嚴(yán)格的選擇性。底物（substrate): 酶作用的物質(zhì)。第十張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 （1）酶濃度的可調(diào)性 （2）通過激素調(diào)節(jié)酶活性 （3）反饋

4、抑制調(diào)節(jié)酶活性 （4）抑制劑和激活劑 （5）別構(gòu)調(diào)控、共價修飾、同工酶等 3. 可調(diào)節(jié)性 為P所抑制 A B C D P（終產(chǎn)物） 圖 通過終產(chǎn)物可逆的結(jié)合對途徑中的第1個酶反饋抑制 第十一張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4.反應(yīng)條件溫和（易失活）常溫、常壓、中性5.催化活性與結(jié)構(gòu)有關(guān) 生物固氮：工業(yè)氨合成：N2+3H2 500 ,300大氣壓Fe2NH3第十二張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、酶的化學(xué)本質(zhì)及組成經(jīng)酸堿水解終產(chǎn)物是AA能被蛋白酶水解而失活酶可變性失活酶是兩性電解質(zhì)具有不能通過半透膜等膠體性質(zhì)具有蛋白質(zhì)的化學(xué)呈色反應(yīng)化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)（一）酶的化學(xué)本質(zhì)

5、第十三張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第1個有催化活性的天然RNAribozyme（核酶），以后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑。1995年，Jack W. Szostak 研究室首先報道了具有DNA連接酶活性的DNA片段，稱之為脫氧核酶(deoxyribozyme)，為生物催化劑的發(fā)展作出了新的貢獻(xiàn)。第十四張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月單純酶 ：只有蛋白質(zhì)綴合酶（結(jié)合酶）：脫輔酶 + 輔助因子輔助因子輔基（prosthetic group） 輔酶（coenzyme） 與酶結(jié)合緊與酶結(jié)合松全酶（二）酶的化學(xué)組成根據(jù)酶的組成成份： 第十五張

6、，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月羧肽酶第十六張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月NADPH脫氫酶的輔酶過氧化氫酶第十七張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月綴合酶中： 單獨酶蛋白或輔助因子沒有催化活性一種酶蛋白一般只與一種輔助因子結(jié)合同種輔助因子可與不同的酶蛋白結(jié)合 第十八張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶蛋白：決定反應(yīng)的專一性輔助因子：傳遞電子、原子或某些 化學(xué)基團(tuán)的作用第十九張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月monomeric enzyme：一般由一條肽鏈組成oligomeric e

7、nzyme：為寡聚蛋白，2個亞基multienzyme complex：幾種酶靠非共價鍵 彼此嵌合而成。酶催化將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的一系列順序反應(yīng), 有利于提高酶的催化效率并便于對酶的調(diào)控。 （如糖代謝、脂代謝）（三）單體酶、寡聚酶、多酶復(fù)合體根據(jù)酶蛋白分子的特點：第二十一張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十二張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三、酶的命名和分類（一）習(xí)慣命名法根據(jù)其催化底物來命名；根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名；結(jié)合上述兩個原則來命名，有時在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點。（略講）第二十三張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點 命名簡單應(yīng)

8、用歷史較長，使用方便缺點一名數(shù)酶、一酶數(shù)名為了適應(yīng)酶學(xué)發(fā)展的新情況，國際酶學(xué)會議于1961年提出一個新的系統(tǒng)命名法及分類原則，已被國際生化協(xié)會采用。第二十四張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）國際系統(tǒng)命名法：系統(tǒng)名稱包括底物名稱、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個酶字。第二十五張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 底物1 ：底物2 + 反應(yīng)性質(zhì)+酶 乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：NAD+氧化還原酶當(dāng)?shù)孜餅樗畷r，可省略第二十六張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 系統(tǒng)名：包括所有底物的名稱和反應(yīng)類型。乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳

9、酸：NAD+氧化還原酶 慣用名：只取較重要的底物名稱和反應(yīng)類型。乳酸：NAD+氧化還原酶乳酸脫氫酶對于催化水解反應(yīng)的酶一般在酶的名稱上省去反應(yīng)類型。第二十七張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）國際系統(tǒng)分類編號 1961年國際酶學(xué)委員會（Enzyme Committee, EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把酶分成6大類：第二十八張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十九張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)，催化氫的轉(zhuǎn)移或電子傳遞。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)

10、和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1、氧化還原酶 OxidoreductaseAH2 + B（O2）A + BH2（H2O2，H2O）（四）六大類酶的特征第三十一張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）脫氫酶類：催化直接從底物上脫氫的反應(yīng)AH2 +BA +BH2（需輔酶或輔酶）（2）氧化酶類催化底物脫氫，氧化生成H2O2：AH2 + O2A + H2O2（需FAD或FMN）催化底物脫氫，氧化生成H2O：2AH2 + O22A + 2H2O（3）過氧化物酶ROO + H2O2RO + H2O + O2第三十二張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作

11、于2022年6月（4）加氧酶（雙加氧酶和單加氧酶）O2 +OHOHC=OC=OOHOH（順，順-已二烯二酸）RH + O2 + 還原型輔助因子ROH + H2O + 氧化型輔助因子（又稱羥化酶）第三十三張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個底物的分子上。根據(jù)X分類：轉(zhuǎn)移碳基、酮基或醛基、?；?、糖基、烴基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。2、轉(zhuǎn)移酶 TransferaseAX + BA +BX第三十四張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、

12、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：3、水解酶 hydrolaseAB + H2OAOH + BH第三十五張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月裂合酶催化從底物分子中移去一個基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如， 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。4、裂合酶 Lyase第三十六張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)5、異構(gòu)酶 IsomeraseABPP第三十七張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月合成

13、酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸6、合成酶 Ligase or SynthetaseA + B + ATPAB + ADP +Pi第三十八張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶的系統(tǒng)編號：4位數(shù)字第一位：代表六大類反應(yīng)類型第二位：亞類（作用的基團(tuán)或鍵的特點）第三位：亞亞類（精確表示底物/產(chǎn)物的性質(zhì)）第四位：在亞亞類中的序號乳酸脫氫酶 EC 1. 1. 1. 27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+該酶在亞亞

14、類中的編號第三十九張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月指酶對底物的選擇性，也稱特異性。結(jié)構(gòu)專一性立體專一性絕對專一性相對專一性基團(tuán)專一性鍵專一性旋光異構(gòu)專一性（D-、L-）幾何異構(gòu)專一性(順、反異構(gòu))四、酶的專一性（一）酶的專一性第四十張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月基團(tuán)專一性胰蛋白酶第四十一張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）鎖鑰學(xué)說剛性構(gòu)象（2）誘導(dǎo)契合學(xué)說（3）三點附著學(xué)說 立體異構(gòu)專一性的酶（二）與酶專一性有關(guān)的學(xué)說第四十二張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月鎖鑰學(xué)說認(rèn)為整個酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底

15、物的結(jié)合如同一把鑰匙對一把鎖一樣第四十三張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月“三點結(jié)合”的催化理論酶與底物的結(jié)合處至少有三個點，而且只有一種情況是完全結(jié)合的形式。只有這種情況下，不對稱催化作用才能實現(xiàn)。第四十四張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十五張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月誘導(dǎo)契合學(xué)說酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀. （Koshland，1958）：當(dāng)?shù)孜锖兔附佑|時，可誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象變化，使酶活性中心的各種基團(tuán)處于和底物互補(bǔ)契合的正確空間位置，有利于催化。第四十六張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022

16、年6月第四十七張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）研究酶的專一性的意義 理論上，專一性弱鍵和結(jié)構(gòu)互補(bǔ)成為理解生物大分子之間相互作用的基石。 實踐上也有重要意義。例如，某藥物具有某一種構(gòu)型才有生理效用，而有機(jī)合成的是消旋混合物, 若用酶可以進(jìn)行不對稱合成或不對稱拆分,即得到單一構(gòu)型的藥物。第四十八張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 五、酶的活力測定和分離純化（一） 酶活力與酶促反應(yīng)速度1、酶活力（enzyme activity） 酶活力就是酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力。可以用它催化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示。 酶活力的大小代表酶的量 第四十九張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于

17、2022年6月2.活力單位 (U) 酶單位（U）： 在一定條件下、一定時間內(nèi)、將一定量的 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。如： 每小時催化1克底物 每小時催化1ml某濃度溶液 每分鐘催化1ug底物一定時間一定量底物一定條件下第五十張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 在標(biāo)準(zhǔn)條件下（25 ，最適pH和最適底物濃度）一分鐘內(nèi)催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 1 IU= 1 mol / min 酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)化（1）國際單位（IU）第五十一張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 在標(biāo)準(zhǔn)條件下（25 ，最適pH和最適底物濃度）每秒鐘催化1摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 1 Kat =

18、1 mol/s = 60106 IU = 6107 IU 1IU =（1/60）Kat = 16.7nKat 酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)化（2）Kat第五十二張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月每mg酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)。 U/mg酶蛋白、 U/ml酶蛋白酶產(chǎn)品質(zhì)量評價中常使用，一定程度上代表酶的純度。（3）比活力 (specific activity)比活力越大，酶的純度越高第五十三張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一定條件下：每秒鐘、每個酶分子轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)或每微摩爾酶分子轉(zhuǎn)換底物的微摩爾數(shù)一秒內(nèi)1摩爾的酶可催化幾摩爾的底物 （4）轉(zhuǎn)換數(shù)（turnover number，T

19、N） 反應(yīng)酶的催化活性中心的活性 第五十四張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月用哪一個速度來表示酶促反應(yīng)的速度特征呢？反應(yīng)初速度 Vo逐漸降低酶反應(yīng)進(jìn)程曲線在酶促反應(yīng)開始無任何干擾因素出現(xiàn)時, 短時間內(nèi)酶的反應(yīng)速度。一般指反應(yīng)底物消耗5%以內(nèi)時的反應(yīng)速率 。3. 酶促反應(yīng)速度單位時間內(nèi)底物(S)的減少量或產(chǎn)物(P)的增加量Why?第五十五張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月反應(yīng)速度逐漸降低的原因：底物濃度的降低； 產(chǎn)物的生成逐漸增大了逆反應(yīng)； 酶在反應(yīng)中失活； 產(chǎn)物對酶的抑制 10 20 30 40 50 60 （min）產(chǎn)物生成量酶反應(yīng)進(jìn)程曲線反應(yīng)初速度表示酶活力第五十六

20、張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）酶活力的測定酶反應(yīng)速度的測量測量單位時間內(nèi)底物的消耗量。測量單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量。濃度時間產(chǎn)物P反應(yīng)物S第五十七張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）應(yīng)測反應(yīng)初速度（initial velocity） 底物濃度變化在起始濃度5%以內(nèi)。 （2）酶的反應(yīng)速度一般用單位時間內(nèi)產(chǎn)物的增 加量來表示。 （3）測酶活力時應(yīng)使反應(yīng)溫度、pH、離子強(qiáng)度和底物濃度等因素保持恒定。 （4）測定酶反應(yīng)速度時，應(yīng)使SE。 1、測定酶活力的注意事項 第五十八張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2、 酶活力的測定方法（1）分光光度法（spect

21、rophotometry） 該法要求酶的底物和產(chǎn)物在紫外或可見光部分光吸收不同。 優(yōu)點：簡便、迅速、準(zhǔn)確；一個樣品可多次測定；可檢測到10-9mol/L水平的變化。例: 人血清乳酸脫氫酶活力的測定 L-乳酸 + NAD+ 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸脫氫酶第五十九張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第六十張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）熒光法（fluorometry） 該法要求酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物有熒光變化。 主要的優(yōu)點：靈敏度很高，可測10-12mol/L的樣品。 酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe殘基以及一些輔酶、輔基，如NADH NADPH、FMN、

22、FAD等都能發(fā)出熒光。 例：乙醇 + NAD+ 乙醛 + NADH + H+ 乙醇脫氫酶第六十一張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）酶偶聯(lián)分析法(enzyme coupling assay) 第一個酶的產(chǎn)物為第二個酶的底物，這兩個酶系統(tǒng)在一起反應(yīng)。 P1無光吸收或熒光變化，偶聯(lián)后, P2有光吸收或熒光變化。例：測己糖激酶的活性 葡萄糖 + ATP 葡糖-6-磷酸 + ADP 己糖激酶葡糖-6-磷酸 + NADP 葡糖酸-6-磷酸 + NADPH + H+ G-6-P脫氫酶第六十二張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）電化學(xué)法（electrochemical met

23、hod） 有pH測定法、離子選擇性電極法等。離子選擇性電極法要求在酶反應(yīng)中必須伴隨有離子濃度的變化或氣體的變化（如O2、CO2、NH3等）。 例: 葡萄糖氧化酶活性的測定 葡萄糖+O2+H2O 葡糖酸+H2O2 葡萄糖氧化酶（5）同位素法放射性同位素標(biāo)記底物，經(jīng)酶作用得到相應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)適當(dāng)分離，測定產(chǎn)物脈沖數(shù)即可。 第六十三張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶活力測定實例確定反應(yīng)條件 20、pH=7，底物濃度 6g/l（過量）， 加入2mg固體脂肪酶確定活力單位 每小時催化1克底物 1u= 1g/h 測反應(yīng)初速度 作產(chǎn)物甘油隨時間增加的曲線， 量出反應(yīng)初速度值 ， 換算為脂肪的消耗速

24、度。如 8g/h換算活力 8g/h / 1g/h=8u計算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白脂肪脂肪酶甘油 + 脂肪酸第六十四張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月分離純化方法同蛋白質(zhì)純化類似：1.選材：酶含量豐富的新鮮生物材料2.細(xì)胞破碎：因材料而異3.抽提：低溫下以水或低鹽緩沖液抽提4.分離及純化：粗分級，細(xì)分級分離5. 結(jié)晶6.保存：低溫下酶粉可長期保存注意低濃度酶溶液易變性（三）酶的分離和純化第六十五張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶的分離純化溶解度的差異鹽析法PEG沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法等電點沉淀法熱穩(wěn)定性的差異熱處理沉淀法第六十六張，PPT共一百一十四頁

25、，創(chuàng)作于2022年6月電荷性質(zhì)的差異離子交換層析法電泳法分子大小和形狀的差異凝膠過濾法超濾法透析法離心法親和力的差異親和層析法疏水作用的差異疏水層析法分配系數(shù)的差異雙水相系統(tǒng)萃取法第六十七張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月由于酶的特殊性，在提純過程中要注意 :1全部操作在低溫04。 2在分離提純過程中，不能劇烈攪拌。 3在提純?nèi)軇┲屑右恍┍Ｗo(hù)劑，如少量EDTA、 少量-巰基乙醇及蛋白酶抑制劑。 4在分離提純過程中要不斷測定酶活力和蛋白質(zhì)濃度，從而求得比活力，還要計算總活力和回收率（得率）。 第六十八張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶的純度：總活力 = 活力單位數(shù)/ m

26、L酶液總體積（ mL） 比活力 = 活力單位數(shù)/ 毫克蛋白純化倍數(shù) = 每次比活力第一次比活力產(chǎn)率%（回收率）= 100每次總活力第一次總活力酶的純化鑒定：聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、分子篩層析等。第六十九張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月衡量分離提純效果的兩個指標(biāo)總活力的回收得率（回收率） 是表示提純過程中酶的損失情況比活力提高的倍數(shù) 是表示提純方法的有效程度第七十張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月酶的分離純化過程中一定要隨時追蹤酶的活性第七十一張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月六、非蛋白質(zhì)生物催化劑核酶（ribozyme) 1982年美國科學(xué)家

27、Altman和Cech研究Tetrahymena thermophiea（ 嗜熱四膜蟲） rRNA前體加工成熟時，發(fā)現(xiàn)具有催化活性（自我剪切功能）的天然RNA。1983年美國S.Altman等研究 E.coli RNaseP（由23%蛋白質(zhì)和77%的RNA組成），發(fā)現(xiàn)RNaseP中的RNA可催化E.coli tRNA的前體加工。 （一）核酶的發(fā)現(xiàn)第七十二張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 1986年，T. Cech又發(fā)現(xiàn) L19 RNA 在一定的條件下能以高度專一性方式催化寡核苷酸底物的切割與連接。 基于Cech和Altman的創(chuàng)造性工作，將這類具有酶一樣的催化功能，本質(zhì)上不是蛋白

28、質(zhì)而是RNA的生物大分子定義為Ribozymes。 該發(fā)現(xiàn)曾被認(rèn)為是生化領(lǐng)域內(nèi)最令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)之一，為此Cech和Altman共同榮獲1989年度諾貝爾化學(xué)獎。第七十三張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月隨后的研究表明： L19RNA具備酶促催化的幾個特征： 高度的底物專一性 遵循Michaelis-Menten動力學(xué) 對競爭性抑制劑的敏感性第七十四張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 (2) 1992年，Piccirilli等發(fā)現(xiàn)L19RNA具有氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。 (3) L19RNA還有限制性內(nèi)切酶作用： -CpUpCpUpN- + G -CpUpCpU

29、+GpN 第七十五張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 (4) 1997年，Zhang和Cech用人造的RNA分子催化合成了肽鏈，表明RNA具有肽基轉(zhuǎn)移酶活性。 (5) 原核生物RNaseP和兔肌1，4- -葡聚糖分枝酶均包括RNA+蛋白組分，起催化作用的都是RNA。第七十六張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）核酶的種類 自我剪切:是轉(zhuǎn)錄后加工方式之一 （self- cleavage） 自我剪接: （self-splicing） I型內(nèi)含子：需要鳥苷和Mg2+參與II型內(nèi)含子：不需要鳥苷的參與剪切與連接催化分子內(nèi)反應(yīng)催化分子間反應(yīng)：按作用底物 如RNase P、L19

30、RNA 第七十七張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月自我剪切核酶包括：發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酶、錘頭結(jié)構(gòu)核酶、丁型肝炎病毒（HDV）核酶等。（1）發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酶由4個螺旋區(qū)和數(shù)個環(huán)狀區(qū)組成 切割活性所需最小長度為50個核苷酸螺旋、決定核酶切割部位的特異性，螺旋配對堿基及其3端的未配對堿基均為切割活性所必需 結(jié)構(gòu)特點第七十八張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月結(jié)構(gòu)特點 三個螺旋 13個保守堿基 剪切點：GUN （2）錘頭結(jié)構(gòu)核酶 （3）HDV核酶和VS RNA 第七十九張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）核酶的研究意義與應(yīng)用前景1、研究意義 突破了生物體內(nèi)所有的“生物催化劑

31、都是蛋白質(zhì)”的傳統(tǒng)觀念；對生命起源這一問題有了新的認(rèn)識 ；從生物進(jìn)化角度來看，生物催化劑從核酶到蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)變，伴隨著生物代謝高效率和生命現(xiàn)象的更趨復(fù)雜。 第八十張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2、應(yīng)用前景 可以設(shè)計出自然界不存在的各種核酶。 核酶基因研究前景誘人，在基因治療領(lǐng)域中倍受青睞，其研究進(jìn)展也相當(dāng)迅速。 第八十一張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶工程就是利用酶的特異催化功能，對酶進(jìn)行修飾改造，并借助生物反應(yīng)器和工藝過程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一項技術(shù)。包括：化學(xué)酶工程：(酶學(xué)+化學(xué)工程技術(shù)) 利用化學(xué)工程手段，改善酶的性能，提高催化效率, 降低成本。包括：天然

32、酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶、人工酶生物酶工程：(酶學(xué)+現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)) 以DNA重組技術(shù)為核心。包括：克隆酶、突變酶等。七、酶工程第八十二張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月化學(xué)酶工程 酶分子表面的修飾，酶分子內(nèi)部的修飾，化學(xué)合成人工酶 。1、微生物發(fā)酵得到粗酶2、對天然酶進(jìn)行化學(xué)修飾、固定化處理， 利用化學(xué)合成等手段來改善酶性能。天然酶 第八十三張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 利用化學(xué)的手段對酶分子上的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行修飾，改善酶的性能，以適用于工業(yè)的應(yīng)用及研究工作的要求。1、酶化學(xué)修飾的基本方法 （1）酶分子側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾 修飾酶的功能基團(tuán)： -NH3、

33、-SH、 -COOH 、咪唑基、酚羥基、吲哚基、胍基、甲硫基等。修飾反應(yīng)：?；磻?yīng)、烷基化反應(yīng)、氧化和還原反應(yīng)、芳香環(huán)取代反應(yīng)等類型。（一）化學(xué)修飾酶第八十四張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 其中水溶性的碳二亞胺類 特定修飾已成為最普遍的標(biāo)準(zhǔn)方法?？梢栽谳^溫和的條件下進(jìn)行，但一定條件下，Ser、Cys和Tyr也可反應(yīng)。羧基的修飾OENZCOCN+HRN+HRENZOCON+NCRRHOENZCXOCN+HRN+HR+ H+pH5HX（鹵素）H+R,R為烷基，HX 為鹵素、一級或二級胺；ENZ為酶第八十五張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 Lys的-NH2可采用烷基化反

34、應(yīng)來修飾。修飾劑包括有乙酸酐、鹵代乙酸、芳基鹵和芳香族磺酸。其中，三硝基苯磺酸（TNBS）是種非常有效的氨基修飾劑。反應(yīng)后在420nm和367nm能夠產(chǎn)生特定的光吸收。氨基的修飾O2NO2NNO2HO3S ENZNH2+pH7O2NO2NNO2NH ENZ第八十六張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 此外，磷酸吡哆醛（PLP）、氰酸鹽、及蛋白質(zhì)測序中用的DNS（丹磺酰氯）、苯異硫氰酸酯（PITC）都可作為修飾劑。ENZNH2+SO2ClN(CH3)2ENZNHSO2N(CH3)2+Cl-H+丹磺酰氯第八十七張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 具有兩個鄰位羥基的化合物。如丁

35、二酮、1，2-環(huán)己二酮、苯異二醛，都是重要的修飾劑。胍基的修飾：ENZNCNH2NH2OO+NCENZNH NHOH OH硼酸鹽NCENZNH NH O OBOH OH第八十八張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 烷基化試劑是一種酶修飾劑，如碘乙酸。修飾產(chǎn)物相當(dāng)穩(wěn)定，易于分析。此外，馬來酸酐、馬來酰亞胺等修飾劑與巰基形成對酸穩(wěn)定的衍生物。 2-硝基苯甲酸（DTNB），與-SH反應(yīng)形成S-S，釋放出一個2-硝基-5-硫苯甲酸陰離子。在412nm處有最大吸收。因而能通過光吸收的變化跟蹤反應(yīng)程度。巰基的修飾5,5-二硫代-（2-硝基苯甲酸（DTNB）ENZNO2COO-SSENZSH+-O

36、OCO2NSSNO2COO-NO2COO-SpH6.8有機(jī)汞試劑（如對氯汞苯甲酸）對巰基專一性強(qiáng)，反應(yīng)物在250nm處有吸收第八十九張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 常用的修飾劑有，焦碳酸二乙酯（DPC）、碘代乙酸，能修飾咪唑基的兩個N原子。NNHENZENZNNCH2COO+ CH3CH2OH + CO2His咪唑基的修飾ONNHENZCOCOOCH2CH3OCH2CH3NNENZOCOCH2CH3+pH4-7ICH2COO-pH5.5第九十張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 Trp殘基一般位于E分子內(nèi)部，而且比-SH、-NH2等一些親核基團(tuán)的反應(yīng)性差。所以一般不與

37、常用的一些試劑反應(yīng)。 N-溴代琥珀酰亞胺（NBS）可以修飾，并通過280nm處光吸收的減少跟蹤反應(yīng)。色氨酸吲哚基的修飾第九十一張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 Tyr的修飾包括-OH和芳環(huán)上的取代修飾，Thr和Ser殘基的-OH都可被酚羥基的修飾劑修飾，但反應(yīng)條件嚴(yán)格些，生成的產(chǎn)物也更穩(wěn)定。 四硝基甲烷（TNM）在溫和條件下可高度專一性地硝化酚羥基生成可電離的發(fā)色基團(tuán)3-硝基酪氨酸，在酸水解條件下穩(wěn)定，可用于氨基酸定量分析。酪氨酸殘基和脂肪族羥基的修飾第九十二張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月甲硫氨酸甲硫基的修飾ENZSCH3+H2O2ENZSCH3H2O+OpH5E

38、NZSCH3+2HCOOHOENZSCH3+OH2HCOHOO約-10過甲酸ENZSCH3+ICH2CNH2OENZS+OpH4CH3CH2CNH2I-甲硫基的化學(xué)修飾碘乙酰胺 甲硫氨酸殘基極性較弱，在溫和條件下很難選擇性修飾。但是由于硫醚的硫原子具有親和性，可以用過氧化氫、過甲酸等氧化成甲硫氨酸亞砜。第九十三張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）酶的化學(xué)交聯(lián) 交聯(lián)劑是具有兩個反應(yīng)活性部位的雙功能基團(tuán)可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間，或酶與其他分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。同型雙功能交聯(lián)劑:兩端具有相同的活性反應(yīng)基團(tuán)。可與氨基反應(yīng)的雙亞氨酸酯是一個典型的同型雙功能交聯(lián)劑。此外，N羥琥珀

39、酰亞氨酯、二硝基氟苯等。異型雙功能交聯(lián)劑：一端與氨基作用，另一端一般與巰基作用。但是用碳二亞胺時，第二個反應(yīng)基團(tuán)是羧基。可被光活化的高交聯(lián)劑：一端與酶反應(yīng)后，經(jīng)光照，另一端產(chǎn)生一個活性反應(yīng)基團(tuán)（自由基）如碳烯或氮烯，它們具有高反應(yīng)性，沒有專一性。第九十四張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月使用雙功能試劑如戊二醛、PEG等可將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈之間進(jìn)行共價交聯(lián)，使酶分子活性結(jié)構(gòu)得以加固，提高其穩(wěn)定性。交聯(lián)酶晶體技術(shù)可以大幅度提高酶的生物活性和熱穩(wěn)定性。并且發(fā)現(xiàn)交聯(lián)晶體在有機(jī)溶劑中的催化活性和穩(wěn)定性提高。例如，糖基化作用于交聯(lián)技術(shù)聯(lián)合使用應(yīng)用于青霉素G?；?，利用葡

40、聚糖二乙醛將青霉素G?；附宦?lián)，55 下半衰期提高9倍，Vmax 不變。此外，絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶等亦可通過交聯(lián)修飾由常溫酶變?yōu)槭葻崦福瑴囟葟?5 提高到76第九十五張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月對修飾劑的要求：修飾劑具有較大的相對分子質(zhì)量，良好的生物相容性；分子表面有較多地反應(yīng)活性基團(tuán)及修飾后酶活的半衰期較長。（3）大分子結(jié)合修飾常用的化學(xué)修飾劑A、糖及糖的衍生物主要有右旋糖酐、右旋糖酐硫酸酯、糖肽、葡聚糖等； B、高分子聚物聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇 （PVA）、聚N 乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸（PAA）等； C、生物大分子常用的有肝素、血漿蛋白、聚氨基酸類等；蛋

41、白質(zhì)或其他大分子物質(zhì)等第九十六張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月大分子多聚物與具有生物活性的大分子物質(zhì)通過共價鍵將大分子連接到酶分子表面，使之在酶的表面形成覆蓋層，從而使酶的性質(zhì)產(chǎn)生改變。大分子在使用前要進(jìn)行活化，方法有：溴化氫法、高碘酸氧化法、疊氮法、三氯均三嗪法等NH2+酶NH2COOHCOOHRN=C=NRCNHOCNH酶OO白蛋白與酶之間以羰二亞胺作為交聯(lián)劑的修飾反應(yīng)（修飾酶）CNH酶酶第九十七張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月分子量在500-20 000 聚乙二醇類修飾劑應(yīng)用最廣，其生物相容性通過FDA認(rèn)證。其分子末端有兩個能被活化的羥基。分子修飾時多采用單甲

42、氧基聚乙二醇（MPEG）MPEG均三嗪衍生物MPEG琥珀酰亞胺類衍生物MPEG氨基酸類衍生物肝素含硫酸酯的粘多糖及適用于用來修飾溶解血栓酶類，增加酶的療效。第九十八張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 酶經(jīng)修飾后會產(chǎn)生各種各樣的變化，概括起來有： (1) 熱穩(wěn)定性提高 修飾劑共價連接于酶分子使其天然構(gòu)象產(chǎn)生一定的“剛性”，并形成分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動，增加穩(wěn)定性； 修飾劑本身增加了酶分子表面的親水性。 (2) 抗各類失活因子的能力提高 修飾劑所產(chǎn)生的空間屏蔽有效的阻擋了各類失活因子； 酶分子中對蛋白質(zhì)水解酶失活因子敏感基團(tuán)被修飾。 (3) 抗原性消除； (4) 體內(nèi)半衰期延長； (5)

43、 最適pH改變； (6) 酶學(xué)性質(zhì)變化； (7) 對組織分布能力改變2、修飾酶的特性第九十九張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3、化學(xué)修飾的局限性(1)某種修飾劑對某一氨基酸的化學(xué)修飾專一性是相對的。(2)化學(xué)修飾后酶的構(gòu)象或多或少都有一些改變，因此這種構(gòu)象變化將妨礙對修飾結(jié)果的解釋。(3)只能在具有極性的氨基酸殘基側(cè)鏈上進(jìn)行，對于維持酶的空間構(gòu)象的其它氨基酸側(cè)鏈，目前還不能用化學(xué)修飾方法研究這些氨基酸殘基酶的結(jié)構(gòu)與功能中的作用。(4)酶的化學(xué)修飾所提供的信息還得用X射線和其他方法來確定。第一百張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4、酶化學(xué)修飾的應(yīng)用醫(yī)藥理論研究生物技術(shù)領(lǐng)

44、域第一百零一張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1、固定化酶的特點: 對溫度機(jī)械強(qiáng)度的穩(wěn)定性高；可以反復(fù)使用 更適合多酶體系2、酶的固定化方法:（1）載體結(jié)合法:將酶結(jié)合于水不溶性載體的一種固定化方法。根據(jù)結(jié)合的方式不同，又可分為物理吸附、離子結(jié)合和共價結(jié)合三種。 *物理吸附：借助非共價鍵把酶吸附到載體上，如活性碳。 *離子結(jié)合：通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體的固定化方法。載體為陰陽離子交換劑、樹脂等。 特點：易制備利用效率高，但酶易流失。 *共價結(jié)合法：通過共價鍵把與酶活性無關(guān)的氨基酸功能基團(tuán)連接在不溶于水的載體上。 特點：結(jié)合牢固，但得率低。(二)固定化酶 (im

45、mobilized enzyme)EEEEE第一百零二張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（2） 包埋法 網(wǎng)格型：將酶包埋于高分子化合物形成的網(wǎng)格中 微囊型：將酶包埋在半透膜中 缺點：孔徑大小影響底物或 產(chǎn)物進(jìn)出（3）交聯(lián)法 通過雙功能試劑或多功能試劑（如戊二醛等）將酶蛋白與酶蛋白中的氨基酸殘基作用，使酶與酶之間交聯(lián)成網(wǎng)，凝集成固定化酶. 常用的是戊二醛彼此交聯(lián)EEEEEEEEEEEEEEE第一百零三張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月固定化酶法生產(chǎn)高果糖漿 也稱果葡糖漿或異構(gòu)糖漿，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液，經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)作用，將其中一部分葡萄糖異構(gòu)成果糖，由葡萄糖和果糖而組成的一種混合糖糖漿。第一百零四張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年6月淀粉 液化、糖化 葡萄糖漿 膜過濾 濃縮 異構(gòu)化 部分變成果糖（42%）混合 濃縮、精制 55%高果糖漿參與的酶：-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、葡萄糖異構(gòu)酶高果糖漿的生產(chǎn)流程 固定化葡萄糖異構(gòu)酶 葡萄糖 果糖 42%高果糖玉米糖漿：215萬噸/年 55%高果糖玉米糖漿：145萬噸/年第一百零五張，PPT共一百一十四頁，創(chuàng)作于2022年