科研立項項目申報書-β-胡蘿卜素提取

1、XXXX大學生科研項目申報書項目名稱：B-胡蘿卜素的提取申請者：XXX申報時間：2009年8月10日項目類別：A類（，） B類（）共青團蘇州科技學院委員會申請簡況表說明：1、必須由申報者本人按要求填寫。2、院（系）推薦意見簽章視為對申報者情況的確認項目名稱B-胡蘿卜素的提取所屬科類理科申請人姓名xxx性別女出月1989 年07月院（系）化學與生物工程學院專業(yè)生物技術年級二年級聯系合作者姓名性別年齡學歷單位備注本科在讀蘇州科技大學()無院 系 認 證是否為我校正式注冊在校的學生（?？粕?、本科生）。（，）是（）否本課題是否為學生課外學術科技作品。（，）是（）否其它：簽章：年 月日目前，全球B -胡

2、蘿卜素的生產量約為600t/a ,年需求量為 12001500 t,且每年以7%9%速度增長。美國的需求量近些 年以10%15的速度遞增。且在歐美和日本等國已形成市場。 2000年中國（3-胡蘿卜素的生產量為10 t ,其中40卿于出口。 2001年我國B-胡蘿卜素的生產能力為22 t,國內B-胡蘿卜素 的總消費量的的70湘于食品工業(yè)，其次用于保健品和醫(yī)藥行業(yè) 1。因（3 -胡蘿卜素可用作食品添加劑，飼料添加劑和化妝品助 劑，且（3-胡蘿卜素在防治癌癥和心血管疾病方面有特殊的作 用，所以，（3-胡蘿卜素越來越引起人們的關注和興趣。目前， 市場上有多種B-胡蘿卜素的生產方法：化學合成法：化學合成

3、法是指采用有機化工原料，通過化 學合成反應，人工合成B-胡蘿卜素的一種方法。項 目 主 要 內 容提取法：即從胡蘿卜、枸杞、馬鈴薯、玉米等天然植物原 料中直接提取B-胡蘿卜素的一種方法。生物合成法：生物合成法是指利用微生物培養(yǎng)技術，通過 微生物的培養(yǎng)，利用微生物在其體內合成 B-胡蘿卜素，然后自 微生物體內分離得到B-胡蘿卜素的一種方法。利用三胞布拉氏 霉菌生產B-胡蘿卜素就是生物合成法的一種。研究表明，采用三胞布拉氏霉菌發(fā)酵生產胡蘿卜素不僅因 其胡蘿卜素合成水平極大高于多種生物體，而且B -胡蘿卜素含量在85%Z上，其結構與標準的（3-胡蘿卜素相同；而且具有生 產原料易獲得，不受自然條件限制

4、，周期短和適用于工業(yè)化生 產等優(yōu)點?？梢源_認三胞布拉氏霉菌是目前應用于工業(yè)生產胡 蘿卜素最重要的菌株。下面就目前狀況對其理化性狀，生理功能以及利用三抱布拉 氏霉菌生產B-胡蘿卜素的方法做一介紹。1 B-胡蘿卜素的理化性狀B-胡蘿卜素，分子式為 C40H56分子量為536.88。深紅紫至 暗紅色有光澤的斜面6面體或板狀微結晶的晶體或結晶性粉末。有輕微異臭或異味。稀溶液呈橙黃色至黃色，濃度增大時帶橙 色因溶液的極性可稍帶紅色。遇氧、熱、光不穩(wěn)定，在弱堿下 較穩(wěn)定。不溶于水、丙二醇、甘油、酸和堿；溶于二硫化碳、2苯、氯仿、己烷及植物油；幾乎不溶于甲醇和乙醇。在人體 和動物的腸黏膜及肝臟中，1分子的（

5、3 -胡蘿卜素在15=15碳原 子位置，通過加氧酶的催化作用下，分裂為2分子的視黃醛，經過還原過程，形成2分子的視黃醛，經過還原過程，形成 2 分子的視黃醇（VQ。3 B -胡蘿卜素的生物提取技術材料與方法菌種與培養(yǎng)基菌種：三胞布拉氏霉菌JM9203（正株）、JM9204（負 株）。培養(yǎng)基：項 目 主 要 內 容PDA斜面培養(yǎng)基：15麻鮮去皮馬鈴薯;2%萄糖；2演脂， PH自然。分裝試管后，0.1Mpa滅菌20min,斜面表面水干后使 用。液體種子培養(yǎng)基：淀粉 4%葡萄糖 2%玉米漿5% KHPO0.1%; MgSQ.01%; VB1mg/100ml;消前 PH6.7,裝量為 40ml/250

6、ml三角瓶，0.1Mpa滅菌20分鐘。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉 4%黃豆餅粉4%玉米漿3% KHPO0.1%; MgS（0.01%;鹽酸硫胺素 10mg/L;滅菌前調 PH7.7, 裝量為50ml/500ml三角瓶，0.1Mpa滅菌40分鐘。補料：在發(fā)酵48h左右添加0.1% （3 -紫羅蘭酮及適量無菌 水。方法碳、氮源實驗：在種子培養(yǎng)基或搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中 改變碳、氮用量比。裝量為40ml/250ml三角瓶，每組設三個重 復，0.1Mpa滅菌40分鐘?！?、-”菌株按5: 5的比例總量10% 接種，于280c 200rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)48h,無菌操作補加0.1% B-紫羅蘭酮。培養(yǎng)至120h終止

7、。培養(yǎng)基正交實驗：在單因素試驗后，確定了培養(yǎng)基 中的四種因素及三個水平按 L排列組合。裝量為50ml/500ml三 角瓶，三個重復。（3 -胡蘿卜素的測定方法：離心收集發(fā)酵液中的菌絲體， 5055oC真空干燥、研磨。有機溶劑提取菌體中的色素14。采用 紫外分光光度計測定最高吸收峰的吸光值，參照方法15測定并計算B-胡蘿卜素的含量。菌種試驗：除種子培養(yǎng)基碳源試驗外，菌種不同性 別發(fā)酵試驗以及種齡試驗均按常規(guī)方法進行。生物量測定：準確量取發(fā)酵液，用雙層紗布過濾， 自來水反復沖洗、擰干、撕成碎片置于平面皿內，5055oC抽真 空干燥，用1/100g精確度天平稱量。試驗結果表明，以4帆碳源較為適宜，生

8、物量和（3-胡蘿卜 素的生產水平都較高。雖然在4癱粉的基礎上再添加1滯萄糖 總色素水平有所提高，但是（3-胡蘿卜素未增加，因而無實際意 義。而且用葡萄糖為種子培養(yǎng)基的碳源培養(yǎng)基質粘性差，不利 于菌絲體伸張，易形成較大的團塊，這樣可能造成種子菌體被 接入發(fā)酵培養(yǎng)基后營養(yǎng)物質的利用不充分。培養(yǎng)基中的氮源對（3-胡蘿卜素的影響由于試驗所采用的氮源均為農、副產品，其營養(yǎng)成分與含 量差異較大，因而不同的氮源物質對B-胡蘿卜素合成水平有很 大的影響。以棉籽仁和黃豆餅粉為主要氮源所組成培養(yǎng)基較為 適宜，而玉米漿與棉籽仁或黃豆餅粉混合使用更有利于提高生 物量和B-胡蘿卜素的生產水平。培養(yǎng)基正交試驗在碳、氮物質

9、因素試驗后，擬定淀粉、黃豆餅粉、玉米漿 以及植物油為影響三胞布拉氏霉菌合成B-胡蘿卜素水平的主要因素設計正交實驗。實驗表明，培養(yǎng)基組合3無論其生物量還是胡蘿卜素水平均高于其它組合，因其碳、氮以及植物油配 較佳所致。影響胡蘿卜素合成水平的主要因素依次為植物油、 淀粉，影響影響較小的應為黃豆餅粉。3.2.2菌種試驗結果菌株的性別：三抱布拉氏霉菌有雄性（+）和雌性 （-）菌株，在相同條件下，單獨發(fā)酵“ +”和“-”株，其類胡 蘿卜素合成水平分別為36.6mg和263.7mg/L發(fā)酵液，而當“ +” “-菌株混合發(fā)酵時，其胡蘿卜素合成水平達1113mg/L發(fā)酵液，這是因“ +”和“-”株混合培養(yǎng)有利于

10、產生促進胡蘿卜素 的三胞酸所起的作用。菌種培養(yǎng)時間：分別采用培養(yǎng) 24、32、40、44和 48h的液體菌種發(fā)酵試驗結果表明，培養(yǎng) 3248h的菌種均可用于發(fā)酵，但培養(yǎng)4044h的菌種更有利于胡蘿卜素的合成。在實驗室條件下，通過對三胞布拉氏霉菌合成（3 -胡蘿卜素、菌種培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵比較實驗，以生物量（每升發(fā)酵液中 菌絲體干重）、類胡蘿卜素和（3-胡蘿卜素合成水平為結果標準， 篩選出適用于發(fā)酵三胞布拉氏霉菌培養(yǎng)基的碳、氮源物質和配 比。同時對植物油的選擇與用量、中間添加（3-紫羅蘭酮也進行 了實驗，證明這些物質均不同程度的影響著三胞布拉氏霉菌合 成B -胡蘿卜素水平，為深入研究三胞布拉氏霉菌的

11、發(fā)酵與B -胡蘿卜素產品研制奠定了基礎16。項 目 主 要 內 容經湖北省衛(wèi)生防疫站食品衛(wèi)生檢測所檢測，急性毒性試驗 所得結果送檢樣品屬實無毒級；小鼠精子畸變試驗，實驗組與 陰性對照結果無顯著差異，表明該受試物的精子畸變實驗為陰 性；小鼠骨髓嗜多染色紅細胞微核試驗，實驗組與對照組的結 果無顯著差異，表明該受試物的微核實驗為陰性。因此證明， 利用三胞布拉氏霉菌發(fā)酵生產出來的 B-胡蘿卜素無污染、無毒 害，可用于大規(guī)模的工業(yè)生產17。結束語B-胡蘿卜素易于氧化，所以不管采用何種設備方法，都必 須防止生產過程中B-胡蘿卜素不必要的損失。針對目前 B-胡 蘿卜素供不應求的狀況，探索出一種成本低、產率高

12、、無污染、 無毒害、適于大規(guī)模工業(yè)生產的制備B-胡蘿卜素的方法非常必 要。B-胡蘿卜素在醫(yī)藥、食品、及保健領域有著很好的應用市場，特別是近年來，隨著癌癥發(fā)病率的升高，B-胡蘿卜素因其有著 特異的功效，所以近年來一直是市場上供不應求的緊俏商品。所以深入對其的認識，大力開發(fā)B-胡蘿卜素的產業(yè)，將推動食 品、醫(yī)藥、飼料、化妝品行業(yè)的發(fā)展，具有很好的市場前景。項 目 的 價 值 和 意 義B-胡蘿卜素是維生素A的重要來源由上述的B-胡蘿卜素的理化性狀可知，1分子的B-胡蘿卜 素在體內酶的作用下可轉變?yōu)?分子的維生素A,且在食物中含 量最豐富，因而被認定是人體內維生素 A的主要來源。通過實 驗發(fā)現2,缺

13、乏維生素A的大鼠補飼（3-胡蘿卜素后能顯著提高 體內維生素A的水平，從而證實了 B -胡蘿卜素能在體內酶的作 用下轉化為維生素A,發(fā)揮2t生素A的作用，所以又稱維生素A 源原。該轉化酶在體內維 A缺乏時將（3-胡蘿卜素轉化為維A, 當體內維A增加到需求量時，酶即停止轉化，從而通過酶的自 動控制來維持體內維 A的的需要。全世界，特別是發(fā)展中國家 人體所需的維A60%70%源于（3 -胡蘿卜素。維A是合成糖蛋白的載體，糖蛋白是細胞的重要結構物質， 尤其是上皮細胞，如果缺少糖蛋白將對眼，呼吸道，皮膚，消 化道，泌尿道及生殖器官產生影響。免疫球蛋白也是一種糖蛋 白，維A缺乏將會影響抗體的形成。因此，維

14、 A對保證正常的 生長和發(fā)育及抗感染具有重要的作用。但是，人體攝入大量的維A,會引起急性及慢性中毒主要是 骨痛，皮膚黏膜改變，顱內壓升高等。而（3-胡蘿卜素本身無毒 性，當攝入大量的（3-胡蘿卜素時體內產生積蓄，但不會引起中 毒3。因此，無論是治療維 A缺乏癥還是防止癌癥，使用（3-胡 蘿卜素都更好，更安全。2.2 （3 -胡蘿卜素是具有抗氧化作用人體在正常的生理代謝過程中會產生少量的含氧自由基， 而體內的防御機制（抗氧化酶或抗氧化劑）會及時將其清除， 以維持氧自由基的代謝平衡。因此一般不會對細胞，組織產生 損傷。但隨著年齡的增長或在某些病理狀態(tài)下，體內抗氧化酶 的作用下降，過多的氧自由基不能

15、被及時清除而堆積在細胞內， 導致它們迅速與機體內的一些生物大分子，如蛋白質、核酸氨 基酸、脂類等發(fā)生反應，生成氧化物或過氧化物。這些物質會 對細胞產生毒性，使細胞膜、組織、酶以及基因受損，從而引 起機體多種疾病的發(fā)生和衰老。B-胡蘿卜素的抗氧化作用是基于它分子中的多個共鈍多 烯雙鍵的特殊結構，這種結構使它能與含氧自由基發(fā)生不可逆 反應，生成非常穩(wěn)定的以碳為中心的自由基 B-car .,這個碳項 目 的 價 值 和 意 義核自由基可以迅速可逆的與氧反應生成一種新的帶鏈的過氧化 自由基B-car-OO .。但這個可逆反應的速率受氧分壓的影響非 常大，當氧分壓降低時，反應就會充分的向碳核自由基的方向

16、 進行，這樣就有效的降低了體內過氧化自由基的濃度，并能及 時阻止自由基的鏈式反應，因此也減少了體內脂質過氧化的數 量。由此可知（3-胡蘿卜素是一種有效的抗氧化劑，類蘿卜素也 因可以清除自由基以及淬滅單線態(tài)氧的活性受到了普遍關注。 日益增加的研究表明與衰老的過程相關聯的多種缺陷是細胞內 的多點位氧化損傷積累的直接后果。例如：心血管疾病的發(fā)病 機理之一是低密度脂蛋白的氧化損傷而導致的；一些光化學對 晶體所造成的損傷的會導致白內障的形成等。而（3-胡蘿卜素的高效抗氧化性能使活性氧變?yōu)榉€(wěn)定的氧分子。荷蘭的一項研究 表明，具有攝取含B-胡蘿卜素這種健康飲食習慣的老人，發(fā)生 心力衰竭的危險性較低?，F已知1

17、分子（3 -胡蘿卜素可抑制1000 個分子的活性氧4,同時還可以作為一種弱氧化劑直接與自由基 反應，阻止自由基的連鎖反應，從而減少它對細胞的損傷。在 探討抗氧化營養(yǎng)對 DNA氧化損傷保護作用時，經研究發(fā)現連續(xù) 服用（3-胡蘿卜素、維生素E和維生素C,可顯著降低由過氧化 氫誘發(fā)DNA勺損傷。2.3 （3 -胡蘿卜素可以促進細胞縫隙間連接 交流B-胡蘿卜素細胞間形成的間隙連接使細胞質相互溝通，通 過交換小分子來調節(jié)代謝反應。間隙連接的基本單位是連接子， 每個連接子由2個相同或相似的跨膜蛋白壓單位環(huán)繞，中心形 成一個直徑約1.5nm的孔道，相鄰細胞質膜上的兩個連接子相 對便形成一個間隙單位。它允許小

18、的代謝物、細胞內信息及離 子自由出入，但蛋白質、mRN屋大分子則被排除在外，以保持 各細胞的遺傳一致性。Bertram等發(fā)現（3-胡蘿卜素和其它類胡 蘿卜素可以加強細胞間隙連接的交流能力，從而抑制或降低癌 癥的發(fā)生或發(fā)展；Yamasaki也指出構成細胞連接通道的連接蛋 白，在轉化階段的癌細胞會由于通道的受阻而干擾細胞的交換， 這種交換是控制生長的因素之一，從而抑制癌癥誘導細胞升級 到惡化階段6。國內外進行了大量的關于B-胡蘿卜素的抗腫瘤機制的研究,認為B-胡蘿卜素抗癌機理有以下幾種：轉化為視黃醇（VA項 目 的 價 值 和 意 義而起作用、抗氧化機制，提高機體免疫力等7.8。多種研究2亦 證實

19、B-胡蘿卜素是細胞間通訊的誘導劑，它能增強轉化癌起始 細胞與健康細胞的交流作用，而且目前研究人員通過熒光燃料 示蹤技術已獲得B -胡蘿卜素增強轉化細胞和末轉化細胞間的 GJIC功能的直接證據，但對于其具體的調節(jié)機理尚不清楚。（3 -胡蘿卜素的可以增強免疫力，提高人體免疫系統抵抗致 癌物的能力免疫系統的兩個主要功能是抵御細菌或病毒的侵染和防止 癌癥的發(fā)生。類胡蘿卜素在增強人體的免疫能力方面具有明顯 的作用。類胡蘿卜素能增加免疫系統中 B細胞的活力，B細胞能 在體內循環(huán)，從而消滅外源入侵的病原體；類胡蘿卜素能提高 淋巴輔助T細胞（CD4的活力，能協助B細胞產生抗體，并能 提高其它免疫組分的活性；類

20、胡蘿卜素能增加嗜中性白血球的 數目，它可以包圍細菌，并分泌包圍細菌的酶；類胡蘿卜素能 增加自然殺傷細胞（NK的數目，以消除機體內被感染的細胞 或癌細胞。目前，已經有很多關于服用類胡蘿卜素對免疫活性 的影響的報道。流行病學的研究結果表明9,高劑量的（3-胡蘿卜素的攝入 與肺癌、胃癌、食道癌、前列腺癌的發(fā)生率間存在著明顯的負 相關；與腸癌的發(fā)生率存在著中度的負相關；而與乳腺癌、膀 胱癌、子宮頸癌、子宮內膜癌的發(fā)生率間的相關性不明顯或存 在著正相關。吃富含（3 -胡蘿卜素的食物可增強生物機體的特異 性及非特異性免疫功能。目前，稱B-胡蘿卜素為腫瘤的化學防預劑，它消除氧自由 基、控制自由基的生成、促進巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子（TNF 和干擾素（IFN）、促進免疫細胞的增殖，