科研立項(xiàng)項(xiàng)目申報(bào)書-β-胡蘿卜素提取

1、XXXX大學(xué)生科研項(xiàng)目申報(bào)書項(xiàng)目名稱：B-胡蘿卜素的提取申請(qǐng)者：XXX申報(bào)時(shí)間：2009年8月10日項(xiàng)目類別：A類（，） B類（）共青團(tuán)蘇州科技學(xué)院委員會(huì)申請(qǐng)簡(jiǎn)況表說明：1、必須由申報(bào)者本人按要求填寫。2、院（系）推薦意見簽章視為對(duì)申報(bào)者情況的確認(rèn)項(xiàng)目名稱B-胡蘿卜素的提取所屬科類理科申請(qǐng)人姓名xxx性別女出月1989 年07月院（系）化學(xué)與生物工程學(xué)院專業(yè)生物技術(shù)年級(jí)二年級(jí)聯(lián)系合作者姓名性別年齡學(xué)歷單位備注本科在讀蘇州科技大學(xué)()無院 系 認(rèn) 證是否為我校正式注冊(cè)在校的學(xué)生（?？粕⒈究粕?。（，）是（）否本課題是否為學(xué)生課外學(xué)術(shù)科技作品。（，）是（）否其它：簽章：年 月日目前，全球B -胡

2、蘿卜素的生產(chǎn)量約為600t/a ,年需求量為 12001500 t,且每年以7%9%速度增長(zhǎng)。美國(guó)的需求量近些 年以10%15的速度遞增。且在歐美和日本等國(guó)已形成市場(chǎng)。 2000年中國(guó)（3-胡蘿卜素的生產(chǎn)量為10 t ,其中40卿于出口。 2001年我國(guó)B-胡蘿卜素的生產(chǎn)能力為22 t,國(guó)內(nèi)B-胡蘿卜素 的總消費(fèi)量的的70湘于食品工業(yè)，其次用于保健品和醫(yī)藥行業(yè) 1。因（3 -胡蘿卜素可用作食品添加劑，飼料添加劑和化妝品助 劑，且（3-胡蘿卜素在防治癌癥和心血管疾病方面有特殊的作 用，所以，（3-胡蘿卜素越來越引起人們的關(guān)注和興趣。目前， 市場(chǎng)上有多種B-胡蘿卜素的生產(chǎn)方法：化學(xué)合成法：化學(xué)合成

3、法是指采用有機(jī)化工原料，通過化 學(xué)合成反應(yīng)，人工合成B-胡蘿卜素的一種方法。項(xiàng) 目 主 要 內(nèi) 容提取法：即從胡蘿卜、枸杞、馬鈴薯、玉米等天然植物原 料中直接提取B-胡蘿卜素的一種方法。生物合成法：生物合成法是指利用微生物培養(yǎng)技術(shù)，通過 微生物的培養(yǎng)，利用微生物在其體內(nèi)合成 B-胡蘿卜素，然后自 微生物體內(nèi)分離得到B-胡蘿卜素的一種方法。利用三胞布拉氏 霉菌生產(chǎn)B-胡蘿卜素就是生物合成法的一種。研究表明，采用三胞布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)胡蘿卜素不僅因 其胡蘿卜素合成水平極大高于多種生物體，而且B -胡蘿卜素含量在85%Z上，其結(jié)構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)的（3-胡蘿卜素相同；而且具有生 產(chǎn)原料易獲得，不受自然條件限制

4、，周期短和適用于工業(yè)化生 產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)?？梢源_認(rèn)三胞布拉氏霉菌是目前應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)胡 蘿卜素最重要的菌株。下面就目前狀況對(duì)其理化性狀，生理功能以及利用三抱布拉 氏霉菌生產(chǎn)B-胡蘿卜素的方法做一介紹。1 B-胡蘿卜素的理化性狀B-胡蘿卜素，分子式為 C40H56分子量為536.88。深紅紫至 暗紅色有光澤的斜面6面體或板狀微結(jié)晶的晶體或結(jié)晶性粉末。有輕微異臭或異味。稀溶液呈橙黃色至黃色，濃度增大時(shí)帶橙 色因溶液的極性可稍帶紅色。遇氧、熱、光不穩(wěn)定，在弱堿下 較穩(wěn)定。不溶于水、丙二醇、甘油、酸和堿；溶于二硫化碳、2苯、氯仿、己烷及植物油；幾乎不溶于甲醇和乙醇。在人體 和動(dòng)物的腸黏膜及肝臟中，1分子的（

5、3 -胡蘿卜素在15=15碳原 子位置，通過加氧酶的催化作用下，分裂為2分子的視黃醛，經(jīng)過還原過程，形成2分子的視黃醛，經(jīng)過還原過程，形成 2 分子的視黃醇（VQ。3 B -胡蘿卜素的生物提取技術(shù)材料與方法菌種與培養(yǎng)基菌種：三胞布拉氏霉菌JM9203（正株）、JM9204（負(fù) 株）。培養(yǎng)基：項(xiàng) 目 主 要 內(nèi) 容PDA斜面培養(yǎng)基：15麻鮮去皮馬鈴薯;2%萄糖；2演脂， PH自然。分裝試管后，0.1Mpa滅菌20min,斜面表面水干后使 用。液體種子培養(yǎng)基：淀粉 4%葡萄糖 2%玉米漿5% KHPO0.1%; MgSQ.01%; VB1mg/100ml;消前 PH6.7,裝量為 40ml/250

6、ml三角瓶，0.1Mpa滅菌20分鐘。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉 4%黃豆餅粉4%玉米漿3% KHPO0.1%; MgS（0.01%;鹽酸硫胺素 10mg/L;滅菌前調(diào) PH7.7, 裝量為50ml/500ml三角瓶，0.1Mpa滅菌40分鐘。補(bǔ)料：在發(fā)酵48h左右添加0.1% （3 -紫羅蘭酮及適量無菌 水。方法碳、氮源實(shí)驗(yàn)：在種子培養(yǎng)基或搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中 改變碳、氮用量比。裝量為40ml/250ml三角瓶，每組設(shè)三個(gè)重 復(fù)，0.1Mpa滅菌40分鐘?！?、-”菌株按5: 5的比例總量10% 接種，于280c 200rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)48h,無菌操作補(bǔ)加0.1% B-紫羅蘭酮。培養(yǎng)至120h終止

7、。培養(yǎng)基正交實(shí)驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)后，確定了培養(yǎng)基 中的四種因素及三個(gè)水平按 L排列組合。裝量為50ml/500ml三 角瓶，三個(gè)重復(fù)。（3 -胡蘿卜素的測(cè)定方法：離心收集發(fā)酵液中的菌絲體， 5055oC真空干燥、研磨。有機(jī)溶劑提取菌體中的色素14。采用 紫外分光光度計(jì)測(cè)定最高吸收峰的吸光值，參照方法15測(cè)定并計(jì)算B-胡蘿卜素的含量。菌種試驗(yàn)：除種子培養(yǎng)基碳源試驗(yàn)外，菌種不同性 別發(fā)酵試驗(yàn)以及種齡試驗(yàn)均按常規(guī)方法進(jìn)行。生物量測(cè)定：準(zhǔn)確量取發(fā)酵液，用雙層紗布過濾， 自來水反復(fù)沖洗、擰干、撕成碎片置于平面皿內(nèi)，5055oC抽真 空干燥，用1/100g精確度天平稱量。試驗(yàn)結(jié)果表明，以4帆碳源較為適宜，生

8、物量和（3-胡蘿卜 素的生產(chǎn)水平都較高。雖然在4癱粉的基礎(chǔ)上再添加1滯萄糖 總色素水平有所提高，但是（3-胡蘿卜素未增加，因而無實(shí)際意 義。而且用葡萄糖為種子培養(yǎng)基的碳源培養(yǎng)基質(zhì)粘性差，不利 于菌絲體伸張，易形成較大的團(tuán)塊，這樣可能造成種子菌體被 接入發(fā)酵培養(yǎng)基后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用不充分。培養(yǎng)基中的氮源對(duì)（3-胡蘿卜素的影響由于試驗(yàn)所采用的氮源均為農(nóng)、副產(chǎn)品，其營(yíng)養(yǎng)成分與含 量差異較大，因而不同的氮源物質(zhì)對(duì)B-胡蘿卜素合成水平有很 大的影響。以棉籽仁和黃豆餅粉為主要氮源所組成培養(yǎng)基較為 適宜，而玉米漿與棉籽仁或黃豆餅粉混合使用更有利于提高生 物量和B-胡蘿卜素的生產(chǎn)水平。培養(yǎng)基正交試驗(yàn)在碳、氮物質(zhì)

9、因素試驗(yàn)后，擬定淀粉、黃豆餅粉、玉米漿 以及植物油為影響三胞布拉氏霉菌合成B-胡蘿卜素水平的主要因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)基組合3無論其生物量還是胡蘿卜素水平均高于其它組合，因其碳、氮以及植物油配 較佳所致。影響胡蘿卜素合成水平的主要因素依次為植物油、 淀粉，影響影響較小的應(yīng)為黃豆餅粉。3.2.2菌種試驗(yàn)結(jié)果菌株的性別：三抱布拉氏霉菌有雄性（+）和雌性 （-）菌株，在相同條件下，單獨(dú)發(fā)酵“ +”和“-”株，其類胡 蘿卜素合成水平分別為36.6mg和263.7mg/L發(fā)酵液，而當(dāng)“ +” “-菌株混合發(fā)酵時(shí)，其胡蘿卜素合成水平達(dá)1113mg/L發(fā)酵液，這是因“ +”和“-”株混合培養(yǎng)有利于

10、產(chǎn)生促進(jìn)胡蘿卜素 的三胞酸所起的作用。菌種培養(yǎng)時(shí)間：分別采用培養(yǎng) 24、32、40、44和 48h的液體菌種發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng) 3248h的菌種均可用于發(fā)酵，但培養(yǎng)4044h的菌種更有利于胡蘿卜素的合成。在實(shí)驗(yàn)室條件下，通過對(duì)三胞布拉氏霉菌合成（3 -胡蘿卜素、菌種培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵比較實(shí)驗(yàn)，以生物量（每升發(fā)酵液中 菌絲體干重）、類胡蘿卜素和（3-胡蘿卜素合成水平為結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)， 篩選出適用于發(fā)酵三胞布拉氏霉菌培養(yǎng)基的碳、氮源物質(zhì)和配 比。同時(shí)對(duì)植物油的選擇與用量、中間添加（3-紫羅蘭酮也進(jìn)行 了實(shí)驗(yàn)，證明這些物質(zhì)均不同程度的影響著三胞布拉氏霉菌合 成B -胡蘿卜素水平，為深入研究三胞布拉氏霉菌的

11、發(fā)酵與B -胡蘿卜素產(chǎn)品研制奠定了基礎(chǔ)16。項(xiàng) 目 主 要 內(nèi) 容經(jīng)湖北省衛(wèi)生防疫站食品衛(wèi)生檢測(cè)所檢測(cè)，急性毒性試驗(yàn) 所得結(jié)果送檢樣品屬實(shí)無毒級(jí)；小鼠精子畸變?cè)囼?yàn)，實(shí)驗(yàn)組與 陰性對(duì)照結(jié)果無顯著差異，表明該受試物的精子畸變實(shí)驗(yàn)為陰 性；小鼠骨髓嗜多染色紅細(xì)胞微核試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的結(jié) 果無顯著差異，表明該受試物的微核實(shí)驗(yàn)為陰性。因此證明， 利用三胞布拉氏霉菌發(fā)酵生產(chǎn)出來的 B-胡蘿卜素?zé)o污染、無毒 害，可用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)17。結(jié)束語B-胡蘿卜素易于氧化，所以不管采用何種設(shè)備方法，都必 須防止生產(chǎn)過程中B-胡蘿卜素不必要的損失。針對(duì)目前 B-胡 蘿卜素供不應(yīng)求的狀況，探索出一種成本低、產(chǎn)率高

12、、無污染、 無毒害、適于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的制備B-胡蘿卜素的方法非常必 要。B-胡蘿卜素在醫(yī)藥、食品、及保健領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用市場(chǎng)，特別是近年來，隨著癌癥發(fā)病率的升高，B-胡蘿卜素因其有著 特異的功效，所以近年來一直是市場(chǎng)上供不應(yīng)求的緊俏商品。所以深入對(duì)其的認(rèn)識(shí)，大力開發(fā)B-胡蘿卜素的產(chǎn)業(yè)，將推動(dòng)食 品、醫(yī)藥、飼料、化妝品行業(yè)的發(fā)展，具有很好的市場(chǎng)前景。項(xiàng) 目 的 價(jià) 值 和 意 義B-胡蘿卜素是維生素A的重要來源由上述的B-胡蘿卜素的理化性狀可知，1分子的B-胡蘿卜 素在體內(nèi)酶的作用下可轉(zhuǎn)變?yōu)?分子的維生素A,且在食物中含 量最豐富，因而被認(rèn)定是人體內(nèi)維生素 A的主要來源。通過實(shí) 驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2,缺

13、乏維生素A的大鼠補(bǔ)飼（3-胡蘿卜素后能顯著提高 體內(nèi)維生素A的水平，從而證實(shí)了 B -胡蘿卜素能在體內(nèi)酶的作 用下轉(zhuǎn)化為維生素A,發(fā)揮2t生素A的作用，所以又稱維生素A 源原。該轉(zhuǎn)化酶在體內(nèi)維 A缺乏時(shí)將（3-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為維A, 當(dāng)體內(nèi)維A增加到需求量時(shí)，酶即停止轉(zhuǎn)化，從而通過酶的自 動(dòng)控制來維持體內(nèi)維 A的的需要。全世界，特別是發(fā)展中國(guó)家 人體所需的維A60%70%源于（3 -胡蘿卜素。維A是合成糖蛋白的載體，糖蛋白是細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)， 尤其是上皮細(xì)胞，如果缺少糖蛋白將對(duì)眼，呼吸道，皮膚，消 化道，泌尿道及生殖器官產(chǎn)生影響。免疫球蛋白也是一種糖蛋 白，維A缺乏將會(huì)影響抗體的形成。因此，維

14、 A對(duì)保證正常的 生長(zhǎng)和發(fā)育及抗感染具有重要的作用。但是，人體攝入大量的維A,會(huì)引起急性及慢性中毒主要是 骨痛，皮膚黏膜改變，顱內(nèi)壓升高等。而（3-胡蘿卜素本身無毒 性，當(dāng)攝入大量的（3-胡蘿卜素時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生積蓄，但不會(huì)引起中 毒3。因此，無論是治療維 A缺乏癥還是防止癌癥，使用（3-胡 蘿卜素都更好，更安全。2.2 （3 -胡蘿卜素是具有抗氧化作用人體在正常的生理代謝過程中會(huì)產(chǎn)生少量的含氧自由基， 而體內(nèi)的防御機(jī)制（抗氧化酶或抗氧化劑）會(huì)及時(shí)將其清除， 以維持氧自由基的代謝平衡。因此一般不會(huì)對(duì)細(xì)胞，組織產(chǎn)生 損傷。但隨著年齡的增長(zhǎng)或在某些病理狀態(tài)下，體內(nèi)抗氧化酶 的作用下降，過多的氧自由基不能

15、被及時(shí)清除而堆積在細(xì)胞內(nèi)， 導(dǎo)致它們迅速與機(jī)體內(nèi)的一些生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸氨 基酸、脂類等發(fā)生反應(yīng)，生成氧化物或過氧化物。這些物質(zhì)會(huì) 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，使細(xì)胞膜、組織、酶以及基因受損，從而引 起機(jī)體多種疾病的發(fā)生和衰老。B-胡蘿卜素的抗氧化作用是基于它分子中的多個(gè)共鈍多 烯雙鍵的特殊結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使它能與含氧自由基發(fā)生不可逆 反應(yīng)，生成非常穩(wěn)定的以碳為中心的自由基 B-car .,這個(gè)碳項(xiàng) 目 的 價(jià) 值 和 意 義核自由基可以迅速可逆的與氧反應(yīng)生成一種新的帶鏈的過氧化 自由基B-car-OO .。但這個(gè)可逆反應(yīng)的速率受氧分壓的影響非 常大，當(dāng)氧分壓降低時(shí)，反應(yīng)就會(huì)充分的向碳核自由基的方向

16、 進(jìn)行，這樣就有效的降低了體內(nèi)過氧化自由基的濃度，并能及 時(shí)阻止自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，因此也減少了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的數(shù) 量。由此可知（3-胡蘿卜素是一種有效的抗氧化劑，類蘿卜素也 因可以清除自由基以及淬滅單線態(tài)氧的活性受到了普遍關(guān)注。 日益增加的研究表明與衰老的過程相關(guān)聯(lián)的多種缺陷是細(xì)胞內(nèi) 的多點(diǎn)位氧化損傷積累的直接后果。例如：心血管疾病的發(fā)病 機(jī)理之一是低密度脂蛋白的氧化損傷而導(dǎo)致的；一些光化學(xué)對(duì) 晶體所造成的損傷的會(huì)導(dǎo)致白內(nèi)障的形成等。而（3-胡蘿卜素的高效抗氧化性能使活性氧變?yōu)榉€(wěn)定的氧分子。荷蘭的一項(xiàng)研究 表明，具有攝取含B-胡蘿卜素這種健康飲食習(xí)慣的老人，發(fā)生 心力衰竭的危險(xiǎn)性較低?，F(xiàn)已知1

17、分子（3 -胡蘿卜素可抑制1000 個(gè)分子的活性氧4,同時(shí)還可以作為一種弱氧化劑直接與自由基 反應(yīng)，阻止自由基的連鎖反應(yīng)，從而減少它對(duì)細(xì)胞的損傷。在 探討抗氧化營(yíng)養(yǎng)對(duì) DNA氧化損傷保護(hù)作用時(shí)，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)連續(xù) 服用（3-胡蘿卜素、維生素E和維生素C,可顯著降低由過氧化 氫誘發(fā)DNA勺損傷。2.3 （3 -胡蘿卜素可以促進(jìn)細(xì)胞縫隙間連接 交流B-胡蘿卜素細(xì)胞間形成的間隙連接使細(xì)胞質(zhì)相互溝通，通 過交換小分子來調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)。間隙連接的基本單位是連接子， 每個(gè)連接子由2個(gè)相同或相似的跨膜蛋白壓?jiǎn)挝画h(huán)繞，中心形 成一個(gè)直徑約1.5nm的孔道，相鄰細(xì)胞質(zhì)膜上的兩個(gè)連接子相 對(duì)便形成一個(gè)間隙單位。它允許小

18、的代謝物、細(xì)胞內(nèi)信息及離 子自由出入，但蛋白質(zhì)、mRN屋大分子則被排除在外，以保持 各細(xì)胞的遺傳一致性。Bertram等發(fā)現(xiàn)（3-胡蘿卜素和其它類胡 蘿卜素可以加強(qiáng)細(xì)胞間隙連接的交流能力，從而抑制或降低癌 癥的發(fā)生或發(fā)展；Yamasaki也指出構(gòu)成細(xì)胞連接通道的連接蛋 白，在轉(zhuǎn)化階段的癌細(xì)胞會(huì)由于通道的受阻而干擾細(xì)胞的交換， 這種交換是控制生長(zhǎng)的因素之一，從而抑制癌癥誘導(dǎo)細(xì)胞升級(jí) 到惡化階段6。國(guó)內(nèi)外進(jìn)行了大量的關(guān)于B-胡蘿卜素的抗腫瘤機(jī)制的研究,認(rèn)為B-胡蘿卜素抗癌機(jī)理有以下幾種：轉(zhuǎn)化為視黃醇（VA項(xiàng) 目 的 價(jià) 值 和 意 義而起作用、抗氧化機(jī)制，提高機(jī)體免疫力等7.8。多種研究2亦 證實(shí)

19、B-胡蘿卜素是細(xì)胞間通訊的誘導(dǎo)劑，它能增強(qiáng)轉(zhuǎn)化癌起始 細(xì)胞與健康細(xì)胞的交流作用，而且目前研究人員通過熒光燃料 示蹤技術(shù)已獲得B -胡蘿卜素增強(qiáng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和末轉(zhuǎn)化細(xì)胞間的 GJIC功能的直接證據(jù)，但對(duì)于其具體的調(diào)節(jié)機(jī)理尚不清楚。（3 -胡蘿卜素的可以增強(qiáng)免疫力，提高人體免疫系統(tǒng)抵抗致 癌物的能力免疫系統(tǒng)的兩個(gè)主要功能是抵御細(xì)菌或病毒的侵染和防止 癌癥的發(fā)生。類胡蘿卜素在增強(qiáng)人體的免疫能力方面具有明顯 的作用。類胡蘿卜素能增加免疫系統(tǒng)中 B細(xì)胞的活力，B細(xì)胞能 在體內(nèi)循環(huán)，從而消滅外源入侵的病原體；類胡蘿卜素能提高 淋巴輔助T細(xì)胞（CD4的活力，能協(xié)助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，并能 提高其它免疫組分的活性；類

20、胡蘿卜素能增加嗜中性白血球的 數(shù)目，它可以包圍細(xì)菌，并分泌包圍細(xì)菌的酶；類胡蘿卜素能 增加自然殺傷細(xì)胞（NK的數(shù)目，以消除機(jī)體內(nèi)被感染的細(xì)胞 或癌細(xì)胞。目前，已經(jīng)有很多關(guān)于服用類胡蘿卜素對(duì)免疫活性 的影響的報(bào)道。流行病學(xué)的研究結(jié)果表明9,高劑量的（3-胡蘿卜素的攝入 與肺癌、胃癌、食道癌、前列腺癌的發(fā)生率間存在著明顯的負(fù) 相關(guān)；與腸癌的發(fā)生率存在著中度的負(fù)相關(guān)；而與乳腺癌、膀 胱癌、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率間的相關(guān)性不明顯或存 在著正相關(guān)。吃富含（3 -胡蘿卜素的食物可增強(qiáng)生物機(jī)體的特異 性及非特異性免疫功能。目前，稱B-胡蘿卜素為腫瘤的化學(xué)防預(yù)劑，它消除氧自由 基、控制自由基的生成、促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子（TNF 和干擾素（IFN）、促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖，