trizol法組織DNARNA及蛋白提取方法

1、TRIzol法同時(shí)提取RNA、DNA、蛋白質(zhì)TRIzol試劑適用于從細(xì)胞和組織中快速分離RNAoTRIzol試劑有多組分分離作用，與其他方法如硫氰酸胍/酚法、酚/SDS法、鹽酸胍法、硫氰酸胍法等相比，最大特點(diǎn)是可同時(shí)分離一個(gè)樣品的RNADNA蛋白質(zhì).TRIzol使樣品勻漿化，細(xì)胞裂解，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時(shí)因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。RNA的提取準(zhǔn)備試劑：氯仿，異丙醇，75%乙醇，無(wú)RNase的水或0.5%SDS（溶液均需用DEP

2、C處理過(guò)的水配制）。操作步驟：勻漿處理：組織將組織在液氮中磨碎，每50100mg組織加入1mlTRIzol，用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10%o單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積（即3.5cm直徑的培養(yǎng)板）加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每510 x106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1X107細(xì)菌細(xì)胞加入ImlTRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

3、2將勻漿樣品在室溫（1530C）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。（我們是5分鐘）2-8C10000Xg離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色（我們見(jiàn)到的是紅色）有機(jī)相,上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%o把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml異丙醇（加入移出液相等體積），室溫放置10分鐘。28C10000Xg離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管

4、底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。8.用75%乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75%乙醇。28C不超過(guò)7500Xg離心5分鐘，棄上清。9室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大約晾510分鐘即可不要真空離心干燥，過(guò)于干燥會(huì)導(dǎo)致RNA的溶解性大大降低。加入25200M無(wú)RNase的水或0.5%SDS,用槍頭吸打幾次，5560C放置10分鐘使RNA溶解。如RNA用于酶切反應(yīng)，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲酰胺溶解，-70C保存。預(yù)防RNase污染注意事項(xiàng)：1經(jīng)常更換新手套，皮膚上常帶有的細(xì)菌，霉菌可能成為RNase的來(lái)源。2使用滅過(guò)菌的RNA專(zhuān)用塑料制品避免交叉污染。

5、RNA在TRIzol試劑中時(shí)不會(huì)被RNase污染，但提取后繼續(xù)處理過(guò)程中應(yīng)使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘烤4小時(shí)，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，高壓滅菌，即可去除RNase。配制溶液應(yīng)使用無(wú)RNase的水（將水加入處理過(guò)不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.01%v/v,放置過(guò)夜，高壓滅菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。注意事項(xiàng)：從少量樣品（110mg組織或102104細(xì)胞）中提取RNA時(shí)可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800mlTRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加510ugRNase-free糖原。糖原會(huì)與

6、RNA一同沉淀出來(lái)，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70C保存至少一個(gè)月。RNA沉淀可以保存于75%酒精中28C星期以上或-5至-20C年以上。分層和RNA沉淀時(shí)也可使用臺(tái)式離心機(jī)，2600Xg離心3060分鐘。預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1X106細(xì)胞提取RNA分別為：肝和脾610ug，腎34ug,骨骼肌和腦組織11.5ug，胎盤(pán)14ug，上皮細(xì)胞815ug，成纖維細(xì)胞57ug。常見(jiàn)問(wèn)題分析：得率低：樣品裂解或勻漿處理不徹底。RNA沉淀未完全溶解。A260/A2801.65：檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品沒(méi)有溶于水，而溶于了TE中。

7、低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高。樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少。勻漿樣品時(shí)未在室溫放置5分鐘。吸取水相時(shí)混入了有機(jī)相。RNA沉淀未完全溶解。RNA降解：組織取出后沒(méi)有馬上處理或冷凍。待提取RNA的樣品沒(méi)有保存于-60至-70C,而保存在了-5至-20C。細(xì)胞在用胰酶處理時(shí)過(guò)度。溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。電泳時(shí)使用的甲醛pH值低于了3.5。DNA污染：樣品勻漿時(shí)加的試劑量太少。樣品中含有有機(jī)溶劑（如乙醇，DMSO等），強(qiáng)緩沖液或堿性溶液。蛋白聚糖和多糖污染：沉淀RNA的過(guò)程中作以下改進(jìn)可去除這些污染，步驟7中，每使用1mlTRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶

8、液（0.8M檸檬酸鈉和1.2MNaCl）混合離心，按之前操作進(jìn)行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時(shí)應(yīng)在勻漿后離心，并加上以上操作步驟。DNA的分離準(zhǔn)備試劑：乙醇0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）、75%乙醇、8mMNaOH操作步驟：樣品加氯仿分層后，移去上層水相，用乙醇沉淀中間層和有機(jī)相中的DNA。每使用lmlTRIzol加0.3ml無(wú)水乙醇混勻，室溫放置3分鐘，28C不超過(guò)2000Xg離心5分鐘。移去上清，（如需分離蛋白質(zhì)，可保留，進(jìn)一步操作見(jiàn)后）用含10%乙醇的0.1M檸檬酸鈉洗滌DNA沉淀。每用1mlTRIzol加入1ml檸檬酸鈉

9、，室溫放置30分鐘，28C2000Xg離心5分鐘，棄上清，重復(fù)一次?？梢栽僦貜?fù)一次。用75%乙醇再洗一遍DNA沉淀，每用1mlTRIzol加入1.52ml75%乙醇，室溫放置1020分鐘（不時(shí)顛倒混合）28C2000Xg離心5分鐘，棄上清。室溫放置晾干DNA515分鐘，用8mMNaOH溶解DNA。從5070mg組織或107細(xì)胞中分離的DNA溶于300600ul8mMNaOH，DNA的濃度通常為0.20.3ug/ul。提取的DNA沉淀不易溶于水和Tris緩沖液中，建議用弱堿溶解，8mMNaOH的pH值為9,溶解DNA后可用TE，HEPES調(diào)節(jié)pH。從某些樣品（尤其是組織）中提取的DNA中可能包含

10、一些膠狀不溶物可12000Xg離心10分鐘除去。DNA的定量：取一份溶于8mMNaOH的DNA加水測(cè)A260值。一單位A260值相當(dāng)于50ug/ml雙鏈DNA。根據(jù)DNA產(chǎn)量可估計(jì)細(xì)胞數(shù)，人、大鼠、小鼠、1X106二倍體細(xì)胞含DNA的量分別為7.1ug，6.5ug，5.8ugo預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1X106細(xì)胞提取DNA分別為肝和腎34ug骨骼肌，腦組織，胎盤(pán)23ug人，大鼠，小鼠培養(yǎng)細(xì)胞（1X106）57ug成纖維細(xì)胞57ug。應(yīng)用：用于PCR溶于8mMNaOH的DNA用0.1MHEPES調(diào)pH至&4,取0.11ugDNA用作模板。酶切反應(yīng)用HEPES或1mMEDTA調(diào)節(jié)pH至適當(dāng)值。每u

11、gDNA使用35單位的酶，8090%的DNA是可消化的。1ml8mMNaOH溶解的DNA樣品pH值調(diào)節(jié)FinalpH0.1MHEPES（ul）FinalpH1MHEPES（ul）8.4867.2238.2937.0328.01017.81177.5159、.，Y-、八.，I/r-.Tr注意事項(xiàng)：DNA在中間層和有機(jī)相中時(shí)可在28C保存過(guò)夜。DNA沉淀在75%乙醇中28C可保存幾個(gè)月。DNA在8mMNaOH溶液中4C可放置過(guò)夜，如長(zhǎng)期保存需用HEPES調(diào)節(jié)pH至78并且加EDTA至ImM,可置于4C或-20C長(zhǎng)期保存。常見(jiàn)問(wèn)題分析：得率低：樣品勻漿和裂解的不徹底。最終得到的DNA沉淀沒(méi)有完全溶解

12、。A260/A2801.70：檢測(cè)吸光度時(shí)，RNA樣品沒(méi)有溶于水，而溶于了TE中。酚除去的不徹底，可用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）再洗一遍DNA沉淀。DNA降解：組織取出后沒(méi)有馬上處理或冷凍。待提取RNA的樣品沒(méi)有保存于-60至-70C，而保存在了-5至-20C。樣品勻漿時(shí)使用了高速勻漿儀。RNA污染：氯仿分層后水相去除的不干凈。DNA沉淀用0.1M檸檬酸鈉（含10%乙醇）洗的不徹底。蛋白質(zhì)的提取準(zhǔn)備試劑：異丙醇、含0.3M鹽酸胍的95%乙醇、無(wú)水乙醇、1%SDS。操作步驟：1取沉淀DNA后剩余的上清，用異丙醇沉淀蛋白質(zhì)。每使用1mlTRIzol加1.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘，28C

13、12000Xg離心10分鐘棄上清。用含0.3M鹽酸胍的95%乙醇洗滌蛋白質(zhì)沉淀。每使用1mlTRIzol加2ml洗滌液，室溫放置20分鐘，28C7500Xg離心5分鐘，棄上清，重復(fù)兩次。用2ml無(wú)水乙醇同樣方法再洗一次。3真空抽干蛋白質(zhì)沉淀510分鐘，用1%SDS溶解蛋白質(zhì)，反復(fù)吸打，50C溫浴使其完全溶解，不溶物28C10000Xg離心10分鐘除去。分離得到的蛋白質(zhì)樣品可用于WesternBlot或-5至-20C保存?zhèn)溆?。注意事?xiàng)：蛋白質(zhì)沉淀可保存在含0.3M鹽酸胍的95%乙醇或無(wú)水乙醇中28C個(gè)月以上或-5至-20C一年以上。用0.1%SDS在28C透析三次，10000Xg離心10分鐘取上

14、清即可用于WesternBlot。常見(jiàn)問(wèn)題分析：得率低：樣品裂解或勻漿處理不徹底。最后得到的蛋白質(zhì)沉淀未完全溶解。蛋白質(zhì)降解：組織取出后沒(méi)有馬上處理或冷凍。電泳時(shí)條帶變形：蛋白質(zhì)沉淀洗滌不充分。操作步驟：用Trizol試劑勻漿細(xì)胞和組織的方法同RNA提取步驟。在細(xì)胞勻漿中加入氯仿，每1mlTrizol的起始用量加入0.2ml氯仿。劇烈震蕩30秒鐘后室溫放置23分鐘。4C下10,000g離心10分鐘。小心吸取并丟棄上層水相（該水相中富含細(xì)胞總RNA，如果需要提取RNA，則收集該水相）。在剩下的中間層及有機(jī)相中加入無(wú)水乙醇，每1ml起始Trizol用量加入0.3ml無(wú)水乙醇。顛倒充分混勻后室溫放置

15、23分鐘。4C下2,000g離心5分鐘。小心吸取并收集上層的酚醇有機(jī)相（沉淀為DNA），轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入異丙醇，每1ml起始Trizol用量加入1.5ml異丙醇。輕輕混勻后室溫放置10分鐘。4C下12,000g離心10分鐘。丟棄上層液相，沉淀即為蛋白質(zhì)。用清洗液（鹽酸胍溶于95%乙醇中，終濃度為0.3M）清洗沉淀3次。每1ml起始Trizol用量加入2ml清洗液清洗。在每次清洗過(guò)程中，先將沉淀保留于清洗液中20分鐘（室溫下），然后在4C下7,500g離心5分鐘。最后一次清洗后，丟棄上層液相，將沉淀懸浮于2ml乙醇中，渦旋震蕩15秒后在室溫下放置20分鐘，然后在4C下7,500g離心5分鐘。丟棄上層液相，將沉淀真空干燥510分鐘。然后將沉淀溶解于1%SDS（十二烷基硫酸鈉）中?？捎?0C水浴中用tip頭反復(fù)吹打以助溶。不溶物在4C下10,000g離心10分鐘去除。收集上清，轉(zhuǎn)移到新的收集管中。該上清中的蛋白樣品可直接用于WesternBlotting實(shí)驗(yàn)或保存于-20C。2附注：蛋白沉淀保存于清洗液（鹽酸胍溶于95%乙醇中，終濃度為0.3M）中，或保存