分子生物學-DNA的復制

1、第五章 DNA的復制(DNA Replication )DNA復制 親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以各單鏈 DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補配對的游離的dNTP，合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程。復制子(Replicon，復制單位或復制元) DNA中含有一定復制起點和復制終點的復制單位。 復制子的長度大小不均，1.3萬90萬bp不等。DNA的半保留復制（Semi-Conservation Replication） 概念： 復制過程中各以雙螺旋DNA的其中一條鏈為模板合成其互補鏈，新生的互補鏈與母鏈構成子代DNA分子 。理論上DNA的復制也可采用其

2、它方式，如叫全保留復制(conservative replication)和分散模型（dispersive model）的復制方式也是可能的。第一節(jié)半保留復制的驗證 半保留模型（semioconservetive model） 全保留復制模型(conservetive model) 分散模型(Dispersive model)。驗證半保留復制的實驗一、Meselson-Stahl實驗 二、Taylar實驗 三、姐妹染色單體差別染色方法（sister- chromatid differential staining）5溴脫氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，簡稱BUdR） 斑色染

3、色體（Harlequin chromosome） 四、Cairns復制模型型復制 圖11-4 Taylor 蠶豆根尖放射自顯影實驗。(a)按半保留復制預期DNA在復制過程中標記情況；(b)實驗結果染色體放射自顯影的圖示。第二節(jié)參與DNA復制的酶和蛋白一、快停突變與慢停突變快停突變：把細菌培養(yǎng)溫度提高（42 45）復制迅速停止?？焱Ｍ蛔兯婕暗漠a物和鏈的延伸有關慢停突變：將細菌培養(yǎng)溫度提高，DNA合成并不立即停下來，延續(xù)一段時間后合成才會停止。慢停突變表明突變的基因和復制起始有關。篩選出與DNA合成、延伸有關的蛋白和酶。二、復制的酶系統(tǒng)（一）DNA聚合酶1.DNA聚合酶的共同特點（1）需要提供合

4、成模板；（2）不能起始新的DNA鏈，必須要有引 物提供3OH；（3）合成的方向都是53（4）除聚合DNA外還有其它功能。 表11-1 E.coli 中的三種DNA多聚酶 DNApolDNApol DNA pol 結構分子量 109 KD90 KD900 KD構成 單體單體異多聚體分子數(shù)/細胞 400？10-20酶活性：5 3聚合酶 +35外切酶 +53外切酶 +(可切單鏈)突變體突變位點pol Apol BpolC(dnaE), dnaN, dnaZX, dnaQ, dnaT突變表型修復有缺陷能修復阻止復制復制的特異性（復制的忠實性）：(1)合成前（presynthetic）錯誤控制：能夠通過

5、匹配的化學特點加以識別，檢查進入的堿基是否和模板互補，這是一種合成前的預防措施。(2)校正（proofreading）控制：在新的堿基加到鏈上以后，來檢查堿基是否配對。發(fā)生錯配時，會把剛加上去的錯誤堿基切除。2.DNA聚合酶的結構和功能DNA聚合酶有6個結合位點：(1) 模板結合位點；(2) 引物結合位點；(3) 引物3OH結合位點；(4) 底物dNTP結合位點；(5) 53外切酶結合位點；(6) 35校正位點。 3、DNA聚合酶的功能 特點：主要用于DNA的修復和后隨鏈中RNA引物的置換。使用的模板范圍較寬（1）有引物的ssDNA（線狀或環(huán)狀）。（2）有缺口的dsDNA（無論大?。?；（3）有

6、切口（nick）的雙鏈DNA。 1. 53聚合功能 2. 35外切活性 3. 53外切活性 (1)切口平移（nick translation）； (2)鏈的置換； (3)模板轉換（template-switching） 4. 內切酶活性4、DNA多聚酶的結構DNA pol 全酶在DNA上的裝配分為三個階段：（1）一個二聚體加上一個復合體識別引 物模板形成一種前起始復合物。（2）DNA在于,復合體結合的位點構象 發(fā)生改變，而對核心酶產生了高親和。 使核心酶能與DNA結合。（3）二聚體結合核心聚合酶，使其二聚化。（二） DNA連接酶 其作用機制是分三步進行：1、EATPEAMPppi 在E.col

7、i中， ENADEAMPNMN（煙酰胺單核苷酸）2、E-AMP上的AMP轉移到DNA的5-PO4上使其活化3、活化的5PO4與相鄰的3OH作用形成35 磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。（三） 單鏈結合蛋白單鏈結合蛋白（single strand binding protein,SSB）又稱為雙螺旋去穩(wěn)定蛋白（helix destabilizing protein）由177個aa組成在E.coli 中以四聚存在分子量為74KDa ，每個分子可以覆蓋32nt在原核中SSB與DNA結合表現(xiàn)出協(xié)同效應。（1）SSB之間的相互作用；（2）第一個SSB和DNA的結合改變了DNA的結構。（四）解旋酶(helic

8、ase)(五）DNA拓撲異構酶(topoisomerase)DNA拓撲異構酶是可以切斷DNA鏈又能重新連接DNA的一種酶。 可以分為兩類：型拓撲異構酶 型拓撲異構酶第三節(jié)復制的起點、方向和終點 一. 研究方法： 1 用同位素標記電鏡觀察2. 用噬菌體插入標記法 同步培養(yǎng) 不同步培養(yǎng) 3. 變性定性法（denaturation mapping） 4. 雙向電泳法不同步培養(yǎng)時各標記的拷貝數(shù)不同,復制起點標記的拷貝數(shù)應最多二、不同生物復制起點和方向 E.coli定點、雙向對稱復制。 T7在近一端的17處開始，向兩端延伸。 真核有多個復制起點（i），雙向等速復制。 枯草桿菌有固定的起始點，雙向不對稱復

9、制。 質粒R6K早期為單向復制，復制了約1/5時基因 組進行雙向復制。 質粒Col E1有固定起始點，但卻為單向復制。 mt DNA進行D（displaced loop）環(huán)復制 D環(huán)復制三、原核生物，噬菌體和病毒的復制起始和終止(一).環(huán)狀DNA的復制:1、雙鏈DNA的復制E.coli復制起始區(qū)的結構特點是：（1）富含AT，這可能和雙鏈易于解開起始復制有關；（2）含有多個回文結構（914個GATC）8個GATC較保守,CATC中的“ A”已甲基化;（3）具有 4個重復順序，作為蛋白結合位點；（4）此順序的右側毗鄰區(qū)域有兩個起動子，其可能的作用是：轉錄產生引物；產生復制必要的蛋白；產生調節(jié)功能的

10、RNA；起轉錄激活作用。復制起始的簡單步驟：1、轉錄激活：在起始區(qū)雙鏈必須打開一小段，這主要是依賴RNA聚合酶在附近的轉錄，將雙鏈打開，這種作用就叫做轉錄激活。2、雙鏈解開的這一點延著DNA向邊延伸擴大，產生復制叉。3、開始合成引物。4、引物合成后，DNApol組裝都引發(fā)的RNA上，完成復制體的組裝。2、單鏈DNA的復制：1968年Gilbert提出滾環(huán)復制模型:（1）共價延伸；（2）模板鏈和新合成的鏈 分開;（3）不需RNA引物，在正 鏈3OH上延（4）只有一個復制叉;（5）形成多聯(lián)體（concatemer ）; 滾環(huán)復制的電鏡照片 哪些DNA進行滾環(huán)復制?真核rDNA的擴增,F因子DNA的

11、轉移,裂解途經的復制, X174,M13.G4等單鏈環(huán)狀DNA噬 菌體 第二階段復制都是進 行滾環(huán)復制的.（二）線狀DNA復制DNA末端起始復制DNA中間起始復制DNA中間起始復制DNA末端起始復制線性雙鏈DNA的復制有的是從一端開始的: 腺病毒（Adenovirus） 29 DNAs 脊髓灰質病毒（poliovirus)腺病毒DNA全長35937 bp,線性雙鏈，兩端各有反向重復順序103162 bp，兩末端各有50 bp為復制起點。其復制是以單鏈置換（strand displacement）形成一個大的莖環(huán)或叫平鍋形結構來進行的。（三）復制的終止1.E.coli的復制終止(環(huán)狀DNA復制終

12、止)現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有兩個終止區(qū)域（terE,D,A和ter F,C,B），位于相遇點的另一側100Kb處。每一終止順序對某一方向移動的復制叉來說是特異的。ter順序有一個23bp的區(qū)域，在體外可導致復制的終止，但其功能顯示了一定的方向性。終止需要tus(terminus utilization substance)基因的產物Tus(36kD)， Tus能識別ter保守順序，并阻止復制叉繼續(xù)前進。ter-Tus復合物可能通過抑制螺旋酶來實行終止2.線性DNA的復制終止 兩個5有空缺的分子通過3端凸出的重復序列互補配對。 DNA多聚酶從3端延伸填補起這個空缺，留下最后的裂隙由連接酶封閉，產生了一個大分子

13、串聯(lián)體。 由限制酶在連接處交錯切割，產生3 凹端，由DNA多聚酶在3-OH上延伸填滿新的空缺，產生兩條完整的雙鏈。 第四節(jié) 復制的過程 1、岡崎片段 任何一種DNA聚合酶合成方向都是從5向3方向延伸，而DNA模板鏈是反向平行的雙鏈，這樣在一條鏈上，DNA合成方向和復制移動方向相同（前導鏈），而在另一條模板上卻是相反的（后滯鏈）。那么在復制叉中新鏈是如何合成的呢？一、半不連續(xù)復制 Reiji Okazaki在DNA合成實驗中添加放射性的脫氧核苷酸前體觀察到前導鏈連續(xù)合成，滯后鏈分段合成。這些分段合成的新生DNA片段稱岡崎片段。細菌岡崎片段長度1000-2000核苷酸，真核生物岡崎片段長度100-

14、200核苷酸。岡崎實驗 （1）脈沖標記實驗（pulse-labeling experiment） 以E.coli為材料，在培養(yǎng)時，培養(yǎng)基中加入同位素3H標記的dTTP，經30秒后，DNA剛開始復制，分離DNA，然后在堿中沉淀，變性，讓新合成的單鏈和模板鏈分開，再用CsCl密度梯度離心，以沉降的快慢來確定片段的大小，再檢測放射標記，結果表明被3H標記的片段，也就是新合成的片段，沉淀系數(shù)為20S左右，即都是長10002000Nt的DNA片段，而親本鏈要比它大2050倍。 （2）脈沖追逐實驗 早期合成的DNA片段以后的命運又是如何的？是依然如舊的短片段，還是連接成了長片段。這個實驗是先進行標記培養(yǎng)3

15、0秒，以后除去同位素繼續(xù)培養(yǎng)幾分鐘，再分離DNA在堿中沉淀，檢測結果。先合成的（帶標記）的DNA不再是短片段，而和總DNA的情況相似，沉淀系數(shù)為70S120S較長的片段，這意味著剛開始合成的片段都是短片段，以后再連接成長片段，人們就把最初合成的短片段稱為岡崎片段（Okazaki fragment）。 細胞內都存在有dTTP和dUTP，而DNApol卻并不能區(qū)分它們，因此也會將dUTP加入到DNA中，形成AU對。那么在DNA中為什么沒有U的存在呢？這是因為E.coli細胞里有雙重“保險”，防止了U的“混入”。第一道關是細胞里的dUTPase，它能使dUTP變成dUMP，dUMP是不能作為DNA合

16、成的底物，這樣它就不再能加入DNA中。 第二道關是尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無Pu和Py位點（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP內切酶在AP位點切出一個缺口，進一步進行切除修復。在細胞內尿嘧啶N-糖苷酶作用較快，而AP酶作用較慢，在新鏈合成之初約1200bp就有可能摻進一個U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切斷糖苷鍵，在AP酶未作用前在脈沖標記實驗中就提取了，用NaOH沉淀時，AP位點十分易斷裂，所以前導鏈也成了小片段。 E.colidUTPase，它能使dUTP變成dUMP，dUMP是不能作為D

17、NA合成的底物，這樣它就不再能加入DNA中。尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切斷混合尿苷的糖苷鍵，形成無Pu和Py位點（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP內切酶在AP位點切出一個缺口，進一步進行切除修復。實驗證實(1)在dut -突變體（dUTPase缺失）中岡崎片段比在dut +中短。這是因為U摻入機會增加；(2)在ung- （尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突變體中，新合成的DNA約有一半由片段組成。(3)因為尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不會切除U的糖苷鏈，也就不會出現(xiàn)AP位點，所以堿沉淀時不易斷裂，從而保持了半不連續(xù)的原貌。在dut-

18、, ung-雙突變體中，結果和實驗（2）相同，更進一步證實了此推測。2、復制過程復制過程的特征： 1、DNA的聚合反應是以dNTP為底物，以帶有引物的DNA為模板，按堿基互補配對的原則在3-OH上加一個dNTP2、 需要二價正離子如Mg2+，由引物提供的3-OH作親本進攻形成磷酸二酯鍵 3、鏈沿5到3方向延長4、堿基互補配對時，若錯配則被先切除掉5、反應具有進行性， DNA聚合酶從DNA上解離下來前可催化多次反應3、鏈的延伸鏈的合成方向和復制叉移動方向相同的是前導鏈，相反的是后隨鏈。前導鏈連續(xù)延伸，后隨鏈合成較為復雜。雙螺旋復制是同時復制的：每一個復制叉含有特別大的多聚體復合體，它是一個不對稱

19、的二聚體，可能同時催化兩條鏈。在電鏡下觀察到雙螺旋DNA聚合酶也同樣具有兩個活性部位 復制體（replisome）：是由解旋酶、引發(fā)酶和DNA Pol 全酶組成的復合體。4、復制體和回環(huán)模型回環(huán)模型： DNA合成時，沿著復制叉的方向移動。后隨鏈模板形成了一個回環(huán)，使環(huán)中RNA引物和岡崎片段的合成方向與前導鏈一致，以適應雙鏈在同一復制體上進行復制。特點：聚合酶和引發(fā)體聯(lián)系在一起可以協(xié)調它們的作用；復制體中的DNA Pol 是二聚體；后隨鏈是形成回環(huán)復制的。 二、真核生物的復制、真核生物聚合酶和有關蛋白、真核生物復制特點基因組中有多個復制起點 一般要等第一輪復制結束后第二輪才開始。 真核的復制起點

20、到兩邊的復制終點稱為一個復制子（replicon）或一個復制單位（replicationunite）。DNA開始合成的位置，一個初始起點(或者雙向復制起點-大多數(shù)起點是雙向的)，兩側有一些二級起點。初始起點經常是0.5-2kbp長，而二級起點可跨越50kbp，因此稱為起始地帶(initiation zone) 真核和原核復制子的大小是非常相似的，但復制的速率真核要比原核慢得多真核的復制起始點的數(shù)目和復制單位的大小是隨著細胞的特點變化而改變的，如不同的生長速率的細胞和不同組織的細胞。 并非所有的復制子都同時進行DNA復制。而是有一定的起始時間順序。不同類型的細胞復制起始的順序也不同。在不同的發(fā)育

21、時期，真核的復制起點和復制子的大小是會改變的，有些復制起點在有的發(fā)育階段就不再發(fā)揮作用 真核的復制起始區(qū)的順序稱為自主復制順序 真核DNA復制時DNA聚合酶有五種()，原核只有三種。 真核細胞內DNA引物酶和pol緊密偶聯(lián)，而在原核細胞內引發(fā)酶是和解旋酶偶聯(lián)一起，形成復制體的一部分。 、真核生物復制起始區(qū)結構(1)T蛋白具有解鏈酶活性，通過水解ATP解開雙鏈，RF-A立即和單鏈結合，使之穩(wěn)定；(2)復制叉移動一段距離，pol-引物酶復合物結合到復制區(qū)，合成第一段RNA引物；(3)RF-C結合到引物上，使pol合成第一條岡崎片段；(4)到前導鏈和后滯鏈的分界區(qū)，pol從單鏈上解下來，再結合到新的

22、復制叉處合成后滯鏈。(5)pol，RF-C和PCNA結合到前導鏈的第一條岡崎片段3端開始合成前導鏈。(6) SV40的復制可能也形成復制體，后滯鏈形成回環(huán) 酵母的自主復制區(qū)ARS(autonomously replicationg sequence)發(fā)揮復制起點的功能，但是過量的。酵母染色體的著絲粒附近為ARS1序列ARS1分為A,B,C三個功能區(qū), A,B起主要作用,C起次要作用。A區(qū)為15bp,其中11個保守，稱ACS (ARS consensus sequence)。有復制起始子的功能B區(qū)約為80bp,含B1,B2,B3三個功能區(qū)。B3是ABF1（ARS-binding factor 1）結合區(qū)。酵母的復制ORC：由6個亞基組成相當于Dna A和 的O蛋白，與 A/B1結合，結合于游離的DNA Cdc6:相當于DnaC,及的P蛋白，使Mcm蛋白結合到復合體上。此對在Origin上起始復制是必須的。 Mcm: DnaB 螺旋酶。即 licensing factorABF1（轉錄因子）結合于B3三、原核和真核生物復制體系比較E.coli SV40/人 酵母 功能 DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白 DnaB Dn