6蛋白質(zhì)離子交換層析,蛋白質(zhì)紫外

1、實(shí)驗(yàn)六 蛋白質(zhì)技術(shù)離子交換層析濃縮蛋白質(zhì)溶液紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度離子交換層析濃縮蛋白質(zhì)溶液基本概念 層析法是一種基于被分離物質(zhì)理化和生物學(xué)特性的不同（吸附力、分子量、電荷性質(zhì)、溶解度、親和力），使其在某種介質(zhì)中移動(dòng)的速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法。溶有葉綠素的乙醚碳酸鈣粉末黃色的色帶（葉黃素）綠色的色帶（-胡蘿卜素）繼續(xù)洗脫，分段收集，就可以使葉黃素和-胡蘿卜素分離一個(gè) 經(jīng)典的層析實(shí)驗(yàn)葉綠素的層析分離色譜法基本概念固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)固體（吸附劑、凝膠、離子交換劑）液體（固定在硅膠或纖維素上的溶液）能與待分離物進(jìn)行可逆的吸附、溶解、交換等作用阻力：阻止所分離的樣品向前移動(dòng)流動(dòng)相推動(dòng)固

2、定相上待分離的物質(zhì)朝一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界體等。洗脫時(shí)所用的溶劑，也叫洗脫液。動(dòng)力：不斷地前移，并帶動(dòng)所分離的樣品向前移動(dòng)分配系數(shù)（K）在一定條件下，某種組分在固定相和流動(dòng)相中濃度的比值被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)、層析柱的溫度洗脫用洗脫液沖洗層析柱，使樣品中不同組分得以分離的過(guò)程。洗脫曲線以洗脫的體積為橫坐標(biāo)，組分的濃度為縱坐標(biāo)作圖所得的曲線。(二)層析法分類1.根據(jù)分離原理： 吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析。2.根據(jù)流動(dòng)相不同：液相層析（液-液層析，液-固層析）、氣相層析（氣-液層析，氣-固層析）3.根據(jù)支持物方式：柱層析、紙層析、薄層層析、高

3、效液相層析離子交換層析根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進(jìn)行分離固定相：離子交換劑人工交聯(lián)的帶有能解離基團(tuán)的有機(jī)高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠離子交換層析柱常用的陽(yáng)離子交換纖維素（本身陰離子）有: 磺酸甲基纖維素(SMC) 羧甲基纖維素(CMC) 磷酸基纖維素(PC)常用的陰離子交換纖維素（本身陽(yáng)離子）有: 二乙基胺乙基纖維素(DEAEC) 三乙基胺乙基纖維素(TEAEC)離子交換層析基本原理123451. 平衡階段:離子交換劑與反離子結(jié)合2. 吸附階段：樣品與反離子進(jìn)行交換3、 解吸附階段：用梯度緩沖溶液洗脫，先洗下弱吸附物質(zhì)，后洗下強(qiáng)吸附物質(zhì)4. 再生階段：用原始平衡液進(jìn)行充分

4、洗滌，既可重復(fù)使用平衡液的反離子樣品溶液洗脫液（梯度濃度） 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)一般低于8，在pH為8的弱離子強(qiáng)度溶液帶負(fù)電荷，可以被陰離子交換樹脂吸附。當(dāng)增加緩沖液離子強(qiáng)度或陰離子電負(fù)性時(shí)，可以將蛋白質(zhì)成批量洗脫下來(lái)，達(dá)到蛋白質(zhì)濃縮的目的。試劑:待濃縮樣品：低濃度蛋白質(zhì)溶液陰離子交換樹脂纖維素DE-52（DEAE Cellulose DE-52 ） 預(yù)溶脹微粒, 為中等堿性陰離子交換劑 上樣緩沖液低離子強(qiáng)度緩沖液： 0.02 M 磷酸緩沖液 - 0.02 M NaCl （ pH8.0）洗脫緩沖液高離子強(qiáng)度緩沖液： 0.02 M 磷酸緩沖液 - 1 M NaCl （ pH8.0） 實(shí)驗(yàn)操作及注意事項(xiàng)

5、 預(yù)裝層析柱（注意：不要干柱） 柱的平衡 用10ml的上樣緩沖液過(guò)柱 濃縮前蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 取待濃縮的蛋白質(zhì)溶液在分光光度計(jì)上測(cè)定蛋白質(zhì)的OD280 和OD260值 上樣 加入低濃度蛋白質(zhì)溶液（保護(hù)膠面,讓樣品全部進(jìn)入樹脂中。 平衡（洗雜質(zhì)） 用20ml的上樣緩沖液流過(guò)柱子。 洗脫 用20ml洗脫緩沖液過(guò)柱，回收蛋白。（收集4管，每管3ml） 測(cè)定蛋白濃度 在收集的過(guò)程中測(cè)定每管溶液的OD280和OD260讀數(shù)，選取濃度最高管為濃縮蛋白計(jì)算濃縮倍數(shù)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的原理原理：酪氨酸、色氨酸的苯環(huán)共軛雙鍵，OD280優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、樣品可以回收缺點(diǎn)：有一定的誤差（酪氨酸、色氨酸含量差異）受核酸類物質(zhì)干擾注意： 在紫外光下檢測(cè)，使用石英杯實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果分析 在280nm和260nm兩處波長(zhǎng)分別測(cè)得光密度值、再按下列公式計(jì)算。 OD值大于1的稀釋5倍再測(cè) 1、OD280OD2601.5時(shí)，用Lowry-Kalokar公式： 樣本蛋白質(zhì)含量(mgm1) 1.5OD2800.75OD2602、OD280OD2601.5時(shí)，用Lamb