食品安全與農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)

1、食品安全與農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè) Food Safety and Analysis of Agricultural Products Quality Safety1 資源環(huán)境學(xué)院 鄭險(xiǎn)峰 2第三章 蛋白質(zhì)和主要必需氨基酸的測(cè)定第一節(jié) 概述3一、概述 農(nóng)產(chǎn)品包括農(nóng)作物及果蔬收獲物中的各個(gè)部分，如籽粒、果實(shí)、莖葉、秸稈等。它們無論作為食物、飼料或是農(nóng)產(chǎn)品加工的原料，都要求確知這些產(chǎn)品中各組分的含量。這些組分有蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪，淀粉、糖分、水分、纖維素、有機(jī)酸類以及一些特殊的成分如維生素、單寧、大量和微量元素等等，它們含量的多少是鑒定其品質(zhì)好壞的重要標(biāo)志。當(dāng)前要求大力開發(fā)利用農(nóng)產(chǎn)品資源，以滿足愈來愈高的社會(huì)

2、需求。因此，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行品質(zhì)分析無疑是十分需要的。4蛋白質(zhì)是植物的重要組成成分，也是農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)中最重要的成分。它的含量依作物種類、部位、生育時(shí)期、品種特性而有變化。植物各部位器官中蛋白質(zhì)含量也不同，其中以籽粒中最多，如豆類可達(dá)45一55，其次是花、葉、莖和根。作物在不同的生育階段根部位吸收的氮，不斷向新生組織輸送，在接近成熟時(shí)期，莖葉中的氮向貯存器官輸送，合成的蛋白質(zhì)集中于種子中。 5各種農(nóng)產(chǎn)品中蛋白質(zhì)的含量水平（%） 作物蛋白質(zhì)（干基）作物蛋白質(zhì)（干基）作物蛋白質(zhì)（干基）作物蛋白質(zhì)（干基）菜豆洋扁豆速豌豆蠶豆大豆亞麻向日葵(仁)棉籽(仁)小麥黑麥15.030.524.634.122.034.

3、027.035.029.450.42.030.821.130.228.642.019.330.014.424.1大麥燕麥稻米玉米小米(仁)高梁蕎麥(仁)10.620.48.017.37.814.59.013.210.221.59.515.312.819.0馬鈴薯冬油菜甜菜蘿卜胡蘿卜洋蔥大蒜菠菜芹菜番茄0.72.71.01.50.71.40.61.20.61.91.92.86.72.31.33.60.30.8茄辣椒南瓜黃瓜甘藍(lán)花椰菜漿果核桃高梁葉高梁莖0.61.20.71.10.41.00.50.91.22.62.40.31.916.128.912.417.54.07.56蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)

4、，它的含量是衡量農(nóng)、畜、水產(chǎn)品品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。測(cè)定植物各部分中蛋白質(zhì)的含量，對(duì)其品質(zhì)鑒定、品種選育、改善作物生育條件和調(diào)節(jié)作物體內(nèi)新陳代謝和提高蛋白質(zhì)含量等有重要意義。也對(duì)產(chǎn)品加工方式及其產(chǎn)品質(zhì)量有影響：在育種、食品和飼料等工作中常常需要測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。 7氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物：全氨基酸和個(gè)別氨基酸的分析測(cè)定是研究蛋白質(zhì)、酶的化學(xué)組成及性質(zhì)的重要手段。生物學(xué)及農(nóng)業(yè)科學(xué)的許多領(lǐng)域都需要分析氨基酸。在評(píng)價(jià)谷物的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值時(shí)需要測(cè)定游離氨基酸及蛋白質(zhì)的氨基酸組成。動(dòng)植物產(chǎn)品中的氨基酸以多種形式存在，大致可分為構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸和游離的氨基酸兩種。8 在人

5、和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)上，各種氨基酸含量的高低是很重要的，特別是有幾個(gè)限制性氨基酸，如稱為“第一、第二限制氨基酸”的賴氨酸和色氨酸，是一種必需氨基酸，即必須從食物中直接吸收，而不能由人與動(dòng)物自身合成，卻又對(duì)人與動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用的氨基酸。若缺乏這些氨基酸，人與動(dòng)物不僅不能正常發(fā)育，還會(huì)引起某些疾病，而這些氨基酸在貯存和加工的過程中極易損失破壞，因此它們的實(shí)際含量已成為衡量谷物、飼料蛋白質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。9蛋白質(zhì)的分析方法很多?？煞譃閮深悾阂皇抢玫鞍踪|(zhì)的共性，即含氮量等；另一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。最常用的方法是開氏法，因其含有氨基酸、酰胺等非蛋白質(zhì)

6、氮，故稱“粗蛋白質(zhì)”，如果蛋白質(zhì)用重金屬鹽等沉淀分離以后，進(jìn)行全氮測(cè)定，由氮換算而成的蛋白質(zhì)的含量，則稱為“純蛋白質(zhì)”。 蛋白質(zhì)的測(cè)定10籽粒中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC法)同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)蛋白質(zhì)的測(cè)定提綱11 開氏法是測(cè)定全氮量的經(jīng)典方法。這個(gè)方法是丹麥人開道爾(J.Kjeldahl)于1883年用來研究蛋白質(zhì)變化的，后來被用于測(cè)定各種形態(tài)的有機(jī)氮。由于設(shè)備簡(jiǎn)單易得，結(jié)果可靠，為一般實(shí)驗(yàn)室所采用。至今尚無別的方法能與其比擬或?qū)⑵淙〈?。因此國際谷物化學(xué)協(xié)會(huì)(ICC)和美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)以及我國等些國家都把開氏法作為標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。12

7、但開氏法也有缺點(diǎn)，主要是操作手續(xù)較繁，分析的速度較慢，試劑費(fèi)用較高。近年已出現(xiàn)幾種以開氏法原理為基礎(chǔ)的全自動(dòng)或半自動(dòng)的開氏定氮儀，如瑞典的Tecator公司生產(chǎn)的開氏1030分析儀(Kjeltec Auto 1030 Analyzer)、日本生產(chǎn)的kjel-Auto自動(dòng)氮和蛋白質(zhì)分析儀和丹麥FOSS公司生產(chǎn)的KjelFOSS自動(dòng)蛋白質(zhì)分析儀等。這些儀器雖然自動(dòng)化程度較高，但較昂貴，目前尚不能普及。 13籽粒中粗蛋白質(zhì)的測(cè)定 H2SO4一K2SO4一CuSO4一Se消煮法 方法原理 氮素是蛋白質(zhì)中的主要成分，同類植物籽粒中蛋白質(zhì)的含氮量基本上是固定不變的。因此，可用開氏法消煮定氮，再將測(cè)得的含氮

8、值乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得粗蛋白質(zhì)含量。 在生產(chǎn)和科研工作中，為了完成大批樣品的分析，需要采用快速、簡(jiǎn)易的分析方法，例如染料結(jié)合法、雙縮脲法、水合茚三酮法、熒光法、紅外光譜法以及測(cè)定開氏消煮液中銨的靛酚藍(lán)法和納氏比色法?；靥峋V目錄14 氮含量換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般采用，這是由蛋白質(zhì)平均含氮16%為根據(jù)導(dǎo)出的值，但不同植物籽粒中蛋白質(zhì)的含氮量有差異，故由氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)也稍有不同。15 以定量蛋白質(zhì)為目的的總氮量測(cè)定中，開氏法分解時(shí)，硝態(tài)氮的部分氨化是不可避免的，因此蔬菜類特別是可能含有硝態(tài)氮的化合物的樣品，需要用水楊酸固定硝態(tài)氮化合物，用開氏分解測(cè)定總氮量，同時(shí)用離子電極法測(cè)定硝態(tài)氮的含

9、量，再從總氮量減去硝態(tài)氮量后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)即得蛋白質(zhì)含量。 16操作步驟(1) 樣品的消煮。稱取烘干樣品(過篩置于50mL或100mL開氏瓶或消煮管中，加入混合催化劑，加幾滴水濕潤(rùn)后，加5mL濃H2SO4，小心輕搖后(最好加塞放置過夜)，蓋上小漏斗，將消煮管放置在消煮爐或電爐上，開始時(shí)用小火加熱，待消煮液呈棕色時(shí)，可提高溫度，消煮至溶液呈清亮帶淺藍(lán)色時(shí)，再加熱約10min，取下冷卻至溫?zé)釙r(shí)，將消煮液無損地轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，冷卻至室溫后定容并放置澄清。 17（2）氮的測(cè)定。用移液管吸取澄清待測(cè)液或放入半微量定氮儀中進(jìn)行定氮。同時(shí)作空白試驗(yàn)和核對(duì)試驗(yàn)。 18本法測(cè)定的結(jié)果為粗蛋白質(zhì)的含量

10、。如要測(cè)定純蛋白質(zhì)的含量，則樣品應(yīng)先用蛋白質(zhì)沉淀劑堿性硫酸銅、堿性醋酸鉛、200gL-1 250gL-1單寧或100gL-1三氯乙酸等處理，將蛋白質(zhì)從水溶液中沉淀出來，再測(cè)定此沉淀的全氮量，乘以蛋白質(zhì)的換算系數(shù)即可得：“純蛋白質(zhì)”量。19稱樣量的大小取決于樣品的含氮量。若含氮為，稱樣量為，可根據(jù)含氮量的水平適當(dāng)增減稱樣量。在消煮過程中須經(jīng)常轉(zhuǎn)動(dòng)開氏瓶，使噴濺在瓶壁上的樣品及早回流至硫酸溶液中，特別是開始消煮后不久，會(huì)有大量氣泡向上逸，不宜升溫過快，以防溢出?；靥峋V目錄20 方法原理 蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)的NH2、咪唑基和胍基以及蛋白質(zhì)末端自由氨基在pH=23的酸性緩沖

11、液體系中呈陽離子狀態(tài)存在，可以和偶氮磺酸染料類物質(zhì)如橘黃G、酸性橙12#等的陰離子結(jié)合，形成不溶于水的蛋白質(zhì)-染料絡(luò)合物而沉淀下來，通過測(cè)定一定量樣品與一定量體積的已知濃度染料溶液反應(yīng)前后溶液中染料濃度的變化，可計(jì)算出樣品的染料結(jié)合量，即每克樣品所結(jié)合的染料的毫克數(shù)。染料結(jié)合量的大小反映出樣品中堿性氨基酸的多少。在小麥、大麥、水稻、大豆、花生等種子中蛋白質(zhì)的含量與堿性氨基酸的含量之間有很好的相關(guān)性。同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(染料結(jié)合-DBC法)回提綱目錄21 如果要從染料結(jié)合量來計(jì)算樣品的粗蛋白質(zhì)的含量，則需用開氏法測(cè)定同類種子的一批樣品的粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時(shí)也用染料結(jié)合法測(cè)定其染料結(jié)合量，

12、然后求出粗蛋白質(zhì)含量()對(duì)染料結(jié)合量的回歸方程或繪出回歸曲線。這樣，測(cè)定未知樣品的染料結(jié)合量，就可以從回歸方程計(jì)算或查回歸線得到粗蛋白質(zhì)()含量。若只需比較蛋白質(zhì)含量的高低，如在篩選同種作物種子的大批樣品時(shí)，不必知道蛋白質(zhì)的絕對(duì)含量，只要測(cè)定樣品的染料結(jié)合量即可進(jìn)行比較。22 該法是間接測(cè)定種子中蛋白質(zhì)的方法。方法簡(jiǎn)單、快速，與開氏法的相關(guān)性較好，但準(zhǔn)確性較差，適用于大批樣品的篩選工作。美國谷物化學(xué)協(xié)會(huì)將該法列為分析小麥蛋白質(zhì)含量的正式方法。有據(jù)此方法原理而設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)分析儀。這里必須指出該法對(duì)隨意混合物的樣品不適用。 23操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。與樣品測(cè)定的同時(shí)，取1.000 gL-1的染料溶

13、液10、30、50、60、70、80mL放人100mL容量瓶中，用水定容，即得濃度系列為、0.8gL-1的染料標(biāo)準(zhǔn)溶液，用GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀測(cè)透光率(T)，并用半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制濃度-透光率(T)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如無該型號(hào)的蛋白質(zhì)分析儀，也可以把殘余的染料溶液用水稀釋50倍后，用比色杯和482nm的波長(zhǎng)，在721分光光度上測(cè)定吸收值(A)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。24 樣品的測(cè)定。稱取通過篩子的谷物樣品200700mg，放人30mL試管中，加入lmgmL-1染料溶液20mL，蓋緊試管口，在水平振蕩器上振蕩60min，使樣品和染料溶液充分反應(yīng)，取反應(yīng)后的渾濁液(810mL)注入離心管中，以3 000

14、rmin的速度離心812min，至上部溶液澄清為止，以下操作步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線。 25 (3) 回歸方程。選取粗蛋白質(zhì)含量從低到高(如小麥種子粗蛋白質(zhì)含量可以從17.0%)的同一類谷物樣品35個(gè)左右，用開氏法測(cè)其粗蛋白質(zhì)含量()，并用上述方法測(cè)定各樣晶的染料結(jié)合量。根據(jù)所得的結(jié)果，計(jì)算 出染料結(jié)合量與蛋白質(zhì)含量()之間的回歸方程。26式中：B每克樣品所結(jié)合的染料的毫克數(shù)(mgg-1)；V加入染料溶液的總體積(mL)； P0染料溶液的初始濃度(mgmL-1)；P染料結(jié)合反應(yīng)后殘余溶液中染料濃度(mgmL-1)； m樣品的質(zhì)量(R)。樣品的蛋白質(zhì)含量()。將樣品的DBC值(即“B”值)代入回歸方程，計(jì)

15、算樣品蛋白質(zhì)的含量。 27注在偶氮磺酸染料中，除橘黃G外，也可以使用酸性12#(Acid Orange l2#，縮寫AO l2，分于量305.37)，它的分子結(jié)構(gòu)與橘黃G基本相同，也含有一個(gè)偶氮發(fā)色基團(tuán)，但只有一個(gè)磺酸基，即一個(gè)結(jié)合堿基的位置(橘黃G二個(gè))，后者每個(gè)堿基結(jié)合點(diǎn)引起的顏色變化約是橘黃G的2倍。故其更適合于在染料結(jié)合法中應(yīng)用，它們?cè)?82nm左右有一個(gè)較寬的吸收峰，便于比色測(cè)定。 28 樣品稱樣量按蛋白質(zhì)含量的高低而定。水稻、小麥、大麥等可稱取500mg，玉米稱取700mg，大豆稱取200mg，花生及魚粉等可少一些。 染料結(jié)合反應(yīng)的條件，如染料的pH、樣品的粒度、振蕩反應(yīng)的時(shí)間和溫

16、度等影響到測(cè)定結(jié)果，故應(yīng)力求每次測(cè)定的反應(yīng)條件一致，特別是測(cè)定樣品與測(cè)定回歸方程的樣品時(shí)的反應(yīng)條件一致。 回提綱目錄29方法原理 蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)，具有類似于雙縮脲的反應(yīng)基團(tuán)。在堿性條件下能與Cu2+生成紫紅色可溶性絡(luò)合物，蛋白質(zhì)含肽鍵多時(shí)反應(yīng)呈紫色，反之肽鍵少時(shí)，反應(yīng)呈紅色。這種顏色反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)(或稱縮二脲反應(yīng))。 實(shí)驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)溶液濃度在1-15mg之間，其呈色溶液的吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比關(guān)系。故可用此反應(yīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)的測(cè)定。 同類種子中蛋白質(zhì)的測(cè)定(雙縮脲法)回提綱目錄30 本法須用開氏法作標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。經(jīng)試驗(yàn)其與開氏法的相關(guān)性較好，適用樣品廣泛，如小麥、大麥、水稻、玉米和高粱等

17、蛋白質(zhì)的測(cè)定，皆能獲得良好的效果，且方法快速，使用儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，尤適用于大批品種選擇用。 31主要儀器 恒溫水浴鍋、離心機(jī)、721型分光光度計(jì)。試劑 雙縮脲試劑。在500mL容量瓶中依次加入下列溶液: 40gL-1CuSO4 30mL，25gL-1酒石酸鉀鈉100mL，再緩慢加人5molL-1 KOH30mL，用去離子水定容。使用時(shí)將此溶液與等體積透明的異丙醇混合。若溶液中出現(xiàn)渾濁或沉淀，則不宜使用。32操作步驟 (1)樣品的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取過60目篩的樣品0.100g(含蛋白質(zhì)在115gL-1范圍內(nèi))，放人干燥試管中，再用移液管加入10mL雙縮脲試劑，充分?jǐn)嚢瑁?0水浴放置15min，并經(jīng)常

18、攪拌。然后過濾或用4 000rmin-1離心10min，取清液用550nm波長(zhǎng)比色，從標(biāo)準(zhǔn)回歸方程查得蛋白質(zhì)含量。 33 (2)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程的測(cè)定。分別稱取0.050 00.120 0g待測(cè)定谷物樣品20-30個(gè)(也可用蛋白質(zhì)含量差異大的樣品30個(gè)左右)，先用開氏法測(cè)出具蛋白質(zhì)的含量，然后按上法顯色并測(cè)定吸收值A(chǔ)，作出標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。 34注 該法為美國谷物化學(xué)協(xié)會(huì)(AACC)測(cè)定谷物蛋白質(zhì)的正式方法，且已有據(jù)此法原理為基礎(chǔ)的快速測(cè)定蛋白質(zhì)的自動(dòng)分析儀。一般的生化分析中采用的雙縮脲試劑是堿性硫酸銅水溶液，不適用于種子蛋白質(zhì)的分析，因?yàn)樗环€(wěn)定，而且會(huì)浸出有色物質(zhì)、脂肪及一些淀粉物質(zhì)，干擾比色測(cè)定

19、。而異丙醇雙縮脲試劑，可以減少這些物質(zhì)的溶解，排除干擾。本法對(duì)溫度及時(shí)間的要求嚴(yán)格，否則再現(xiàn)性不高。采用室溫20-25，須于120190min內(nèi)比色；40為15-70min顯色穩(wěn)定；而在60連續(xù)振蕩條件下顯色，則反應(yīng)時(shí)間縮短為5min。離心須用6 000rmin-1，10min可得澄清液，小于4000rmin-1的效果不佳。 回提綱目錄35氨基酸的測(cè)定氨基酸分析方法包括測(cè)定氨基酸的總含量及測(cè)定全氨基酸中每種氨基酸的含量?jī)蓚€(gè)方面。測(cè)定氨基酸總量的方法與蛋白質(zhì)分析有密切的關(guān)系。許多測(cè)定蛋白質(zhì)含氮含量的方法如開氏定氮法及各種比色法均可用于測(cè)定氨基酸的總含量。此外，測(cè)定氨基酸總含量的方法還有氨基氮的甲

20、醛滴定法，方法簡(jiǎn)單，快速，廣泛應(yīng)用于實(shí)際工作中。 36近代發(fā)展起來的各種色譜法是分析全氨基酸的有力工具，薄層層析是60年代發(fā)展起來的分析方法，它操作簡(jiǎn)便，設(shè)備簡(jiǎn)單、層析速度快、靈敏度高，廣泛應(yīng)用于分離和測(cè)定氨基酸。近20年來應(yīng)用氣相色譜法分析氨基酸已進(jìn)行了大量的工作。氣相色譜法具有分析速度快、靈敏度高的特點(diǎn)，儀器的成本也比氨基酸自動(dòng)分析儀低。尤其是在分析氨基酸的對(duì)映異構(gòu)物及超微量(ng)樣品中氣相色譜有特殊的作用。 37氨基酸自動(dòng)分析儀是應(yīng)用最廣泛的分析氨基酸的專用儀器。該儀器的基本原理仍然是離子交換柱層析。38氨基酸自動(dòng)分析儀39全氨基酸和游離氨基酸的分析 谷物和飼料中賴氨酸的測(cè)定 (染料結(jié)

21、合法-DBL法) 谷物和飼料中賴氨酸的測(cè)定 (染料結(jié)合法-DBL法) 氨基酸的測(cè)定提綱40全氨基酸和游離氨基酸的分析(氨基酸分析儀法)方法原理 氨基酸分析儀的中心是離子交換層析柱，當(dāng)流動(dòng)相(緩沖溶液)推動(dòng)氨基酸流經(jīng)裝有陽離子交換樹脂的色譜柱時(shí)(日立835-50為磺酸型Na+柱)，氨基酸與樹脂中的交換基團(tuán)進(jìn)行離子交換，當(dāng)用不同的pH值的緩沖溶液進(jìn)行洗脫時(shí)，因交換能力的不同而將氨基酸混合物分開，流出色譜柱的氨基酸再與茚三酮在100下反應(yīng)生成紫色物質(zhì)茚二酮炔-茚二酮胺(DYDA)，顯色后的氨基酸由光度計(jì)檢測(cè)；回提綱目錄41大多數(shù)氨基酸與茚三酮均有此反 應(yīng)，所形成的DYDA在570nm處有最大的吸收峰

22、。氨基酸自動(dòng)分析儀可直接給出50g樣品中含有各種氨基酸的納克(ng)數(shù)。42（二）儀器835型高速氨基酸分析儀。真空裝置。煤氣噴燈。使用硬質(zhì)玻璃水解管時(shí)，使用氧氣。恒溫器。110，最好用鋁合金制的熱處理槽。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。水解用玻璃試管。最好用硬質(zhì)玻璃制成。均化器（旋轉(zhuǎn)式混合器）。 43（三）試劑試劑6moLL-1 HC1。880mL-1甲酸。300gL-1H2O2。750mLL-1乙醇。檸檬酸鹽緩沖溶液和水合茚三酮溶液 44 操作步驟 (1) 全氨基酸試樣的制備。 取樣。按常法粉碎的試樣，精確稱取含蛋白質(zhì)約10mg的量，置于水解槽中，加6molL-1HCl 10mL。如果是液體試樣，加入與試樣等

23、量的濃鹽酸。 45 脫氣。在真空裝置上安裝水解管，用真空泵脫氣。將旋塞(圖142的A)開啟數(shù)次進(jìn)行脫氣。脫氣完后，在水解管的A處用煤氣噴燈溶化，使其密封。 水解。用110恒溫器水解22h。 去除鹽酸：水解完后，把水解管開封，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除鹽酸。干涸后，用蒸餾水溶解，再次干涸(在50以下干燥)， 試樣溶液的制備：去除鹽酸的試樣，溶于10mL的檸檬酸鈉緩沖溶液中。 46 (2) 胱氨酸及色氨酸的水解。 由于胱氨酸及色氨酸在用鹽酸水解時(shí)被破壞，所以必須另行分解。 胱氨酸。胱氨酸被過甲酸氧化成半胱酸后，用鹽酸水解。47色氨酸。色氨酸試樣要加堿水解。取含有色氨酸12mg的試樣，置于聚乙烯管中，將此管封

24、在玻璃管中。加入4.2molL-1氫氧化鈉溶液100mL和硫代二甘醇，脫氣后，封管，在110下水解24h。分解物用6molL-1 HCl 7mL中和，再用的檸檬酸緩沖溶液調(diào)整pH為，定容至一定量。48 (3) 植物性產(chǎn)品中游離氨基酸試樣的制備。 把試樣細(xì)切或粉碎，取20-50g置于乙醇中，使乙醇最終濃度為750mLL-1。通常取10mL左右，用均化器均質(zhì)后，移入燒瓶中，在80下加熱回流15min，然后冷卻，用瓷漏斗過濾，殘?jiān)?50gL-1乙醇50mL再提取兩次，濾液合并定容至250mL，放置一夜。生成沉淀時(shí)，用玻璃過濾器(G - 3)過濾或離心分離(6000 r/min，10min)，濾液用

25、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器去除水分，干涸物溶于試樣稀釋用的緩沖溶液中。 49 (4)上機(jī)測(cè)定。具體的測(cè)定操作步驟，應(yīng)根據(jù)各種不同型號(hào)的氨基酸測(cè)定儀詳細(xì)說明來進(jìn)行。一般需經(jīng)下列幾個(gè)步驟。樣品的水解。試樣中氨基酸濃度的估量，以日立835-50型高速氨基酸分析儀為例，上機(jī)分析的各種氨基酸濃度應(yīng)在110nmol50L為宜。分析前的儀器檢查，一般有水浴及反應(yīng)槽的溫度，泵的流速，緩沖液，茚三酮試劑以及N2氣壓力等儀器的各種性能檢查。50 分析程序的設(shè)定，須按儀器說明書推薦使用的分析程序操作?；旌习被針?biāo)準(zhǔn)樣的分析。樣品分析前的混合標(biāo)準(zhǔn)樣的分析，以打印出混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣層析圖譜的各種參數(shù)。試樣的分析。最后儀器分析試樣，打印

26、出全氨基酸的色譜圖，以繪出各氨基酸組分的納克數(shù)。然后計(jì)算。回提綱目錄51谷物和飼料中賴氨酸的測(cè)定(染料結(jié)合法-DBL法)回提綱目錄52 賴氨酸是一種必須的氨基酸。缺乏賴氨酸，人與動(dòng)物不僅不能正常發(fā)育，還會(huì)引起某些疾病。在絕大多數(shù)谷物中，賴氨酸是最缺乏的氨基酸，被稱為第一限制氨基酸。它在谷物貯存、加工過程中，又很不穩(wěn)定，易于脫去氨基、被氧化或是發(fā)生變質(zhì)而損失破壞，或變成營(yíng)養(yǎng)上的“無效”。因此賴氨酸的實(shí)際含量已成為衡量谷物、飼料蛋白質(zhì)的重要指標(biāo)。 53 測(cè)定賴氨酸的方法很多，屬于化學(xué)的方法有： 2，4，6三硝基苯磺酸(TNBS法)、1-氟-2，4-二硝基苯法(FDNB法、2-氯-3，5-二硝基吡啶

27、法(CNPY法)等。 這些方法共同缺點(diǎn)是操作手續(xù)繁長(zhǎng)費(fèi)時(shí)，還需要某些特殊的試劑，不適用于成批樣品的分析。離子交換色譜法(氨基酸自動(dòng)分析儀法)仍被認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)法，但儀器昂貴不能普及?，F(xiàn)介紹在國內(nèi)外應(yīng)用較廣泛的、簡(jiǎn)便易行的賴氨酸測(cè)定法。 54（一）方法原理 染料結(jié)合法可用于測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)的堿性氨基酸，包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸。如果先將樣品用丙酸酐處理，丙酸酐便將賴氨酸的-NH2的?；诒?，使其失去和染料結(jié)合的能力。 然后分別測(cè)定?；昂蟮腄BC值：?；暗臏y(cè)定值為賴氨酸+組氨酸+精氨酸。而酰化后只是組氨酸+精氨酸，以上兩項(xiàng)測(cè)定結(jié)果的差值，就可計(jì)算之賴氨酸的含量。 55試劑 (1) 磷酸鹽緩沖溶液

28、。 (2) 染料溶液。稱取酸性橙12#g，用磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至1000mL。 (3) 半飽和醋酸鈉溶液。 (4) 丙酸酐(化學(xué)純)。 56操作步驟 (1) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在樣品分析的同時(shí)，分別吸取3.89molL-1染料溶液、置于100mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液或水定容，即得濃度為、1.9molL-1的染料工作溶液。吸取各工作液分別加入NaOAc溶液及磷酸鹽緩沖液，充分混勻，在GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀上測(cè)定透光率。 在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，以透光率為縱坐標(biāo)，染料濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線(也可以用磷酸鹽溶液稀釋50倍后，用比色杯和482nm波長(zhǎng)，以721型分光光度計(jì)測(cè)吸收值A(chǔ)，用普通直線

29、坐標(biāo)紙繪制工作曲線)。 57(2) 樣品的測(cè)定。按下表稱取已粉碎過60目篩?；筒货；瘶悠犯鲀煞荩瑴?zhǔn)確至。分別加3035mL具塞玻璃的或聚四氟乙烯的試管中，標(biāo)明為A、B管(酰化樣品)和C、D管(不?；瘶悠?。同時(shí)應(yīng)另稱樣品測(cè)定水分含量。 58樣品種類稱樣量（mg）?；瘶悠凡货；瘶悠匪?稻麥 類普通玉米高賴氨酸玉米高 梁谷 子大 豆其它豆類花生仁向日葵子棉 子700或800500800700或5001000900180275300200125500或600400600400或5007007001001752001509059丙?；磻?yīng)。各管分別加入160gL-1乙酸鈉溶液2.00mL(秈稻加80

30、gL-1乙酸鈉溶液)，然后加丙酸酐于A、B管中，加緩沖溶液于C、D)管中。蓋緊塞子，置于往復(fù)振蕩機(jī)上振蕩10min。染料結(jié)合反應(yīng)。向A、B、C、D管中各加入3.89mmolL-1染料溶液，蓋緊塞子，放置振蕩機(jī)上振蕩1h(秈稻、豆類2h，油料種子2h或更長(zhǎng))，使染料結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡。 離心。將以上反應(yīng)液在30004000rmin-1下離心10min。測(cè)定。在GXD-201型蛋白質(zhì)分析儀上測(cè)透光率T值或721型分光光度計(jì)上測(cè)吸收值A(chǔ)值，同上操作步驟。60結(jié)果計(jì)算由測(cè)得透光率T或吸收值A(chǔ)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得或由回歸線計(jì)算得到的剩余染料溶液的濃度(mmolL-1)，樣品中的賴氨酸的濃度按下公式計(jì)算： 賴

31、氨酸()=3.89-(1.11cCD)/MCD-3.89-(1.11cAB)/mABV10-3146.2100 回提綱目錄61色氨酸的測(cè)定乙醛酸法 色氨酸是重要的必需氨基酸之一。它在人與動(dòng)物的新陳代謝中起著重要的作用，某些代謝產(chǎn)物對(duì)人類的大腦功能及生長(zhǎng)發(fā)育影響很大。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類缺乏色氨酸會(huì)患瘴皮病。然而色氨酸在絕大多數(shù)谷物中含量很低，且易被氧化和光解。它已被公認(rèn)為“第二限制性氨基酸”。因此，不管從育種還是從營(yíng)養(yǎng)的觀點(diǎn)出發(fā)，色氨酸的測(cè)定都是十分重要的?；靥峋V目錄62然而，色氨酸在酸性的介質(zhì)中很不穩(wěn)定。長(zhǎng)期以來，人們一直在探索一種能適用于多種材料而又簡(jiǎn)單易行的測(cè)定方法。目前提出的方法很多，歸結(jié)起來有三類：一是找出一種理想的水解方法，使色氨酸和其它的氨基酸一樣，且用離子交換鈀層進(jìn)行測(cè)定；二是暴露具有反應(yīng)活性的吲 哚環(huán)，然后與某些試劑反應(yīng)生成帶色化合物，進(jìn)行比色測(cè)定；三是利用色氨酸天然特有的近紫外吸收峰，對(duì)色氨酸進(jìn)行分光光度或熒光測(cè)定。其中乙醛酸法具有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)。63方法原理