親和層析法純化胰蛋白酶 第一部分 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡(jiǎn)介【共享-】

1、親和層析法純化胰蛋白酶第一部分 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡(jiǎn)介 1 內(nèi)容摘要 親和層析包括了一整套復(fù)雜的底物及其配體與生物大分子之間相互作用時(shí)所形成的獨(dú)特的生物學(xué)特性。在親和結(jié)合的過程中涉及到疏水力、靜電力、范德華力及空間阻力等因素的影響。 親和層析的概念可以理解為配基以共價(jià)鍵的形式與水不溶性固體載體共價(jià)結(jié)合， 形成具有高度專一性的親和吸附劑。以該介質(zhì)為填料填充親和層析柱，從復(fù)雜的混合物中有針對(duì)性分離某一種成分。 本實(shí)驗(yàn)以親和層析方法分離純化豬胰蛋白酶為目的，從豬胰臟提取液中分離純化胰蛋白酶，最終得到純度較高的胰蛋白酶。圍繞親和層析實(shí)驗(yàn)所涉及的蛋白質(zhì)和酶基本性質(zhì)及相關(guān)技術(shù)進(jìn)行綜合訓(xùn)練。其中主要包括親和層析介質(zhì)配

2、基的制備，親和介質(zhì)的合成，蛋白質(zhì)和酶的分離純化，酶活性的測(cè)定等內(nèi)容。 通過綜合訓(xùn)練，能夠系統(tǒng)掌握蛋白質(zhì)制備的基本原理和操作，學(xué)習(xí)如何進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，掌握實(shí)驗(yàn)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的問題進(jìn)行科學(xué)的分析。使學(xué)生在學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的同時(shí)，自覺培養(yǎng)分析問題和解決問題能力。 2實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆椒?掌握蛋白質(zhì)分離純化的基本原理與操作技術(shù) 掌握親和層析的基本原理及親和介質(zhì)合成技術(shù) 掌握胰蛋白酶活性及抑制活性測(cè)定的原理和方法 掌握消光系數(shù)法測(cè)定蛋白質(zhì)的原理及計(jì)算方法1. 3實(shí)驗(yàn)流程 雞蛋清 Spharose 4B 豬胰臟 提取 活化 提取 分離純化 純卵粘蛋白(CHOM) 活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗

3、提液 偶聯(lián) 激活 CHOM-Spharose 4B 胰蛋白酶提取液 親和層析 酶促動(dòng)力學(xué) 純胰蛋白酶 酶活性測(cè)定 酶蛋白含量測(cè)定1. 4要求掌握的技術(shù) 柱層析技術(shù) Sephadex G-25 分子篩層析 DEAE-Cellulose 離子交換層析 CHOM Sepharose 4B 親和層析 蛋白質(zhì)提取技術(shù) 10%TCA 提取雞卵粘蛋白 蛋白含量測(cè)定技術(shù) 消光系數(shù)法測(cè)定胰蛋白酶含量 消光系數(shù)法測(cè)定雞卵粘蛋白含量生物活性測(cè)定 胰蛋白酶比活性測(cè)定 雞卵粘蛋白抑制活性測(cè)定 親和介質(zhì)合成技術(shù) 載體-Sepharose 4B的前處理 載體 -Sepharose 4B的活化 活化載體-Sepharose

4、4B的偶聯(lián)第二部分 實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)一 雞卵粘蛋白的分離純化 1雞卵粘蛋白的基本性質(zhì) 分子量: 28000Da 分子組成: 四個(gè)分子量相近的亞基組成糖蛋白 糖基部分: D-甘露糖, D-半乳糖, 葡萄糖胺, 唾液酸 耐熱: 在80條件下,理化性質(zhì)不發(fā)生改變 耐有機(jī)溶劑: 在50%的丙酮溶液中,能保持良好的溶解度 耐沉淀劑: 在10%的TCA的溶液中不發(fā)生沉淀. 雞卵粘蛋白在10%的TCA不同pH值的溶液中的溶解狀態(tài)見表1。表1，雞卵粘蛋白在10%TCA溶液中的溶解度溶液pH 值 雞卵粘蛋白 雞卵清蛋白 等于3.5沉淀5%溶解95%沉淀95%溶解5%低于3.5沉淀溶解沉淀溶解高于3.5沉淀溶解沉淀溶

5、解1. 2.雞卵粘蛋白的提取 2.1提?。?每組發(fā)給50毫升的雞卵清加入一定體積的10% pH1.15 TCA溶液(輕輕攪拌一邊攪拌一邊加入),攪勻后用pH試紙檢查pH值,待pH穩(wěn)定在3.5 0.2后放置4冰箱過夜.： 轉(zhuǎn)移50毫升離心杯中,于3000rpm 離心15min。： 傾出上清液，濾紙過濾，濾去上浮脂類物質(zhì)和不溶物： 用1mol/L HCl 將溶液精確調(diào)至pH3.5。量取體積。：緩緩加入三倍體積預(yù)冷的丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴(yán)，放置冰箱內(nèi)靜止4小時(shí)。：虹吸出部分上清，將沉淀部分轉(zhuǎn)移到50ml離心杯中，于3000 rpm離心15min。：棄去上清液，將盛有沉淀的離心杯至于真空干燥器中。

6、抽去殘留丙酮。（沉淀物的顏色由白變成透明膠狀物即可）：加入25ml蒸餾水或20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液溶解，濾紙過濾，收集濾液，備用。 3雞卵粘蛋白的分離純化 3.1 Sephadex G-25 柱脫鹽 (1)溶脹： 稱取15g Sephadex G-25放入500ml的燒杯中, 加入200ml 蒸餾水，在室溫下溶脹24小時(shí)或在沸水浴中溶脹2小時(shí)。 (2)裝柱： 取一支303cm 的層析柱，將溶脹好的Sephadex G-25裝柱，自然沉降。 (3) 處理： 用2倍柱床體積的0.5mol/L NaCl 溶液洗柱，2倍體積的蒸餾水洗去殘留的NaCl。 (4)平衡： 用20mmol/L，

7、pH6.5磷酸緩沖液平衡，流速控制在1.0-1.5 ml/min。紫外檢測(cè)儀檢測(cè)柱內(nèi)平衡狀態(tài)，直到儀器繪出穩(wěn)定的基線。 (5)上樣： 將柱內(nèi)的緩沖液液面流至于膠面相切，取20ml雞卵粘蛋白提取液上樣，待樣液液面流至于膠面相切，加入2-3ml緩沖液沖洗層析柱內(nèi)壁，待溶液液面流至于膠面相切，然后加入緩沖液距膠面高度約2-3cm，以同樣的流速洗脫。 (6)收集： 在檢測(cè)儀上觀察到開始出現(xiàn)峰時(shí)進(jìn)行收集。見圖1 圖1 Sephadex G-25分子篩層析分離圖譜3.2 Cellulose離子交換柱層析分離 (1)溶脹： 稱取20g DEAE-Cellulose放入500ml的燒杯中, 加入150ml 蒸

8、餾水，在室溫下溶脹24小時(shí)。(2)裝柱： 取一支203cm 的層析柱，將溶脹好的DEAE-Cellulose裝柱，自然沉降。 (3) 再生： 用200ml 0.5mol/L NaCl 0.5mol/L NaOH 混合溶液洗柱，再用蒸餾水洗至流出液的pH值達(dá)到pH8.0。用200ml 0.5mol/L HCl溶液洗柱，再用蒸餾水洗至流出液的pH值達(dá)到pH6.0。 (4) 平衡： 用20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液平衡，流速控制在1.0ml/min。紫外檢測(cè)儀檢測(cè)柱內(nèi)平衡狀態(tài)，直到儀器繪出穩(wěn)定的基線。 (5)上樣： 將經(jīng)Sephadex G-25柱脫鹽的卵粘蛋白溶液上樣，用20mmol/L，

9、pH6.5磷酸緩沖液平衡，直到儀器繪出穩(wěn)定的基線。流速控制在1.0ml/min左右。 (6)洗脫： 用0.3mol/L NaCl - 20mmol/L，pH6.5磷酸緩沖液。 (7)收集： 在檢測(cè)儀上觀察到出現(xiàn)高峰時(shí)開始收集。見圖2圖2，雞卵粘蛋白在DEAE-Cellulose柱的分離 (1) 透析： 將經(jīng)DEAE-Cellulose柱分離的雞卵粘蛋白轉(zhuǎn)入透析袋內(nèi)，對(duì)蒸餾水透析，隔一段時(shí)間換一次水，直到滲出液經(jīng)BaCl2溶液檢查無氯離子存在，即可。 (2) 調(diào)pH值： 將透析好的雞卵粘蛋白溶液，用0.1mol/L HCl 精確調(diào)至pH4.0（最好一次調(diào)成功），量體積。 (3)丙酮沉淀： 加入3

10、倍體積的預(yù)冷丙酮，攪勻，用塑料薄膜封嚴(yán)，在冰箱內(nèi)靜止4小時(shí)以上或過夜。(4)離心： 虹吸出部分上清，將沉淀部分轉(zhuǎn)移到50ml離心杯中，于3000 rpm離心15min，收集沉淀。 (5) 干燥： 將盛有雞卵粘蛋白的離心杯放入真空干燥器中干燥。 (6) 收集雞卵粘蛋白成品，冰箱保存。4活性測(cè)定 (1)標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶活性測(cè)定 空白: 1.5ml緩沖液1.5ml底物混勻. 樣品: 1.5ml緩沖液1.5ml底物胰蛋白酶10l混勻,立即測(cè)定 (2)自提雞卵粘蛋白抑制活性測(cè)定 空白: 1.5ml緩沖液1.5ml底物混勻. 樣品: 1.5ml緩沖液雞卵粘蛋白10l胰蛋白酶10l混勻放置2min以上1.5ml

11、底物,立即測(cè)定(3) 雞卵粘蛋白含量測(cè)定 取透析液0.3ml稀釋10倍, 測(cè)定 A280. 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1)計(jì)算雞卵粘蛋白收率 (2)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶的比活性 (3) 計(jì)算雞卵粘蛋白的抑制活性。5 試劑配制 (1) 10%TCA溶液 , pH1.15 , 1500ml (50ml/組) (2) 0.05mol/L ,pH8.0 Tris-HCl緩沖液, (內(nèi)含0.2% CaCl2) 200ml (3) 2mmol/L BAEE底物溶液 200ml (4) 1mg/L Trypsin標(biāo)準(zhǔn)溶液 10ml 5. 2自配試劑 (1) 0.2mol, pH6.6, PBS緩沖液 120ml (10)

12、(2) 0.3mol/L NaCl 0.02mol/L , pH6.6, PBS緩沖液 100ml (5) 6時(shí)間安排星期上午（8：00-12：00）下午（12：00-6：00）晚上一講實(shí)驗(yàn)，配試劑提取雞卵粘蛋白，裝DEAE和G25柱，處理各柱二離心，丙酮沉淀，平衡G25柱和DEAE柱，離心，去丙酮上G25柱脫鹽，收集第一峰，上DEAE柱分離，收集第二峰，對(duì)蒸餾水透析過夜。三換水，取樣測(cè)粘蛋白抑制活性和標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶活性，透析液調(diào)pH4，丙酮沉淀。繼續(xù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)酶活性和抑制活性，離心，收集沉淀物4干燥。結(jié)束實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二 親和層析純化胰蛋白酶1 原理 雞卵粘蛋白(ovomucoid, 簡(jiǎn)稱CHOM)，

13、是胰蛋白酶的天然抑制劑，在pH7.8- 8.0的緩沖溶液中二者發(fā)生專一性的親和作用。以雞卵粘蛋白為配基，偶聯(lián)在已經(jīng)活化的瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)-Sepharose 4B上，制備成雞卵粘蛋白親和層析介質(zhì)（CHOM- Sepharose 4B）。然后通過親和層析法從胰蛋白酶粗提液中分離純化胰蛋白酶。常用的載體活化與蛋配基偶聯(lián)的方法有環(huán)氧氯丙烷活化和溴化氰活化法。反應(yīng)的基本原理如下圖所示： 活化 偶聯(lián) 親和結(jié)合 洗脫 溴化氰活化載體 與蛋白質(zhì)配基的偶聯(lián) 2親和介質(zhì)合成2.1瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)(Sepharose 4B)的活化2.1.1 瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)的處理稱取10克瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)，置于G-3玻璃

14、燒結(jié)漏斗內(nèi)，用溶液抽洗（少量多次），100ml 蒸餾水抽洗，抽干后轉(zhuǎn)移到100ml三角瓶中備用。 配方 瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)-QT410克 蒸餾水7ml 1,4二氧六環(huán)8 ml 環(huán)氧氯丙烷。 將配制的好介質(zhì)的三角瓶，放入45恒溫水浴中，于160轉(zhuǎn)/分鐘，振搖活化2小時(shí)。停止活化，轉(zhuǎn)移到G-3玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)，抽去活化劑，用100ml蒸餾水洗（少量多次），轉(zhuǎn)移100ml到三角瓶中，準(zhǔn)備偶聯(lián)。 稱取約100mg雞卵粘蛋白，用2CO3緩沖液充分溶解。取稀釋10倍測(cè)定OD280，計(jì)算溶液的蛋白濃度。然后將溶解好的雞卵粘蛋白溶液，轉(zhuǎn)移到100ml三角瓶中與活化的瓊脂糖凝膠介質(zhì)混勻。在40恒溫水浴中，于160

15、轉(zhuǎn)/分鐘，振搖偶聯(lián)22小時(shí)左右，停止偶聯(lián)。 取一個(gè)洗凈的500ml抽濾瓶，將已經(jīng)偶聯(lián)好的瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)轉(zhuǎn)移到G-3玻璃燒結(jié)漏斗內(nèi)抽濾，收集濾液，測(cè)定濾液中剩余的雞卵粘蛋白的含量。 用100ml 1.0mol/L NaCl溶液抽洗，100ml 蒸餾水抽洗，再用20ml 親和層析洗脫液洗滌。 將親和介質(zhì)轉(zhuǎn)移到50ml的小燒杯內(nèi)，加入20ml 親和層析平衡液，浸泡20分鐘，脫氣，裝柱。 3胰蛋白酶粗提液的制備3.1.1存在形式：胰蛋白酶通常是以胰酶原的形式存在于動(dòng)物的胰臟或其他組織中。在底物的誘導(dǎo)下或激活劑的作用下，酶原的C端水解，去6肽轉(zhuǎn)變成具有活性的胰蛋白酶。 - 6 肽 胰蛋白酶原 胰蛋白

16、酶 Ca+2 激活劑3.1.2等電點(diǎn)與分子量：胰蛋白酶原的 pI=10.8 ， 分子量：24000Da胰蛋白酶的 pI=8.9 ， 分子量：23700Da 3.1.3 穩(wěn)定性 胰蛋白酶在酸性環(huán)境中很穩(wěn)定，在堿性環(huán)境中容易自溶，在提取的過程中要注意溶液的pH值。當(dāng)溶液的 pH 2.0 容易變性 pH = 3.0 生物活性穩(wěn)定 pH 7.0 容易自溶(1)勻槳: 取約30克豬胰臟，剝?nèi)ソY(jié)締組織和脂肪，取凈重20-25克左右,剪成碎塊。轉(zhuǎn)移到組織搗碎器內(nèi),加入150ml 預(yù)冷的3.5%的乙酸酸化水,勻槳.(2)提取: 轉(zhuǎn)移到500ml燒杯中,用2mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值在3.5-4.0之間,10攪拌

17、提取約4小時(shí).(3)過濾: 取一塊紗布,折疊成四層,用水潤濕,放在玻璃漏斗上,將胰蛋白酶原提取液過濾,收集濾液.(4)酸化: 用2mol/L硫酸調(diào)節(jié)濾液的pH值至2.5-3.0之間,4冰箱靜止沉淀4小時(shí)以上。(5)過濾: 折疊濾紙過濾,收濾液。 (1)調(diào)節(jié)pH值: 用5mol/L NaOH 將濾液精確調(diào)節(jié)pH值至pH8.0,量取溶液體積.(2)加激活劑: 加入固體CaCl2使溶液的Ca+2 終濃度達(dá)到0.1mol/L,然后加入約5mg 結(jié)晶胰蛋白酶,混勻,激活.(3)激活時(shí)間: 在4冰箱內(nèi)激活12-16小時(shí), 在25恒溫水浴中激活2-4小時(shí).(1)活性測(cè)定:取1ml上清液分別測(cè)定蛋白濃度和活性

18、.具體操作見活性測(cè)定部分.(2)停止激活:等酶溶液的比活性達(dá)到1000u/mg左右, 用2mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH值到3.0.(3)過濾: 濾紙過濾,濾去CaSO4沉淀,收集濾液, 4冰箱保存. 4親和層析分離胰蛋白酶(1)裝柱:取一支層析柱(101.0cm),將合成好的親和層析介質(zhì)CHOM-Sepharose 4B 裝入柱內(nèi),自然沉降. (2)平衡:以0.1mol/L,pH8.0 Tris-HCl 緩沖液(內(nèi)含0.5mol/L KCl, 50mmol/L CaCl2)平衡.(3)上樣:將以經(jīng)激活的胰蛋白酶提取液, 用5mol/L NaOH 精確調(diào)節(jié)pH值至pH8.0, 濾紙過濾,取濾液上樣.通

19、過親和介質(zhì)的偶聯(lián)量和胰蛋白酶粗提液的比活性,計(jì)算出上樣所需體積.計(jì)算方法如下: 偶聯(lián)mg數(shù)0.861.3104(u/mg)上樣體積(ml)= 粗酶濃度(mg/ml)比活(u/mg)(4)平衡: 上完樣以后, 以0.1mol/L,pH8.0 Tris-HCl 緩沖液(內(nèi)含0.5mol/L KCl, 50mmol/L CaCl2)平衡,洗去未被吸附的雜蛋白。(5)洗脫: 等平衡到基線穩(wěn)定后,用0.1mol/L,pH2.5甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脫.收集洗脫峰。(6)親和層析洗脫曲線: 胰蛋白酶活性測(cè)定1胰蛋白酶活性測(cè)定 胰蛋白酶是一種蛋白水解酶,它除了能水解堿性氨基酸與其它氨基酸形成的

20、肽鍵外,還能水解堿性氨基酸所形成的酯鍵,催化活性具有高度的專一性.因此,可以用人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N- benzoyl-L-argine ethyl ester,簡(jiǎn)稱BAEE)為底物測(cè)定胰蛋白酶活性. N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)在堿性條件下,經(jīng)胰蛋白酶作用水解去一個(gè)乙基生成N-苯甲酰-L-精氨酸(BA), 催化反應(yīng)原理如圖所示。 由于BAEE在波長(zhǎng)253nm處的光吸收值遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于BA。因此，可以在加入酶為零點(diǎn),測(cè)定在X分鐘內(nèi)的遞增吸光值.通過酶的定義求出酶活性。 底物濃度 C =1mmol/L光程:L=1cm波長(zhǎng): =253nm 1個(gè)BAEE單位溫度: T=25體積

21、: V=3ml遞增值: O.D =0.001A (1)活性單位BAEE單位(u/ml) = N(稀釋倍數(shù))(2)比活性 測(cè)得的BAEE 活性單位(u/ml)BAEE單位(u/mg) = 胰蛋白酶濃度mg/ml)加入體積(ml) 2雞卵粘蛋白活性的測(cè)定 雞卵粘蛋白是胰蛋白酶的天然抑制劑,通常1g雞卵粘蛋白能抑制g胰蛋白酶的活性(相當(dāng)于1 : 0.86).在胰蛋白酶液中加入適量的雞卵粘蛋白,胰蛋白酶活性就會(huì)降低,胰蛋白酶遞減的活性就是雞卵粘蛋白的抑制活性.在同樣的條件下分別測(cè)定出未加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A1和加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性A2. 將A1 - A2就可以得到雞卵粘蛋白的抑制活性.計(jì)算

22、公式如下: (1)抑制活性 A1 A2BAEE單位(Iu/ml) = N(稀釋倍數(shù))A1 ：胰蛋白酶活性A2：加雞卵粘蛋白的胰蛋白酶活性(2)抑制比活 測(cè)得的BAEE 活性單位(Iu/ml)BAEE單位( Iu/mg) = 雞卵粘蛋白濃度(mg/ml)加入體積(ml) 3蛋白質(zhì)含量測(cè)定3.1消光系數(shù)的定義：在蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，芳香族氨基酸在280nm處有最大吸收峰。蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸的數(shù)量以及分子的緊密程度有差異，在280nm處的光吸收強(qiáng)弱不同。在一定的條件下，一種純的蛋白質(zhì)在在280nm處的光吸收值是一個(gè)常數(shù)。因此酶以純的蛋白質(zhì)在280nm處都有一個(gè)的消光系數(shù)A280。

23、用符號(hào)表示為E1%1cm。這個(gè)符號(hào)的定義是指在濃度為1%（W/V）的蛋白質(zhì)溶液中，測(cè)定光程為1cm 的條件下，該蛋白的吸光值。如:胰蛋白酶的E1%1cm是13.5，是指胰蛋白酶的濃度為1%(g/100ml)，光程為1cm時(shí)光吸收值A(chǔ)280 = 13.5。當(dāng)胰蛋白酶的濃度0.1g%(100mg/100ml)時(shí)，光程為1cm，光吸收值A(chǔ)280是1.35。當(dāng) 雞卵粘蛋白的濃度1% (g/100ml)時(shí)，A280是4.13，濃度100%(mg/100ml)時(shí)，A280是0.413。在計(jì)算時(shí)大多數(shù)使用的蛋白濃度都是100mg/100ml，即濃度為1mg/1ml。計(jì)算出來的蛋白濃度單位可以用mg/ml表示

24、。 A280稀釋倍數(shù)雞卵粘蛋白濃度(mg/ml) = A280稀釋倍數(shù)胰蛋白酶濃度(mg/ml) = 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1.1雞卵粘蛋白產(chǎn)率(mg/100ml蛋清)4.1.2親和介質(zhì)偶聯(lián)率( mg/ml介質(zhì))4.1.3胰蛋白酶活性回收率(純酶總活性/粗酶總活性)4.1.4親和介質(zhì)吸附率(mg/ml介質(zhì))4.1.5純化倍數(shù)(純酶比活/粗酶比活)4.2.1Sephadex G-25 層析曲線4.2.2Cellulose 層析曲線 試劑配制 1公用試劑 (1) 10%TCA溶液 , pH1.15 , 1500ml (50ml/組) (2) 0.05mol/L ,pH8.0 Tris-HCl緩沖液, (內(nèi)

25、含0.2% CaCl2) 200ml (3) 2mmol/L BAEE底物溶液 200ml (4) 1mmol/L Trypsin標(biāo)準(zhǔn)溶液 10ml (5) 2mol/L NaOH溶液 300ml (6.5ml/組) 1. 2自配試劑 (1) 5mol/L NaOH 溶液 20ml(2) 2mol/L H2SO4 溶液 20ml(3) 0.3mol/L NaCl 0.02mol/L , pH6.6, PBS緩沖液 100ml (4) 3.5%, pH3.0 HAC溶液 200ml2 ) 200ml(6) 0.1mol/L pH2.5 甲酸溶液(內(nèi)含0.5mol/L KCl) 100ml3緩沖液

26、 50ml*-158cfimpswzCGJMQTX#%)037adhknruyBEILOSVY$*-259cfjmptwzDGJNQUX#&)047aehkorvyBFILPSVZ$*+269cgjmqtwADGKNQUX!&)147behlorvyCFIMPSWZ$(+269dgjnqtxADHKNRUY!&-148beilosvzCFJMPTWZ%(+36adgknquxAEHKORVY!*-158bfilpswzCGJMQTW#%(037adhknruxBEHLORVY$*-258cfimpswzDGJNQTX#%)037aehkoruyBEILOSVZ$*+259cfjmptwADGK

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