醫(yī)學(xué)專題木瓜蛋白酶的固定化

1、酶的固定化萬(wàn)麗花 2011.11.4木瓜蛋白酶的固定12021/7/19 星期一食品酶學(xué) 研究生課件固定化酶的介紹1固定化酶的特點(diǎn)2酶固定化的方法3舉例：木瓜蛋白酶的固定及性質(zhì)研究4主要內(nèi)容22021/7/19 星期一食品酶學(xué) 研究生課件原因2固定化酶原因1酶一般以溶于水的狀態(tài)作用于底物，因此，當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時(shí)，一般難以回收，也難以從產(chǎn)物中除盡，又由于酶僅能使用一次，因此，使得產(chǎn)物純度不夠，且造成很大的浪費(fèi)。固定化酶的介紹酶對(duì)熱、酸、堿等有機(jī)溶劑均不穩(wěn)定，即使在酶反應(yīng)的最適環(huán)境中，也易失活。通過(guò)物理或化學(xué)法將酶束縛在一定的空間，使酶只能在此區(qū)間進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，能迅速與底物和產(chǎn)物分開，實(shí)現(xiàn)

2、重復(fù)使用。32021/7/19 星期一食品酶學(xué) 研究生課件優(yōu)點(diǎn)固定化酶的特點(diǎn)易與反應(yīng)液分開可反復(fù)使用，降低成本酶的穩(wěn)定性提高較易控制終止酶反應(yīng)的進(jìn)程產(chǎn)物純化簡(jiǎn)便42021/7/19 星期一食品酶學(xué) 研究生課件缺點(diǎn)固定化酶的特點(diǎn)酶活力有損失胞內(nèi)酶必須經(jīng)過(guò)酶的分離手續(xù)增加了生產(chǎn)的成本，工廠初始投資大與完整菌體相比不適于多酶反應(yīng)只能用于可溶性底物52021/7/19 星期一食品酶學(xué) 研究生課件酶固定化的方法 格子型包埋法 微膠囊型交聯(lián)法 共價(jià)結(jié)合法載體結(jié)合法 離子結(jié)合法 物理吸附法分離的酶 載體一定方式固定62021/7/19 星期一食品酶學(xué) 研究生課件包埋法-格子型原理：將酶包埋在聚合物的凝膠格子

3、中常用凝膠為：聚丙烯酰胺凝膠、明膠、 角叉菜膠EEEE72021/7/19 星期一包埋法-微膠囊型原理：以半透性的有機(jī)高聚物薄膜包圍含有酶分子的液滴，在有機(jī)溶劑中，含酶水溶液的液滴界面處，發(fā)生界面凝集作用，形成半透性膜，使酶被包裹于其中，阻止了酶的漏失。微囊直徑一般為m-幾百m的小珠特點(diǎn)：小分子底物能通過(guò)膜與酶接觸，產(chǎn)物也可釋放出來(lái)。82021/7/19 星期一載體吸附-共價(jià)結(jié)合法原理：酶蛋白上非活性必需基團(tuán)（氨基酸殘基）與載體通過(guò)共價(jià)鍵形成不可逆的聯(lián)結(jié)。載體：纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺衍生物優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合牢固，酶不易脫落，穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)：載體需活化，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件劇烈載體EEEEEE92

4、021/7/19 星期一載體吸附-離子結(jié)合法原理：酶蛋白的帶電基團(tuán)和含有離子交換基團(tuán)的固體載體由于離子效應(yīng)，將酶固定在離子交換基團(tuán)的非水溶性載體上。常見載體為： DEAE纖維素（二乙氨基已基纖維素）、 TEAE纖維素（三乙基氨基乙基纖維素）、DEAE葡聚糖凝膠特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，酶分子結(jié)構(gòu)及活性中心不變 102021/7/19 星期一 E 惰性載體 （不溶于水） 特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，吸附力弱；pH 、T、 底物濃度變化時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酶從載體上部分或全部脫落。 吸附活性碳硅膠石英硅藻土EEE載體吸附-物理吸附法112021/7/19 星期一交聯(lián)法原理：依靠雙功能基團(tuán)試劑，使酶蛋白分子間發(fā)生交聯(lián)，凝集成網(wǎng)狀結(jié)

5、構(gòu)，從而成為不溶性酶。特點(diǎn)：反應(yīng)條件劇烈、酶活力低、顆粒較細(xì)，一般不能單獨(dú)使用，常常和包埋法、吸附法等聯(lián)合使用。常用雙功能基團(tuán)為：戊二醛 -CHO-(CH2)3-CHO122021/7/19 星期一食品酶學(xué) 研究生課件一、微孔淀粉海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶（包埋法固定）固定方法二、金屬螯合載體定向固定化木瓜蛋白酶（載體吸附共價(jià)結(jié)合）舉例：木瓜蛋白酶的固定132021/7/19 星期一食品酶學(xué) 研究生課件實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果條件優(yōu)化：不同濃度的微孔淀粉對(duì)酶活力的影響不同濃度的海藻酸鈉對(duì)酶活力的影響不同濃度的GaG1溶液對(duì)固定化木瓜蛋白酶活力的影響固定化木瓜蛋白酶制備條件的正交試驗(yàn)包埋法固定木瓜

6、蛋白酶采用微孔淀粉海藻酸鈉包埋法固定木瓜蛋白酶，探討固定化條件、固定化木瓜蛋白酶及游離酶的酶學(xué)性質(zhì)。一種新型的變性淀粉，具有較大的比孔容和比表面積，可以吸附很多種功能性物質(zhì)凝膠劑游離木瓜蛋白酶活力的測(cè)定固定化木瓜蛋白酶的制備固定化酶活力測(cè)定固定化酶制備條件的優(yōu)化固定化酶性質(zhì)研究最佳制備條件為微孔淀粉濃度4，海藻酸鈉濃度3，CaC12濃度5.5。固定化木瓜蛋白酶的最適pH值為5.7，最適溫度72。142021/7/19 星期一實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、不同濃度的微孔淀粉對(duì)酶活力的影響：木瓜蛋白酶固定化的最適微孔淀粉濃度為4。隨著微孔淀粉濃度的增加，吸附木瓜蛋白酶的量會(huì)逐漸增加，但繼續(xù)加大微孔淀粉濃度就會(huì)使底

7、物運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散更加困難，降低酶活。152021/7/19 星期一實(shí)驗(yàn)結(jié)果：2、不同濃度的海藻酸鈉對(duì)酶活力的影響：隨著海藻酸鈉濃度的增加，包埋木瓜蛋白酶的量會(huì)逐漸增加，但繼續(xù)加大海藻酸鈉濃度就會(huì)使表面密度不斷加大，底物運(yùn)動(dòng)擴(kuò)散更加困難，降低酶活。木瓜蛋白酶固定化的最適海藻酸鈉濃度為3。162021/7/19 星期一實(shí)驗(yàn)結(jié)果：3、不同濃度的GaG12溶液對(duì)固定化木瓜蛋白酶活力的影響當(dāng)CaC12 濃度為55時(shí)酶活最高。一般情況下凝膠強(qiáng)度與鈣離子濃度成正比，但由于有微孔淀粉的存在使鈣離子對(duì)木瓜蛋白酶的抑制作用發(fā)生變化，但總體上酶活是先升高后降低的。172021/7/19 星期一食品酶學(xué) 研究生課件利用金屬

8、螯合配體與蛋白質(zhì)相結(jié)合的原理，選用磁性瓊脂糖-亞氨基二乙酸（IDA）-Gu2+ 做為金屬螯合載體，定向固定木瓜蛋白酶。結(jié)果總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)步驟共價(jià)結(jié)合吸附固定木瓜蛋白酶實(shí)驗(yàn)原理1.載體的制備 2.酶的固定化 3.酶活的測(cè)定 4.載體吸附Gu2+ 的量對(duì)固定化酶的影響 5.固定化時(shí)間的影響 6.pH 對(duì)固定化酶的影響 7.給酶量對(duì)固定化酶的影響 8.固定化酶的性質(zhì)采用反相懸浮包埋法制備，利用原子吸收分光光度法測(cè)定上清Gu2+ 濃度，計(jì)算載體吸附Gu2+的量。取螯合載體，加入木瓜蛋白酶室溫下振蕩4h，用PBS洗滌數(shù)次至上清中檢測(cè)不到酶活，即得固定化的木瓜蛋白酶在使用金屬螯合載體定向固定化木瓜蛋

9、白酶時(shí)，固定化反應(yīng)條件溫和，對(duì)酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)影響小，酶活回收高；固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯提高；載體的載酶量大；載體的再生、酶的固定化過(guò)程操作簡(jiǎn)單；固定化酶及載體可多次重復(fù)利用182021/7/19 星期一實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1、載體吸附Gu2+ 的量對(duì)固定化酶的影響:當(dāng)Gu2+載體1.510-2mol/g 時(shí)，酶活隨給Gu2+量的增加而增加，這是因?yàn)榄傊荌DA只有在結(jié)合了Gu2+后才能以配位作用固定酶，隨給Gu2+量的增加載體表面固定木瓜蛋白酶的位點(diǎn)增多，導(dǎo)致載酶量增加而引起酶活上升；當(dāng)Gu2+載體 1.510-2mol/g時(shí)，載體表面的IDA 逐漸被Gu2+飽和至過(guò)飽和，載體的載酶量達(dá)到最大值，但被瓊

10、脂糖IDA載體過(guò)量吸附的Gu2+在隨后的酶反應(yīng)過(guò)程中溢出至溶液中抑制了木瓜蛋白酶的活性，使得酶活隨Gu2+量的增加而減少。192021/7/19 星期一實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析2.固定化時(shí)間的影響載體的載酶量隨固定化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，4h達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定。3.pH 對(duì)固定化酶的影響載體的載酶量隨PH 值的增大而增加，pH7 時(shí)飽和。202021/7/19 星期一4.給酶量對(duì)固定化酶的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析給酶量為10mg/g 載體時(shí)，酶的固定化率最高，隨著給酶量的增大，載體上金屬螯合配體結(jié)合位點(diǎn)逐漸飽和，固定化率逐漸降低，與此相反，所得的固定化酶的活力逐漸增加。根據(jù)以上結(jié)果，在固定化酶的制備實(shí)驗(yàn)中，每次給酶量為30mg/g 載體，這樣就能以較低的給酶量得到較高活力的固定化酶和較高的固定化率。212021/7/19 星期一參考文獻(xiàn)1、沈 斌，魏榮卿，歐陽(yáng)平凱等；胺化聚苯乙烯載體柔性固定化木瓜蛋白酶J;化 工 學(xué) 報(bào);2005.06,56(6):1070-1075.2、金 鋒;微孑L淀粉一海藻酸鈉固定化木瓜蛋白酶的研究J;中國(guó)釀造;2009,208(7):83-85.3、劉琳琳，曾力希，劉婷，鄧樂(lè);金屬螯合載體定向固定化木瓜蛋白酶的研究J;生物工程學(xué)報(bào);2005.09,21(5):789-793.4、程凡亮,陳伶利,王衛(wèi)等；氨基化二氧化硅顆粒固定