細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)

1、關(guān)于細(xì)胞的原代與傳代培養(yǎng)第一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月一、原代培養(yǎng) 概念：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條 件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為 原代培養(yǎng)。 第二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月原代培養(yǎng)技術(shù)的重要意義:原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點是細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體的遺傳性，而且大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出原來組織的特性。利用原代培養(yǎng)做各種實驗，如藥物測試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗效果很好。原代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系（株）必須經(jīng)過的階段。第三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月原代培養(yǎng) 消化法：這種培養(yǎng)過程主要是采用無菌操作的方法，把組織（或器官）從動物體內(nèi)取出

2、，經(jīng)酶消化處理，使分散成單個細(xì)胞，然后在人工條件下培養(yǎng)，使其不斷地生長和繁殖。消化法貼塊法冷消化溫消化一次性消化分次消化第四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月貼塊法消化法原代培養(yǎng)方法分類第五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月93分次消化 消化法的分類第六張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月解離釋放細(xì)胞的方法 最常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法。用酶學(xué)解離細(xì)胞法解離細(xì)胞是體外培養(yǎng)動物細(xì)胞時分散組織的基本方法，最常用的消化酶是胰蛋白酶和膠原酶兩種。 第七張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月動物細(xì)胞原代培養(yǎng)流程的示意圖 第八張，PPT共二十七頁，

3、創(chuàng)作于2022年6月器材和液體的準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)用的玻璃器材 培養(yǎng)瓶、吸管等在清洗干凈以后，裝在鋁盒和鐵筒中，干熱或濕熱滅菌后備用手術(shù)器材、瓶塞等 15磅，121，20分鐘蒸氣滅菌DMEM培養(yǎng)液、消化液、PBS液等 用濾器過濾后備用第九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月方法與步驟（舉例:心肌細(xì)胞消化培養(yǎng)法）（1）動物處死：將出生23d乳鼠，用拉頸椎方法處死。腹部向上釘在蠟盤中，用碘酒和酒精棉球擦拭腹部消毒。（2）剪取心臟：在無菌條件下將心臟（心尖）取出，置于無菌培養(yǎng)皿中，用Hanks液洗滌1-2次去除血污；放入另一培養(yǎng)皿中，縱向剪開心臟，仔細(xì)去除心腔內(nèi)血污后剪成1mm3大小的組織塊，再并用

4、Hanks液洗滌23次，直到液體澄清。第十張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）消化及分散組織塊：將上述清洗過的組織放入無菌三角燒瓶內(nèi)，加入56倍量的0.1胰蛋白酶液（pH7.4 7.6），置37恒溫磁力攪拌器上分次消化：每次消化8-10分鐘。在超凈臺中吸出胰蛋白酶液于帶蓋離心管中，加入2滴血清終止消化。直到組織塊基本消化完全。 各管配平后離心，收集細(xì)胞，無血清培養(yǎng)液洗2-3次后，將細(xì)胞懸液用兩層滅菌紗布過濾至另一燒杯中。第十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）計數(shù)與稀釋：從過濾的細(xì)胞懸液中取出1ml滴于血細(xì)胞計數(shù)板上，按白細(xì)胞法進(jìn)行計數(shù)；計數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的濃

5、度一般以每毫升含30 50萬個細(xì)胞為宜。（5）分裝與培養(yǎng)：將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，蓋好瓶蓋，在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，置于37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）觀察：逐日檢查培養(yǎng)物是否污染，觀察細(xì)胞生長情況。待細(xì)胞已基本長成致密單層時，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。第十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果:細(xì)胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層第十三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月貼塊培養(yǎng)步驟圖解 細(xì)胞原代貼塊培養(yǎng)法第十四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 VSMC

6、s原代培養(yǎng)第4天和第9天（100）第十六張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月二、傳代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞“一代”指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段期間，與細(xì)胞世代或倍增不同。在一代中，細(xì)胞倍增36次離體培養(yǎng)的細(xì)胞群體增殖達(dá)到一定密度時，細(xì)胞的生長和分裂速度就會減慢甚至停止，如不及時分離傳代培養(yǎng)，細(xì)胞將逐漸衰老死亡。第十七張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶以1:2或1:3比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化，把細(xì)胞分散成單細(xì)胞再傳代。懸浮型生長細(xì)胞則用直接傳代法或離心法傳代。第十八張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月方法與

7、步驟（一）貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)（1）選取生長良好的細(xì)胞，在超凈工作臺的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入23ml的D- Hanks液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在 細(xì)胞表面的碎片(思考：還有什么作用？）（2）加入適量0. 0.25胰蛋白酶消化液， 室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收 縮突起出現(xiàn)空隙時，倒去酶液。第十九張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）用Hanks液洗滌1次，加入適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹 打細(xì)胞，使其成細(xì)胞懸液。（4）以1：2或1：3進(jìn)行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo) 記，注明代號、日期，輕輕搖勻， 37 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 （5）觀察：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的

8、顏 色及細(xì)胞的生長情況。第二十張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月 VSMCs傳代培養(yǎng)第1天和第3天（100）第二十二張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）懸液細(xì)胞的傳代培養(yǎng)（1）取生長良好的細(xì)胞，在超凈工作臺用無菌吸管 把培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹打均勻。（2）轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，蓋緊膠蓋，平衡后離 心（1 000r/min）5min。（3）在超凈工作臺中吸去上清液，加入適量新培養(yǎng) 液，用吸管吹打細(xì)胞，制成懸液。（4）以1：2或1：3進(jìn)行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo) 記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37 CO2培 養(yǎng)箱培養(yǎng)。（5）觀察：細(xì)胞

9、培養(yǎng)24h后，即可進(jìn)行觀察。第二十三張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月傳代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果一般情況，傳代后的細(xì)胞在2小時左右就能附著在培養(yǎng)瓶壁上，24天就可在瓶內(nèi)形成單層，需要再次進(jìn)行傳代第二十四張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月三、人體活檢(或手術(shù))材料(1) 在準(zhǔn)備以臨床材料為實驗材料時,要預(yù)先與臨床外科醫(yī)生和護(hù)士商量,并做好一切必要的準(zhǔn)備工作。爭取拿到新鮮、無菌、少壞死的標(biāo)本。 (2)與臨床聯(lián)系好手術(shù)時間后，立即做好如下準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備好1-2個貯有培養(yǎng)液和抗生素的標(biāo)本收集瓶，將蓋蓋緊，保持無菌，瓶外貼上標(biāo)簽，寫上工作人員名字、地點和電話號碼；將收集瓶送往醫(yī)院，并與醫(yī)生和護(hù)士講清截取手術(shù)標(biāo)本的部位及注意事項。第二十五張，PPT共二十七頁，創(chuàng)作于2022年6月(3)標(biāo)本放入收集瓶后，送出手術(shù)間，立即送往組織培養(yǎng)實驗室。工作人員最好是等在手術(shù)間外。但有時手術(shù)時間難以掌握。則請護(hù)士將收集材料的瓶子蓋好后，放入4冰箱，盡快打電話通知工作人員。(4)取臨床標(biāo)本時，雖然盡可能做到無菌操作，但仍有污染可能性的存在?？蛇x