實(shí)驗(yàn)三 石蠟切片法

1、實(shí)驗(yàn)三 石蠟切片法 1 一般光鏡技術(shù) 組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 放射自顯影技術(shù) 電鏡技術(shù) 組織培養(yǎng)技術(shù)組織學(xué)的研究方法2 涂片法 鋪片法 磨片法 石蠟切片法 火棉膠切片法 冰凍切片法 一般光鏡技術(shù)非切片法切片法3 本實(shí)驗(yàn)主要掌握一般光鏡技術(shù)中的切片法石蠟切片技術(shù)。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c基本要求：掌握石蠟切片的制片技術(shù)和基本原理。要求用HE染色方法染色，獲得清晰的組織切片。4石蠟切片的流程1、取材2、固定3、組織塊修整4、洗滌5、脫水6、透明7、浸蠟與包埋8、切片與貼片9、脫蠟、復(fù)水（水化）10、染色11、脫水、透明12、封固51.取材動物致死方法：常用方法有麻醉法、空氣栓塞法、斷頭法、擊頭法、

2、股動脈放血法等；無尾兩棲類常用探針破壞腦和脊髓的方法處死，鼠類可用兩手（戴手套）用力拉，使顱骨和頸椎分離而導(dǎo)致延髓損傷致死。動物保護(hù) 組織材料新鮮 動作迅速6取材注意事項(xiàng)：要熟悉取材部位；所取材料盡可能新鮮；組織塊力求小而?。汉穸纫话悴怀^5mm為宜，較理想的厚度為2mm左右； 勿使組織塊受擠壓，以免破壞組織；保持材料清潔，以免影響觀察。 72.固定固定：固定是指處死的動物體或新取的組織塊投入固定液使其結(jié)構(gòu)得以凝固為不溶性物質(zhì)的過程。其目的在于保持組織內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及其組成，防止細(xì)胞組織死后的自溶和腐敗，使之盡量保持生前的狀態(tài)和結(jié)構(gòu)。 8 注射、灌注固定法 小塊組織固定法 常用的固定液有：

3、甲醛（福爾馬林）、酒精、醋酸、苦味酸、鋨酸、Bouins液等。 固定液的用量通常為材料塊的20倍左右；固定時(shí)間則根據(jù)材料塊的大小及松密程度以及固定液的穿透速度而定，可以從1小時(shí)至數(shù)天，通常為數(shù)小時(shí)至24小時(shí)。 常用的固定方法93.組織塊修整組織塊修整：經(jīng)過固定后的組織有一定的硬度，此時(shí)就可以做一些修整，但改變不要太大，只要將組織材料切取平整，修掉一些不規(guī)則的部位；過大、過厚的組織改小、改薄。104.洗滌洗滌：將殘余在組織內(nèi)的固定液清洗干凈，以免影響對組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的觀察、分析、研究。 常用的洗滌方法 水洗法（含有鉻、鋨的固定液固定的組織塊） 酒精洗滌法（含有苦味酸、酒精固定液固定的組織塊）115

4、.脫水 脫水：將組織塊內(nèi)的水份被置換出的過程叫脫水；脫水目的是使水分完全除去的同時(shí)使組織塊變硬?，F(xiàn)采用的脫水劑一般是乙醇或丙酮來進(jìn)行梯度脫水；脫水的時(shí)間，可根據(jù)組織的類型，大小而定。方法： 70% 80% 95%() 95%() 無水酒精（） 1-2h 1-2h 1-2h 1-2h 30min-1h 無水酒精（） 30min-1h 12脫水注意事項(xiàng)：原則是在脫水徹底的前提下，盡量縮短脫水的時(shí)間；脫水應(yīng)逐步而不應(yīng)跨越太大進(jìn)行；如需要可在70%的酒精中過夜或長期保存；如系胚胎或柔軟組織脫水，應(yīng)從更低濃度的酒精開始；每級脫水移入高濃度以前，應(yīng)用吸水紙吸凈表面的殘液。136.透明（媒浸）透明（媒浸）：

5、無水酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的酒精。材料塊在這類媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，此液即稱透明劑，透明劑浸漬過程稱透明。常用的透明劑有二甲苯、苯；透明劑的浸漬時(shí)間則要根據(jù)組織材料塊大小和性質(zhì)而定。方法: 純酒精:二甲苯（1:1) 二甲苯() 二甲苯（） 15min-30min 15min-30min 15min-30min 147.浸蠟與包埋浸蠟：是將已透明的組織塊移入熔化的石蠟內(nèi)浸沒的過程。目的是用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。通常浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點(diǎn)3左右的溫箱中進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)。方法：浸蠟（）浸蠟（）浸蠟（） 30min-1h 1

6、-2h 1-2h 15包埋：將浸蠟后的組織塊包在石蠟之中，并使組織塊與石蠟一起凝固成均勻一致的蠟塊的過程叫包埋。方法：將紙盒盛滿已融化的石蠟，隨即將第三杯中已浸蠟的材料放入其中，并排出里面的氣泡待石蠟表面凝結(jié)后，將紙盒進(jìn)入水中冷卻石蠟全部凝結(jié)后，拆去紙盒即成蠟塊。組織在蠟塊中可以長期保存。168.切片與貼片 切片： 1)修塊：切去組織標(biāo)本周圍過多的石蠟，不能留的過少，否則容易造成組織破壞。一般情況下在組織周圍應(yīng)留約 1-2mm的石蠟邊，把蠟塊修成上下兩對邊平行的方形或梯形，否則會造成石蠟切出的蠟帶不整齊或歪向一邊。 2)固著：將修好的蠟塊用蠟粘在大小適宜的小木塊上，木塊裝在切片機(jī)上，以待切片。

7、 3)切片：在旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)上將蠟塊切成5-10um厚的薄片。切下的薄片會連成蠟帶。用毛筆輕托輕取蠟帶，放在蠟帶盒內(nèi)備用。17切片修塊1818貼片：（粘片、表片、展片）是將已切成的蠟帶分割成小段后粘貼于載玻片的過程。用粘片劑將展平的蠟片牢附于載玻片上，以免在以后操作中材料脫落。在載玻片上涂抹粘片劑，再滴蒸餾水，放上蠟帶，置于調(diào)好溫度的水浴鍋上鋪展。將載玻片放入45溫箱中干燥。199.脫蠟及復(fù)水脫蠟：用二甲苯將組織中的石蠟溶解掉，石蠟將會妨礙染料進(jìn)入組織、細(xì)胞中而不易染色。復(fù)水：從第二杯二甲苯取出的切片經(jīng)100%95%80% 70%蒸餾水。在各液中停留15min。方法： 二甲苯（）二甲苯（）無水酒

8、精 95% 80% 10min 10min 5min 5min 5min 70% 蒸餾水 5min 5min2010.染色 最常用的染色法是蘇木精（hematoxylin)和伊紅（eosin）染色簡稱HE染色。配制后的蘇木精染液呈堿性，可使細(xì)胞核染成藍(lán)紫色；伊紅是酸性染料，可使多數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色。方法： 蘇木精自來水1%鹽酸酒精自來水 蒸餾水70%80%90%伊紅 15min 10-15min 數(shù)秒 沖洗15min 片刻 2min 2min 2min 5min 分色 藍(lán)化 2111.脫水、透明 脫水：染色以后，組織切片中有水分，則光不易通透，在顯 微鏡下觀察不清組織機(jī)構(gòu)，所以必須經(jīng)過脫水。 透明：以利于光線能透過組織切片，便于觀察組織、細(xì)胞的 結(jié)構(gòu)。 方法：95%()95%()無水酒精()無水酒精() 5min 5min 5min 5min 無水酒精:二甲苯（1:1）二甲苯（）二甲苯（） 5min 5min 5min2212.封固封固：將切片從二甲苯（）中取出，用紙或者布擦去材料周圍的二甲苯。在材料中央滴一滴中性樹