共焦顯微鏡下真菌菌絲形態(tài)的觀察分析

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專(zhuān)心-專(zhuān)注-專(zhuān)業(yè)專(zhuān)心-專(zhuān)注-專(zhuān)業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專(zhuān)心-專(zhuān)注-專(zhuān)業(yè)共焦顯微鏡下真菌菌絲形態(tài)的觀察分析作者：楊潔 牛際銘杜敏劉鈺邵玲閆淑來(lái)源：中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新2015年第36期【摘要】 目的：通過(guò)對(duì)共焦激光顯微鏡下不同真菌菌絲形態(tài)分析總結(jié)，為真菌性角膜炎臨床診斷治療提供指導(dǎo)，并為進(jìn)一步共焦激光顯微鏡下菌屬菌種鑒定研究提供參考。方法：回顧性分析本院2014年8月-2015年10月在共焦激光顯微鏡下查到菌絲的75例真菌性角膜炎患者的臨床資料，對(duì)比觀察共焦顯微鏡下不同時(shí)期和不同患者的各種菌絲形態(tài)，總結(jié)其特點(diǎn)。結(jié)果：不同真菌性角膜炎患者在共焦顯微鏡

2、下菌絲形態(tài)表現(xiàn)多樣，感染早期菌絲數(shù)量少，不易查到，需要仔細(xì)觀察。活動(dòng)期菌絲量較多，排列密集，不同菌種形態(tài)不同，有呈水平分布，長(zhǎng)線(xiàn)狀、竹節(jié)樣高反光，有節(jié)段或分支，有呈簇狀垂直或斜行分布，分支較多、較細(xì)；菌絲旁也可見(jiàn)小點(diǎn)狀、圓珠狀、短棒狀等真菌孢子樣形態(tài)，呈高反光，也有呈低反光表現(xiàn)，共48例48眼。使用過(guò)抗真菌藥物的部分病例可見(jiàn)斷裂的菌絲節(jié)段、腫脹菌絲，有的菌絲變得僵直，有的形態(tài)奇特，粗細(xì)不一?？拐婢幬镏委熀髲?fù)查的2例顯示菌絲減少或僅存少量節(jié)段，3例已查不到菌絲，病灶區(qū)上皮層完全修復(fù)，基質(zhì)層纖維化瘢痕形成，呈高反光。結(jié)論：共焦激光顯微鏡檢查是早期診斷真菌性角膜炎的一項(xiàng)有效手段，并能判斷病情轉(zhuǎn)歸及

3、指導(dǎo)藥物治療。【關(guān)鍵詞】 共焦顯微鏡； 菌絲； 真菌性角膜炎Observation and Analysis of Fungal Hyphae Form under Confocal Microscope/YANG Jie，NIU Ji-ming，DU Min，et al./Medical Innovation of China，2015，12（36）：044-047【Abstract】 Objective：To summarize the different morphological features of fungal hyphae under confocal laser micros

4、copy in order to provide guidance for clinical diagnosis and treatment of fungal keratitis and provide reference for further application of confocal laser microscope on the strains of fungi species identification.Method：The clinical data of 75 patients who were confirmed with fungal infection by con

5、focal microscopy in our hospital from August 2014 to October 2015 were retrospectively analyzed.The fungal hyphal morphology at different infection periods and different patients under confocal laser microscope were observed and analyzed，their characteristics were summarized.Result：In the early stag

6、e of infection，the hyphae amount was less，it was not easy to be found，which requiring careful observation.In the active stage of infection，the hyphal quantity was more and intensive，the forms were different in different strains.Some hyphae were with a horizontal distribution，long line，bamboo sample

7、with high reflective，hyphal segments or branch.Some hyphae showed like clusters with vertical or diagonal line distribution，more branchs and finer.Near the hyphae，small dot，round bead shape and short rod shape fungal spores were visible，which showed highly reflective or low reflective，there were 48

8、eyes of 48 cases in this stage.some cases who once used antifungal drugs before the first time confocal laser microscopy examination showed fracture segment，swelling hyphae，some hyphae became rigid，some cases manifested strange shape and different thickness.After effective antifungal drug treatment，

9、2 cases of the re-examination patients showed that the density of hypha were reduced or only remaining a small number of segments，3 cases of the re-examination patients were with no hyphae.Epithelium in the lesion area was completely repaired，fibrous scar formed in the stromal layer with high reflec

10、tion.Conclusion：Confocal laser microscopy is an effective method of early diagnosis of fungal keratitis.It can evaluate the outcome and direct the treatment of antifungal medication.【Key words】 Confocal microscopy； Hypha； Fungal keratitisFirst-authors address： The Second Peoples Hospital of Zhengzho

11、u City，Zhengzhou ，Chinadoi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.36.015真菌性角膜炎是真菌直接感染角膜引起的一種嚴(yán)重的致盲性角膜病，是感染性角膜病致盲的首位原因1。該病若控制不及時(shí)，極易造成角膜穿孔、前房積膿、眼內(nèi)炎等嚴(yán)重后果，因此對(duì)本病的早期診斷和治療尤為重要。角膜共焦激光顯微鏡是一種快速、有效、無(wú)創(chuàng)傷、可重復(fù)進(jìn)行的活體檢查方法，能動(dòng)態(tài)觀察真菌感染在不同時(shí)相角膜組織中的菌絲和孢子的情況，并能動(dòng)態(tài)觀察治療效果，敏感性和安全性高，越來(lái)越得到臨床廣泛的認(rèn)可。但是，應(yīng)用共焦顯微鏡診斷真菌性角膜炎尚依賴(lài)檢查者的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，目前，可供參考的真菌菌絲共焦

12、圖片有限，本研究通過(guò)對(duì)75例在共焦顯微鏡下明確查到菌絲的真菌性角膜炎患者的菌絲形態(tài)進(jìn)行仔細(xì)觀察分析后，發(fā)現(xiàn)真菌菌絲的形態(tài)各異，患病初期、活動(dòng)期，用藥后，以及不同菌種形態(tài)表現(xiàn)也不同，現(xiàn)將其特征總結(jié)如下。1 資料與方法1.1 一般資料 選擇2014年8月-2015年10月就診于本院的真菌性角膜炎患者75例（75只眼）作為研究對(duì)象，入選患者均在共焦顯微鏡下明確觀察到菌絲，其中男39例（39只眼），女36例（36只眼）；年齡2075歲。其中17例在檢查前行藥物抗真菌治療，其余58例檢查前未行抗真菌治療。1.2 方法 5例患者在共焦激光顯微鏡下查出菌絲后行抗真菌治療，分別于用藥后半個(gè)月、1個(gè)月及2個(gè)月后

13、復(fù)查，所有患者均在裂隙燈顯微鏡下觀察后并拍照，再行角膜共焦激光顯微鏡檢查，具體方法如下。1.2.1 裂隙燈顯微鏡檢查及照相 使用拓普康SL-D7型號(hào)的裂隙燈顯微鏡，以直接焦點(diǎn)照明法檢查，寬光照射采集角膜上皮病變，窄光照射采集角膜病變層次，后部反光照射法采集角膜內(nèi)皮情況。1.2.2 共焦激光顯微鏡檢查 儀器：共焦激光顯微鏡是由海德堡視網(wǎng)膜激光斷層掃描系統(tǒng)3代（HRT3）和Rostock角膜模塊組件（RCM）組成。主要參數(shù)：激光光源波長(zhǎng)670 nm，放大倍率800，數(shù)字分辨率：橫向1m/像素，縱向2 m/像素。橫向視野：400 m400 m。檢查方法：患眼滴用鹽酸丙美卡因滴眼液（愛(ài)爾凱因）表面麻醉

14、后，將卡波姆眼用凝膠滴于物鏡頭表面，蓋上無(wú)菌角膜接觸帽。調(diào)整操縱臺(tái)高度和CCD攝像頭位置，使CCD攝像頭的光軸與激光掃描攝像頭的光軸垂直。打開(kāi)軟件，調(diào)整焦平面，當(dāng)圖像窗口顯示為全白時(shí)，將焦平面設(shè)置為0?；颊呦骂M和前額分別固定于下頜托和前額托上，根據(jù)病灶位置調(diào)整固視燈位置，并囑患者注視前方的固視燈。將激光掃描攝像頭緩慢前移，直到角膜接觸帽輕微接觸患者角膜病灶。當(dāng)顯示器上出現(xiàn)角膜圖像時(shí)，微調(diào)焦距，連續(xù)掃描角膜各層結(jié)構(gòu)，重點(diǎn)連續(xù)掃描病灶區(qū)及病灶周邊部位，仔細(xì)觀察角膜各層結(jié)構(gòu)情況并采集有意義圖像。2 結(jié)果共焦激光顯微鏡下觀察角膜潰瘍及周邊的改變，顯示角膜病灶區(qū)組織破壞，各層結(jié)構(gòu)紊亂，潰瘍區(qū)及其周?chē)鲗?/p>

15、可見(jiàn)不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基質(zhì)層水腫態(tài)，嚴(yán)重者深層基質(zhì)及內(nèi)皮窺不入，菌絲根據(jù)病變程度不同分布深度不同，從上皮層、淺基質(zhì)層到深基質(zhì)層、甚至內(nèi)皮層可見(jiàn)到菌絲；菌絲形態(tài)各異，根據(jù)病變不同時(shí)期和治療階段以及不同種的菌絲形態(tài)特征不同，回顧性分析不同患者的菌絲特點(diǎn)，選擇典型病例總結(jié)如下。2.1 感染早期 患者角膜外傷史03 d，主要是植物外傷，該組病例有5例。共焦激光顯微鏡檢查顯示病灶區(qū)內(nèi)及邊緣表層及淺基質(zhì)層可見(jiàn)少量絲狀物，部分見(jiàn)分枝，呈高反光，較細(xì)。2.2 活動(dòng)期 可見(jiàn)大量菌絲，排列密集，縱橫交錯(cuò)，可見(jiàn)節(jié)段、分支，呈串珠樣（圖1A）、竹節(jié)樣（圖1C）或樹(shù)枝樣（圖1E），有的呈水平排列（圖1A、1B、1

16、C），菌絲較粗，分支少；有的呈簇狀垂直或斜行排列（圖1D、1F），菌絲較細(xì)；菌絲大部分呈高反光，部分呈小蟲(chóng)狀低反光（圖1E），夾雜圓點(diǎn)狀低反光，有時(shí)為高反光，共48例48眼。圖1 活動(dòng)期2.3 使用過(guò)抗真菌藥物 17例患者在檢查前進(jìn)行過(guò)抗真菌藥物治療2 d1周不等，共焦激光顯微鏡下不同患者表現(xiàn)不同，部分病例在淺層可見(jiàn)斷裂的菌絲節(jié)段，呈高反光，有的可見(jiàn)腫脹的菌絲，有的菌絲變得僵直，還有的菌絲形態(tài)奇特，粗細(xì)不一。2.4 抗真菌藥物治療后復(fù)查 5例復(fù)查患者共焦激光顯微鏡下顯示3例已查不到菌絲，2例菌絲減少或僅存少量節(jié)段，病灶區(qū)瘢痕化，上皮層修復(fù)完全，基質(zhì)層纖維化，反光增強(qiáng)。角膜病灶較前局限，邊界變清

17、，浸潤(rùn)灶變薄，透明度增加，角膜水腫明顯減輕甚至消失。2.5 不同孢子形態(tài) 部分病例菌絲旁可見(jiàn)較多梭形高反光（圖2A），有些病例菌絲呈簇狀，垂直排列，其頂端可見(jiàn)小點(diǎn)狀高反光（圖2B），有時(shí)呈圓珠狀低反光（圖2C），個(gè)別病例菌絲旁可見(jiàn)短棒樣高反光，規(guī)則排列于菌絲兩側(cè)（圖2D）。3 討論真菌性角膜炎是感染性角膜病致盲的首位原因，本病一般有明顯的致病危險(xiǎn)因素1。有文章報(bào)道，不同菌屬的感染危險(xiǎn)因素也有不同，鐮刀菌屬和鏈格孢霉屬以植物性外傷史為主，其次為迷眼史；曲霉菌屬多由迷眼史引起，其次為植物和鐵質(zhì)異物外傷史2。因此，角膜潰瘍患者的病史至關(guān)重要，應(yīng)詳細(xì)詢(xún)問(wèn)。真菌性角膜炎危害嚴(yán)重的一個(gè)主要原因就是缺乏正確

18、的早期診斷，從而導(dǎo)致誤診并延誤治療。真菌性角膜炎的早期診斷技術(shù)有多種3。KOH濕片法簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)，但受取材部位影響較大、漏診率高。Gram染色法和Giemsa染色法為經(jīng)典染色法，但在菌絲量少時(shí)檢出率不高、敏感性差。PAS染色法雖然特異性高，但染色時(shí)間較長(zhǎng)、操作復(fù)雜、所需試劑多且結(jié)果需要有專(zhuān)業(yè)經(jīng)驗(yàn)判斷，不能觀察組織細(xì)胞等細(xì)微形態(tài)變化。熒光染色法簡(jiǎn)單、快捷、敏感性和特異性高，但須配備一臺(tái)熒光顯微鏡，且紫外熒光對(duì)人體的危害等限制了其臨床應(yīng)用。PCR技術(shù)是一種新型技術(shù)，有諸多的優(yōu)點(diǎn)，但是對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高，否則容易污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性率引起誤診，且不能鑒別菌株。共焦激光顯微鏡具有無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)性強(qiáng)、快速

19、、有效等優(yōu)點(diǎn)，自1989年Cavanagh等4首次將其應(yīng)用于活體人眼的觀察，在過(guò)去的26年間，越來(lái)越得到眼科醫(yī)生的青睞，甚至有些醫(yī)生把它稱(chēng)為眼表醫(yī)生的第三只眼。共焦激光顯微鏡可以從細(xì)胞水平對(duì)眼表的各個(gè)組織進(jìn)行病理生理的直接觀察，如眼瞼、結(jié)膜、角膜、角鞏膜緣等，其中對(duì)感染性角膜炎的鑒別診斷應(yīng)用最多，特別是真菌性角膜炎和棘阿米巴性角膜炎的診斷具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)5-13。有文獻(xiàn)12報(bào)道共焦激光顯微鏡對(duì)真菌的檢出率較高，可高達(dá)96%以上。引發(fā)角膜感染的真菌約有70余種14。在我國(guó)導(dǎo)致真菌性角膜炎的首要致病菌是鐮刀菌屬，其次是曲霉菌屬15-16。不同菌屬的真菌感染角膜后引起的臨床特征及組織病理學(xué)不盡相同2，

20、17。由于真菌性角膜炎主要由鐮刀菌、曲霉菌等絲狀菌和能產(chǎn)生假菌絲的念珠菌所引起，所以，一般認(rèn)為，共焦激光顯微鏡對(duì)真菌性角膜炎的診斷以觀察到菌絲為依據(jù)，也能觀察到孢子，且觀察到的菌絲和孢子與角膜刮片標(biāo)本顯微鏡下所見(jiàn)相似11-12。同一菌屬不同菌種感染所致的真菌性角膜炎的共焦顯微鏡影響表現(xiàn)較為一致18。研究顯示，鐮刀菌屬的菌絲在角膜內(nèi)主要呈水平生長(zhǎng)，曲霉菌屬和念珠菌屬的菌絲在角膜內(nèi)主要呈垂直生長(zhǎng)1。這是根據(jù)角膜病理切片時(shí)，菌絲在角膜內(nèi)的生長(zhǎng)方向與角膜基質(zhì)板層纖維的夾角來(lái)判定的，大于45者判定為垂直生長(zhǎng)，小于45者判定為水平生長(zhǎng)。本研究入選的75例患者中均在共焦顯微鏡下明確觀察到菌絲，部分在菌絲旁還

21、看到一些孢子樣結(jié)構(gòu)反光。菌絲在各個(gè)發(fā)病階段菌絲量不同，這與其他報(bào)道一致19。本研究發(fā)現(xiàn)角膜植物性外傷03 d的早期感染，病灶面積小，有時(shí)甚至只有上皮的損傷，此時(shí)如果行刮片，將加重角膜損傷，共焦顯微鏡如果能在超早期就識(shí)別出真菌菌絲，將使患者避免很多痛苦，但菌絲量較少，需要仔細(xì)查找并辨認(rèn)；活動(dòng)期的菌絲數(shù)量較大，且不同種菌絲形態(tài)不同，有的菌絲呈水平生長(zhǎng)，為直線(xiàn)或斜行交叉分布，長(zhǎng)而直挺，分支少，粗細(xì)均勻的線(xiàn)狀高反光，與報(bào)道的鐮刀菌屬菌絲形態(tài)相似20。同時(shí)有些菌絲旁可見(jiàn)近梭形的高反光，與刮片染色顯微鏡下茄病鐮刀菌的孢子相似11；而有些菌絲在淺層呈簇狀垂直或斜行排列，較細(xì)，分支較多，菌絲大部分呈高反光，部

22、分呈低反光，小蟲(chóng)狀，與報(bào)道的曲霉菌屬菌絲形態(tài)相似，菌絲頂端或其間夾雜大量小點(diǎn)狀高反光，有時(shí)為圓珠狀低反光，與刮片染色顯微鏡下煙曲霉菌的孢子結(jié)構(gòu)相似，另外本研究還在菌絲兩側(cè)見(jiàn)到規(guī)則排列的短棒樣結(jié)構(gòu)高反光，應(yīng)該是孢子，但具體是哪種真菌，尚需鑒定。未使用過(guò)抗真菌藥的菌絲一般形態(tài)比較典型，但使用過(guò)抗真菌藥物的患者檢查共焦時(shí)，菌絲形態(tài)有時(shí)會(huì)不太典型，但也能看出一些特點(diǎn)，部分在淺層可見(jiàn)斷裂的菌絲節(jié)段，呈高反光，有的可見(jiàn)腫脹的菌絲，有的菌絲變得僵直，還有的菌絲形態(tài)奇特，粗細(xì)不一。當(dāng)有效的抗真菌藥物治療后復(fù)查時(shí)，共焦下菌絲量減少、僅存少量節(jié)段或菌絲消失、上皮層修復(fù)完全、基質(zhì)層纖維化瘢痕形成，反光增強(qiáng)，這與其他

23、報(bào)道一致20。因此共焦檢查可以用于指導(dǎo)藥物治療。另外，菌絲和神經(jīng)纖維需鑒別，筆者認(rèn)為鑒別點(diǎn)在于菌絲的絲狀物立體感強(qiáng)，有節(jié)段或分支，而上皮下神經(jīng)纖維有平面感，基質(zhì)層神經(jīng)纖維雖然較粗，但這兩種神經(jīng)纖維分布處均為正常組織，菌絲分布處一般沒(méi)有正常組織，如果潰瘍區(qū)苔被太厚，可在潰瘍邊緣查找菌絲，有時(shí)只看到一些稍露頭的短線(xiàn)狀菌絲形成毛糙的邊緣。綜上所述，本研究對(duì)75例在共焦下明確查到菌絲的真菌性角膜炎患者的資料進(jìn)行仔細(xì)分析，特別是對(duì)各種菌絲形態(tài)特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，提供了大量共焦圖片，豐富了目前有限的菌絲形態(tài)參考數(shù)據(jù)，為眼表臨床醫(yī)生及共焦檢查技術(shù)人員提供幫助，并為以后對(duì)菌屬菌種鑒定提供參考資料。參考文獻(xiàn)1謝立信.

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