DB15T 2734-2022 向日葵總DNA快速提取及檢測技術(shù)規(guī)程

1、ICS65.020.01CCSB 0515內(nèi) 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標 準DB15/T 27342022向日葵總 DNA 快速提取及檢測技術(shù)規(guī)程Technical code of practice for rapid extraction and detection of total sunflower DNA2022-07-29 發(fā)布2022-08-29 實施內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB15/T 27342022前言本文件按照GB/T 1.12020標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)標準化技術(shù)

2、委員會（SAM/TC 20）歸口。本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學、內(nèi)蒙古工程項目管理有限公司、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心、五原縣農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心、內(nèi)蒙古自治區(qū)發(fā)展和改革委員會、巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)科學研究所、內(nèi)蒙古大學、杭錦后旗農(nóng)牧和科技局。本文件主要起草人：郭樹春、李素萍、張艷芳、孫瑞芬、邵盈、于海峰、劉慧、李麗君、李二珍、段宇坤、聶惠、喬慧蕾、牟英男、張勇、張曉蒙、梁晨、張聰子、李有良、張立華、劉錦川。IDB15/T 27342022向日葵總DNA 快速提取及檢測技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了向日葵總 DNA 提取、質(zhì)量檢測和保存等技術(shù)內(nèi)容。本文件適用于向日葵根、莖、

3、葉DNA的快速提取。規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。DNA 提取量及質(zhì)量目標單位樣本DNA提取量不低于0.8 g1.2 g，DNA提取純度A260 /280 值在1.82.0之間。5 藥品準備藥品準備見附錄A。6 DNA 提取樣品準備取向日葵48葉期的葉片、根、莖80 mg120 mg。樣品研磨1.5 mL離心管加入樣品，液氮制冷，用磨砂尖頭玻璃棒迅速研磨成粉末。DNA 抽提DNA 抽提方法：離心管中加入 700 l 2%CTAB 提取液（藥品配制見附錄 A）；將離心管置于 65 水浴鍋中 1 h，期間每隔 10 min 輕輕搖動一次；取出后冷

4、卻至室溫，然后加入 700 l 氯仿/異戊醇（241）輕輕轉(zhuǎn)動搖勻后靜置 10 min。離心沉淀離心沉淀方法：1DB15/T 273420224 下 10000 rpm 離心 6 min；緩慢吸取上清液加入到預先加好 700 l 無水乙醇的離心管中，輕輕的上下顛倒混勻；放入 4 冰箱冷卻 30 min；10000 rpm 離心 1 min；緩慢倒掉全部液體，1 mL 70%的乙醇漂洗固態(tài) DNA 2 次，10000 rpm 離心 1 min，棄上清液。 風干純化將6.4得到的沉淀物在超凈工作臺下風干，加入1TE 100l（1l 10 mg/ml RNase）溶解DNA，在37 水浴中水浴1 h

5、去除RNA。 DNA 濃度和質(zhì)量檢測紫外分光光度計測定DNA濃度，并將其稀釋到20 ng/l，取5l稀釋液，以DL2000 marker為對照， 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。具體檢測方法見附錄B。保存DNA質(zhì)量檢測合格后，-20 儲存?zhèn)溆谩Ｗ⒁馐马桪NA提取過程中注意事項：加入 CTAB 后輕輕搖勻，防止基因鏈斷裂；操作過程中，全程佩戴醫(yī)用口罩和專用手套。2DB15/T 27342022AA附 錄 A（資料性） 溶液配制2% CTAB 溶液配制：CTAB 4 g，Nacl 16.364 g，1 M Tris-HCI 20 ml (PH8.0)，0.5 M EDTA 8 ml，先用 70 ml dd

6、H20 溶解，再定容至 200 ml 滅菌。1 M Tris-HCI 溶液配制：Tris6.06 g，加 40 ml ddH20 攪拌溶解，冷卻后加濃鹽酸約 2.1 ml 調(diào)PH 至 8.0，定容至 50 ml。0.5 M EDTA(pH8.0)50 ml 的配制：稱取 9.306 g EDTA-Na22H20，加入超純水 35 ml，劇烈攪拌， 用約 1 g NaOH 顆粒調(diào) pH 至 8.0，定容至 50 ml(EDTA 二鈉鹽需加入 NaOH 將 pH 調(diào)至接近 8.0 時，才會溶解)。10TE：取 5 ml 1 M Tris-HCI，1 ml 0.5 M EDTA，加入 44 ml 超

7、純水后高壓滅菌，室溫保存。取 1 ml 10TE，加入 9 ml 滅菌后的超純水即為 1TE。5TBE：稱取硼酸 27.5 g，Tris 54 g，并且將 20 mL 的 0.5 molL-1 EDTA（pH=7.9）置于其中， 加入 ddH2O 定容至 1 L。取 1 倍的溶液加入 9 倍的 ddH2O，即為 0.5TBE。3DB15/T 27342022BB附 錄 B（資料性）1%瓊脂糖凝膠電泳檢測1%瓊脂糖凝膠電泳檢測方法：制備 1%瓊脂糖凝膠（大膠用 70 ml 小膠用 50 ml)：稱取 0.7 g（0.5 g）瓊脂糖置于錐形瓶中，加入 70 ml（50 ml）0.5TBE。微波爐加

8、熱煮沸 3 次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成 1% 瓊脂糖凝膠液；膠板制備：取電泳槽內(nèi)的有機玻璃內(nèi)槽（制膠槽）洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板。將內(nèi)槽置于水平位置，在固定位置放好梳子，將冷卻到 65 左右的瓊脂糖凝膠液均勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層，室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中，添 0.5TBE 電泳緩沖液至沒過膠板為止；加樣：在點樣板上混合 DNA 樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于 1 X，用 10 l 微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品，應(yīng)更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面（注意：加樣前要先記下加樣的順序）；電泳：加樣后的凝膠板立即