微生物學(xué)檢驗(yàn)基本技術(shù)1

1、.：.；微生物學(xué)檢驗(yàn)根本技術(shù)1微生物學(xué)檢驗(yàn)根本技術(shù) 隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及相關(guān)科學(xué)技術(shù)的開(kāi)展，各學(xué)科相互交叉和浸透，醫(yī)學(xué)微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)已深化到細(xì)胞、分子和基因程度，許多新技術(shù)、新方法已在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室得到廣泛運(yùn)用。醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的根本義務(wù)之一是利用微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，準(zhǔn)確、快速檢驗(yàn)和鑒定臨床標(biāo)本中的微生物，并對(duì)引起感染的微生物進(jìn)展耐藥性監(jiān)測(cè)，為臨床對(duì)感染性疾病診斷、治療、流行病學(xué)調(diào)查及研討等提供科學(xué)根據(jù)。 第一節(jié)微生物形狀學(xué)檢查細(xì)菌形狀學(xué)檢查是細(xì)菌檢驗(yàn)的重要方法之一，它是細(xì)菌分類和鑒定的根底，可根據(jù)其形狀、構(gòu)造和染色反響性等，為進(jìn)一步鑒定提供參考根據(jù)。 一、顯微鏡檢查 由于細(xì)菌個(gè)體微小，肉眼不能

2、看到，必需借助顯微鏡的放大才干看到。普通形狀和構(gòu)造可用光學(xué)顯微鏡察看，其內(nèi)部的超微構(gòu)造那么需用電子顯微鏡才干看清楚。常用顯微鏡有如下幾種。 1普通光學(xué)顯微鏡 采用自然光或燈光為光源，其波長(zhǎng)約為0.4m。顯微鏡的分辨率為波長(zhǎng)的二分之一，即0.2m，而肉眼可見(jiàn)的最小籠統(tǒng)為0.2mm。故用油浸鏡放大1 000倍，能將0.2m的微粒放大成肉眼可見(jiàn)的0.2mm。普通光學(xué)顯微鏡可用于細(xì)菌、放線菌和真菌等的察看。 2暗視野顯微鏡 常用于察看不染色微生物形狀和運(yùn)動(dòng)。在普通顯微鏡安裝暗視野聚光器后，光線不能從中間直接透入，視野呈暗色，當(dāng)標(biāo)本接受從聚光器邊緣斜射光后可發(fā)生散射，因此可在暗視野背景下察看到光亮的微生

3、物如細(xì)菌或螺旋體等。 3相差顯微鏡 相差顯微鏡利用相差板的光珊作用，改動(dòng)直射光的光位相和振幅，將光相的差別轉(zhuǎn)換為光強(qiáng)度差。在相差顯微鏡下，當(dāng)光線透過(guò)不染色標(biāo)本時(shí)，由于標(biāo)本不同部位的密度不一致而引起光相的差別，可察看到微生物形狀、內(nèi)部構(gòu)造和運(yùn)動(dòng)方式等。 4熒光顯微鏡 熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡根本一樣，主要區(qū)別在于光源、濾光片和聚光器。目前大多數(shù)運(yùn)用的是落射光安裝，常用高壓汞燈作為光源，可發(fā)出紫外光或藍(lán)紫光。濾光片有激發(fā)濾光片和吸收濾光片二種。用藍(lán)光的熒光顯微鏡除可用普透明視野聚光器外，也可用暗視野聚光器，以加強(qiáng)熒光與背景的對(duì)比。本法適用于對(duì)熒光色素染色或與熒光抗體結(jié)合的細(xì)菌的檢測(cè)或鑒定。 5電

4、子顯微鏡 用電子流作為光源，波長(zhǎng)與可見(jiàn)光相比差幾萬(wàn)倍，大大提高了分辨力，并用磁性電圈作為光學(xué)放大系統(tǒng)，放大倍數(shù)可達(dá)數(shù)萬(wàn)倍或幾十萬(wàn)倍，常用于病毒顆粒和細(xì)菌超微構(gòu)造的察看。 二、不染色標(biāo)本檢查 不染色標(biāo)本普通可用于察看細(xì)菌形狀、動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)情況。細(xì)菌未染色時(shí)無(wú)色透明，在顯微鏡下主要靠細(xì)菌的折光率與周圍環(huán)境的不同來(lái)進(jìn)展察看。有鞭毛的細(xì)菌運(yùn)動(dòng)活潑，無(wú)鞭毛的細(xì)菌那么呈不規(guī)那么布朗運(yùn)動(dòng)。梅毒慘白密螺旋體、鉤端螺旋體、彎曲桿菌等的活菌各有特征鮮明的形狀和運(yùn)動(dòng)方式，具有診斷意義。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細(xì)管法等。 1懸滴法 在干凈凹玻片的凹孔周圍涂上凡士林，用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液放在蓋玻片中央，再將凹玻片的

5、凹孔對(duì)準(zhǔn)蓋玻片中央的液滴并蓋上，然后迅速翻轉(zhuǎn)，輕壓蓋玻片，使其與凹孔邊緣的凡士林粘緊封鎖后置高倍鏡下或暗視野察看。 2壓滴法 用接種環(huán)取一環(huán)菌懸液置于干凈玻片的中央，在菌懸液上悄然蓋上一蓋玻片，留意防止產(chǎn)生氣泡并防止菌懸液外溢，靜止數(shù)秒鐘后置高倍鏡下明視野或暗視野察看。 3毛細(xì)管法 主要用于厭養(yǎng)菌動(dòng)力的檢查。通常選用6070mm長(zhǎng)。0.51.0mm孔徑的毛細(xì)管虹吸厭養(yǎng)菌懸液后，用火焰將毛細(xì)管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細(xì)管固定在載玻片上，置高倍鏡下暗視野察看。 三、染色標(biāo)本檢查 細(xì)菌標(biāo)本經(jīng)染色后，由于細(xì)菌與周圍環(huán)境間在顏色上構(gòu)成鮮明對(duì)比，故在普通光學(xué)顯微鏡下可清楚地察看到細(xì)菌的形狀特征如細(xì)菌的大小

6、、外形、陳列等和某些特殊構(gòu)造如莢膜、鞭毛、芽孢等，并可根據(jù)染色反響性對(duì)細(xì)菌加以分類鑒定。 一細(xì)菌染色的普通程序 細(xì)菌染色的普通程序是：涂片枯燥固定染色媒染脫色復(fù)染。 1涂片制備 血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培育物，直接在載玻片上作薄膜涂片；尸檢或感染動(dòng)物組織，病變部分涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培育基上的菌落或菌苔的制片，先用接種環(huán)取一環(huán)生理鹽水置載玻片中央，再用無(wú)菌接種環(huán)取少量的培育物在生理鹽水中磨勻，涂布成1cm2大小的涂面，置室溫下自然枯燥或遠(yuǎn)火漸漸烘干。 2固定 目的是殺死細(xì)菌，凝固細(xì)菌蛋白及構(gòu)造，便于染色；促使細(xì)菌粘附在載玻片上，防止在水洗過(guò)程中被水沖掉；改動(dòng)細(xì)菌對(duì)染料的通透

7、性，有利于菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)造的染色。通常用火焰加熱固定，將已枯燥的涂片在火焰中迅速經(jīng)過(guò)3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。 3染色 根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牟煌?，選擇不同的染色方法進(jìn)展染色。染色時(shí)滴加染液，以復(fù)蓋標(biāo)本為度。 4媒染 凡能加強(qiáng)染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細(xì)胞膜通透性改動(dòng)的物質(zhì)，稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進(jìn)著色。媒染劑可用于初染與復(fù)染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。 5脫色 凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學(xué)試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細(xì)菌與染料結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。 6復(fù)染 已脫色處置的細(xì)菌或其

8、構(gòu)造常以復(fù)染液作復(fù)染以便于察看。復(fù)染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對(duì)比。復(fù)染不宜太強(qiáng)，以免掩蓋初染的顏色。 二常用染色法染液配方見(jiàn)第8章 1 單染色法 只用一種染料染色。由于大多數(shù)細(xì)菌胞漿內(nèi)含有酸性物質(zhì)，可與堿性染料結(jié)合，故常用呂氏美藍(lán)、結(jié)晶紫和稀釋石碳酸復(fù)紅等染液。此法可察看細(xì)菌的大小、形狀與陳列，不能顯示細(xì)菌的構(gòu)造與染色特性。 2復(fù)染色法 用兩種或兩種以上不同染料可將細(xì)菌染成不同的顏色，除可察看細(xì)菌的大小、形狀與陳列外，還反響出細(xì)菌染色特性，具有鑒別細(xì)菌種類的價(jià)值。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。 1革蘭染色：細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加結(jié)晶紫染液染1min，清水沖去染液。加碘液媒染 1min，

9、水洗，甩干。用95%乙醇脫色，悄然搖動(dòng)約30s，至無(wú)紫色洗落為止，水洗，甩干。加稀釋石碳酸復(fù)紅或沙黃染液數(shù)滴進(jìn)展復(fù)染，約30s，水洗。干后顯微鏡下鏡檢察看結(jié)果，革蘭陽(yáng)性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。 2抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：細(xì)菌涂片經(jīng)火焰固定，加石炭酸復(fù)紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現(xiàn)，切不可沸騰。染液因蒸發(fā)減少時(shí)，應(yīng)隨時(shí)補(bǔ)充，防止染液蒸干。繼續(xù)染5min奴卡菌需求加長(zhǎng)時(shí)間，水洗，甩干。滴加3%鹽酸乙醇脫色，不時(shí)搖動(dòng)玻片至無(wú)紅色零落為止，水洗，甩干。加呂氏美藍(lán)復(fù)染液數(shù)滴復(fù)染1min，水洗。干后顯微鏡下鏡檢察看結(jié)果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍(lán)色。 金胺O-羅

10、丹明B染色法：細(xì)菌涂片固定后加第1液3090s。棄去第1液后加第2液染15min。用第3液脫色12min，水洗。滴加第4液染30s，水洗，干后置熒光顯微鏡下鏡檢察看結(jié)果 在淡藍(lán)色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細(xì)菌和細(xì)胞呈藍(lán)色。 3特殊染色法 1鞭毛染色改良Ryu法：玻片的處置 將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時(shí)取出，以干凈紗布擦干。在玻片上滴蒸餾水1滴。挑取培育物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細(xì)菌進(jìn)入水滴，不可攪動(dòng)，以免鞭毛零落。置35孵箱自然枯燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染12 min悄然水洗。干后顯微鏡鏡檢察看結(jié)果 鞭毛和菌體呈紫色。 2異染顆粒染色(阿爾培托法)：細(xì)菌涂片經(jīng)火焰

11、固定，加甲液染色35min。水洗。滴加乙液，染1min。水洗。干后顯微鏡鏡檢察看結(jié)果 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍(lán)黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。 3莢膜染色：奧爾特莢膜染色法：將已固定的細(xì)菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰加溫染色，繼續(xù)3min，冷卻后水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主要用于碳疽芽胞桿菌。Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結(jié)晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml 的混合液；第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細(xì)菌涂片自然枯燥，乙醇固定。滴加第一液，微加熱染1min。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。結(jié)果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍(lán)色或

12、不著色。 4芽胞染色：染液：第一液為萋納氏石炭酸復(fù)紅液，第二液為95%乙醇，第三液為堿性美藍(lán)液。方法：將已固定的細(xì)菌涂片滴加第一液，微加熱染5min，冷卻后水洗。用第二液脫色2min，水洗。加第三液復(fù)染1min，水洗，待干鏡檢。結(jié)果：菌體呈藍(lán)色，芽胞呈紅色。 4負(fù)染色法 背景著色而菌體本身不著色的染色為負(fù)染色法。最常見(jiàn)的是墨汁負(fù)染色法，用來(lái)察看真菌及細(xì)菌莢膜等。在標(biāo)本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片(勿產(chǎn)生氣泡)，輕壓。在低倍鏡下尋覓有莢膜的菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)高倍鏡或油鏡確認(rèn)，如新型隱球菌可見(jiàn)寬厚透亮的莢膜，背景為黑色。 5熒光染色法 經(jīng)熒光素染色的細(xì)菌，或熒光素標(biāo)志的熒光抗體與相應(yīng)抗原的細(xì)菌、病毒結(jié)

13、合構(gòu)成的復(fù)合物，在熒光顯微鏡下發(fā)出熒光。 第二節(jié) 微生物培育與分別方法 大多數(shù)細(xì)菌均可以經(jīng)過(guò)人工方法培育，而衣原體和病毒的分別培育往往需求活組織、雞胚、特殊細(xì)胞株及動(dòng)物接種。只需將微生物培育出來(lái)才干對(duì)它進(jìn)展研討、鑒定和運(yùn)用。 一、接種與分別方法 根據(jù)待檢標(biāo)本的性質(zhì)、培育目的和所用培育基的種類，采用不同的接種方法。 1平板劃線分別培育法 對(duì)混有多種細(xì)菌的臨床標(biāo)本，采用劃線分別和培育，使原來(lái)混雜在一同的細(xì)菌沿劃線在瓊脂平板外表分別，得到分散的單個(gè)菌落，以獲得純種。臨床送檢的標(biāo)本如痰、咽試子、泌尿生殖道的分泌物和糞便等細(xì)菌檢驗(yàn)均需求借助瓊脂平板劃線分別目的菌。平板劃線分別法通常有兩種方法： 1分區(qū)劃

14、線分別法：此法常用于含菌量較多的標(biāo)本如痰、泌尿生殖道的分泌物和糞便或混合細(xì)菌的分別。先用接種環(huán)挑取標(biāo)本涂布于瓊脂平板1區(qū)占培育基總面積的1/4并作數(shù)條劃線，再于2、3、4區(qū)依次劃線。每劃完一個(gè)區(qū)域，均將接種環(huán)燒灼滅菌1次，冷后再劃下一區(qū)域，每一區(qū)域的劃線均與上一區(qū)域的劃線交接13次。一個(gè)勝利分區(qū)劃線的平板，培育后分別察看1區(qū)構(gòu)成菌苔，2區(qū)菌落連成線，3區(qū)和4區(qū)可分別到單個(gè)菌落。 2延續(xù)劃線分別法：此法常用于含菌量不多的標(biāo)本或培育物中的細(xì)菌分別培育。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處悄然涂抹，然后再用接種環(huán)或拭子在平板外表曲線延續(xù)劃線接種，直至劃滿瓊脂平板外表。 2 瓊脂斜面接種法 主要用于菌

15、落的移種，以獲得純種進(jìn)展鑒定和保管菌種等。用接種環(huán)針挑取單個(gè)菌落或培育物，從培育基斜面底部向上劃一條直線，然后再?gòu)牡撞垦刂本€向上曲折延續(xù)劃線，直至斜面近頂端處止。生化鑒定培育基斜面接種，用接種針挑取待鑒定細(xì)菌的菌落，從斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種。 3穿刺接種法 此法多用于半固體培育基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培育基接種，半固體培育基的穿刺接種可用于察看細(xì)菌的動(dòng)力。接種時(shí)用接種針挑取菌落，由培育基中央垂直刺入至距管底0.4cm處，再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培育基，穿刺高層部分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。 4液體培育基接種法 用于各種液體

16、培育基如肉湯、蛋白胨水、糖發(fā)酵管等的接種。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，傾斜液體培育管，在液面與管壁交界處研磨接種物以試管直立后液體淹沒(méi)接種物為準(zhǔn)。此接種法應(yīng)防止接種環(huán)與液體過(guò)多接觸，更不應(yīng)在液體中混勻、攪拌，以免構(gòu)成氣溶膠，呵斥實(shí)驗(yàn)室污染。 5傾注平板法 本法主要用于飲水、飲料、牛乳和尿液等標(biāo)本中的細(xì)菌計(jì)數(shù)。取純培育物的稀釋或原標(biāo)本1ml至無(wú)菌培育皿內(nèi)，再將已融化并冷卻至4550左右的瓊脂培育基1520ml傾注入該無(wú)菌培育皿內(nèi)，混勻，待凝固后置37培育，長(zhǎng)出菌落后進(jìn)展菌落計(jì)數(shù)，以求出每毫升標(biāo)本中所含菌數(shù)。先數(shù)6個(gè)方格每格為1cm2中菌落數(shù)，求出每格的平均菌落數(shù)，并算出平皿直徑，然后按以下公式計(jì)數(shù)，求

17、出每毫升標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)。 全平板菌落數(shù)=每方格的平均菌落數(shù)r2 每ml標(biāo)本中的細(xì)菌數(shù)=全平板菌落數(shù)稀釋倍數(shù) 6涂布接種法 本法多用于紙片分散法藥敏實(shí)驗(yàn)的細(xì)菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培育基外表，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復(fù)涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂外表，然后貼上藥敏紙片，或直接培育，本法經(jīng)培育后細(xì)菌構(gòu)成菌苔。 二、細(xì)菌的培育方法 根據(jù)不同的標(biāo)本及不同的培育目的，可選用不同的培育方法。通常把細(xì)菌的培育方法分為需氧培育、二氧化碳培育、微需氧培育和厭氧培育四種。 1需氧培育 是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培育，將已接種好的平板、斜面、液體培育基等在空氣中置35孵育

18、箱內(nèi)孵育1824h，無(wú)特殊要求的細(xì)菌均可生長(zhǎng)。少數(shù)生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌需求培育3-7d甚至1個(gè)月才干生長(zhǎng)。為使孵育箱內(nèi)堅(jiān)持一定的濕度，可在其內(nèi)放置一杯水。對(duì)培育時(shí)間較長(zhǎng)的培育基，接種后應(yīng)將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士林封固，以防培育基干裂。 2二氧化碳培育 某些細(xì)菌，如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、布魯氏菌和流感嗜血桿菌等的培育，特別是在初次分別時(shí)，須在5%10 %二氧化碳環(huán)境中培育才干生長(zhǎng)。常用的培育法如下。 1二氧化碳培育箱法：二氧化碳孵箱能自動(dòng)調(diào)理二氧化碳的含量、溫度和濕度，培育物置于孵育箱內(nèi)閣，孵育一定時(shí)間后可直接察看生長(zhǎng)結(jié)果。 2燭缸培育法：取有蓋磨口標(biāo)本缸或玻璃枯燥器，將

19、接種好的培育基放入缸內(nèi)，點(diǎn)燃蠟燭后放在缸內(nèi)稍高于培育物的位置上，缸蓋或缸口均涂以凡士林，加蓋密閉。因缸內(nèi)蠟燭熄滅氧逐漸減少，數(shù)分鐘后蠟燭自行熄滅，此時(shí)容器內(nèi)二氧化碳含量約占5%10%。將缸置于35普通孵育箱內(nèi)孵育。 3氣袋法：選用無(wú)毒透明的塑料袋，將已接種標(biāo)本的培育皿放入袋內(nèi)，盡量祛除袋內(nèi)空氣后將開(kāi)口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉形狀，執(zhí)斷袋內(nèi)已置的二氧化碳產(chǎn)氣管安瓿產(chǎn)生二氧化碳，數(shù)分鐘內(nèi)就可到達(dá)需求的二氧化碳培育環(huán)境，置于35孵育箱內(nèi)孵育。 4化學(xué)法：常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例，分別置容器內(nèi)，連同容器置于玻璃缸內(nèi)，蓋嚴(yán)密封，傾斜缸位使鹽

20、酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳。于35孵育箱內(nèi)孵育。 3微需氧培育 微需氧菌培育在大氣中及絕對(duì)無(wú)氧環(huán)境中均不能生長(zhǎng)，在含有5%-6% 氧氣，5%-10%二氧化碳和85%氮?dú)獾臍怏w環(huán)境中才可生長(zhǎng)，將標(biāo)本接種到培育基上，置于上述氣體環(huán)境中，35進(jìn)展培育即微需氧培育法。 4厭氧培育 厭氧菌對(duì)氧敏感，培育過(guò)程中需呵斥低氧化復(fù)原電勢(shì)的厭氧環(huán)境。厭氧培育常用的方法有：物理法、化學(xué)法、生物法。如厭氧罐培育法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。 三、細(xì)菌在培育基上生長(zhǎng)特性 1固體培育基 標(biāo)本或液體培育物劃線接種到固體培育基外表后，單個(gè)細(xì)菌經(jīng)分裂繁衍可構(gòu)成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)，稱為菌落colony。

21、(1)菌落的形狀特征：大小、外形露滴狀、圓形、菜花樣、不規(guī)那么等、突起或扁平、凹陷、邊緣光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等、顏色紅色、灰白色、黑色、綠色、無(wú)色、黃色等、外表光滑、粗糙等、透明度不透明、半透明、透明等和粘度等。據(jù)細(xì)菌菌落外表特征不同，可將菌落分為3型： 光滑型菌落S型菌落：菌落外表光滑、潮濕、邊緣整齊，新分別的細(xì)菌大多呈光滑型菌落。粗糙型菌落R型菌落：菌落外表粗糙、枯燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細(xì)菌變異失去菌體外表多糖或蛋白質(zhì)構(gòu)成。R型細(xì)菌抗原不完好，毒力和抗吞噬才干都比S型細(xì)菌弱。但也有少數(shù)細(xì)菌新分別的毒力株就是R型，如炭疽孢桿菌、結(jié)核分枝菌等。粘液型菌落M型

22、菌落：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見(jiàn)于厚莢膜或豐富粘液層的細(xì)菌、結(jié)核桿菌等。 (2)菌落溶血特征：菌落溶血有以下3種情況。溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培育基出現(xiàn)12mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；溶血：又稱完全溶血，菌落周圍構(gòu)成一個(gè)完全明晰透明的溶血環(huán)，是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞完全溶解所致；溶血：即不溶血，菌落周圍的培育基沒(méi)有變化，紅細(xì)胞沒(méi)有溶解或缺損。 (3)色素：有些細(xì)菌產(chǎn)生水溶性色素，使菌落和周圍的培育基出現(xiàn)綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色，產(chǎn)生的色素有水溶性或脂溶性。 (4)氣味：某些細(xì)菌在培育基中生長(zhǎng)繁衍后可產(chǎn)生特殊氣味，如銅綠假單胞菌生姜?dú)馕?、變形桿菌巧克力燒焦的臭

23、味、厭氧梭菌*的惡臭味、白色假絲酵母菌酵母味和放線菌泥土味等。 2液體培育基 細(xì)菌在液體培育基中有3種生長(zhǎng)景象：大多數(shù)細(xì)菌在液體培育基生長(zhǎng)繁衍后呈均勻混濁；少數(shù)鏈狀陳列的細(xì)菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等那么呈沉淀生長(zhǎng)；枯草芽胞桿菌、結(jié)核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌普通呈外表生長(zhǎng)，常構(gòu)成菌膜。 3半固體培育基 半固體培育基主要用于細(xì)菌動(dòng)力實(shí)驗(yàn)，有鞭毛的細(xì)菌除了沿穿刺線生長(zhǎng)外，在穿刺線兩側(cè)也可見(jiàn)羽毛狀或云霧狀混濁生長(zhǎng)。無(wú)鞭毛的細(xì)菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長(zhǎng)，穿刺線兩邊的培育基依然廓清透明，為動(dòng)力實(shí)驗(yàn)陰性。 第三節(jié) 細(xì)菌的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 各種細(xì)菌具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因此對(duì)底物的分解才干不同，其代

24、謝產(chǎn)物也不同。用生物化學(xué)方法測(cè)定這些代謝產(chǎn)物，可用來(lái)區(qū)別和鑒定細(xì)菌的種類。利用生物化學(xué)方法來(lái)鑒別不同細(xì)菌，稱為細(xì)菌的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)或稱生化反響。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法很多，主要有以下幾類。 一、碳水化合物的代謝實(shí)驗(yàn) 1糖醇、苷類發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 1原理：不同種類細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖醇、苷類的酶，因此對(duì)各種糖醇、苷類的代謝才干也有所不同，即使能分解某種糖醇、苷類，其代謝產(chǎn)物可因菌種而異。檢查細(xì)菌對(duì)培育基中所含糖醇、苷降解后產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣的才干，可用以鑒定細(xì)菌種類。 (2)方法：在根底培育基中如酚紅肉湯根底培育基pH7.4參與0.51.0w/v的特定糖醇、苷類。所運(yùn)用的糖醇、苷類有很多種，根據(jù)不同需求可選擇單糖、

25、多糖或低聚糖、多元醇和環(huán)醇等，見(jiàn)表6-4-1。將待鑒定的純培育細(xì)菌接種入實(shí)驗(yàn)培育基中，置35孵育箱內(nèi)孵育數(shù)小時(shí)到兩周視方法及菌種而定后，察看結(jié)果。假設(shè)用微量發(fā)酵管，或要求培育時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)留意堅(jiān)持其周圍的濕度，以免培育基枯燥。 (3)結(jié)果：能分解糖醇、苷產(chǎn)酸的細(xì)菌，培育基中的指示劑呈酸性反響如酚紅變?yōu)辄S色，產(chǎn)氣的細(xì)菌可在小倒管Durham小管中產(chǎn)生氣泡，固體培育基那么產(chǎn)生裂隙。不分解糖那么無(wú)變化。 (4)運(yùn)用：糖醇、苷類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，是鑒定細(xì)菌的生化反響實(shí)驗(yàn)中最主要的實(shí)驗(yàn)，不同細(xì)菌可發(fā)酵 不同的糖醇、苷類，如沙門菌可發(fā)酵葡萄糖，但不能發(fā)酵乳糖，大腸埃希菌那么可發(fā)酵葡萄糖和乳糖。即使是兩種細(xì)菌均可發(fā)

26、酵同一種糖類，其發(fā)酵結(jié)果也不盡一樣，如志賀菌和大腸埃希菌均可發(fā)酵葡萄糖，但前者僅產(chǎn)酸，而后者那么產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，故可利用此實(shí)驗(yàn)鑒別細(xì)菌。 表6-4-1 常用于細(xì)菌糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的糖、醇類 單糖 四碳糖：赤蘚糖 , 五碳糖：核糖 核酮糖 木糖 阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖 果糖 半乳糖 甘露糖 雙糖 蔗糖葡萄糖果糖 乳糖葡萄糖半乳糖 麥芽糖兩分子葡萄糖 三糖 棉子糖葡萄糖果糖半乳糖 多糖 菊糖多分子果糖 淀粉 醇類 側(cè)金盞花醇 衛(wèi)茅醇 甘露醇 山梨醇 非糖類 肌醇 2葡萄糖代謝類型鑒別實(shí)驗(yàn) (1)原理：細(xì)菌在分解葡萄糖的過(guò)程中，必需有分子氧參與的，稱為氧化型；能進(jìn)展無(wú)氧降解的為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的細(xì)菌為

27、產(chǎn)堿型。發(fā)酵型細(xì)菌無(wú)論在有氧或無(wú)氧環(huán)境中都能分解葡萄糖，而氧化型細(xì)菌在無(wú)氧環(huán)境中那么不能分解葡萄糖。本實(shí)驗(yàn)又稱氧化發(fā)酵O/F或HughLeifson，HL實(shí)驗(yàn)，可用于區(qū)別細(xì)菌的代謝類型。 (2)方法：挑取少許純培育物不要從選擇性平板中挑取接種2支HL培育管中，在其中一管參與高度至少為0.5cm的無(wú)菌液體石蠟以隔絕空氣作為密封管，另一管不加作為開(kāi)放管。置35孵箱孵育48h以上。 (3)結(jié)果： 兩管培育基均不產(chǎn)酸顏色不變?yōu)殛幮裕粌晒芏籍a(chǎn)酸變黃為發(fā)酵型；加液體石蠟管不產(chǎn)酸，不加液體石蠟管產(chǎn)酸為氧化型。 (4)運(yùn)用：主要用于腸桿菌科與其它非發(fā)酵菌的鑒別。腸桿菌科、弧菌科細(xì)菌為發(fā)酵型，非發(fā)酵菌為氧化型或

28、產(chǎn)堿型。也可用于鑒別葡萄球菌發(fā)酵型與微球菌氧化型。 3甲基紅MR實(shí)驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌在糖代謝過(guò)程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步被分解為甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培育基pH下降至4.5以下時(shí)，參與甲基紅指示劑呈紅色。如細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)如醇、醛、酮、氣體和水，培育基pH在 5.4以上，參與甲基紅指示劑呈桔黃色。 (2)方法：將待試菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35孵育48h96h后，于5ml培育基中滴加56滴甲基紅指示劑，立刻察看結(jié)果。 (3)結(jié)果斷定：呈現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性，桔黃色為陰性，桔紅色為弱陽(yáng)性。 (4)運(yùn)用：常用于腸桿菌科內(nèi)某些種屬的鑒別，

29、如大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌，前者為陽(yáng)性，后者為陰性。腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬為陰性，而沙門菌屬、志賀菌屬、枸櫞酸桿菌屬和變形桿菌屬等為陽(yáng)性。 4半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)ONPG實(shí)驗(yàn) (1)原理：乳糖發(fā)酵過(guò)程中需求乳糖通透酶和半乳糖苷酶才干快速分解。有些細(xì)菌只需半乳糖苷酶，因此只能緩慢發(fā)酵乳糖，一切乳糖快速發(fā)酵和緩慢發(fā)酵的細(xì)菌均可快速水解鄰硝基酚-D-半乳糖苷O-nitrophenyl-D-galactopyranoside,ONPG而生成黃色的鄰硝基酚。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。 (2)方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35水浴或孵箱孵育1824h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為

30、陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。 (4)運(yùn)用：可用于緩慢發(fā)酵乳糖細(xì)菌的快速鑒定，本法對(duì)于迅速及緩慢分解乳糖的細(xì)菌均可短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)陽(yáng)性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。 5VP實(shí)驗(yàn) (1)原理：測(cè)定細(xì)菌產(chǎn)生乙酰甲基甲醇的才干。某些細(xì)菌如產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進(jìn)一步脫羧構(gòu)成乙酰甲基甲醇。在堿性條件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，進(jìn)而與培育基中的精氨酸等含胍基的物質(zhì)結(jié)合構(gòu)成紅色化合物。即V-P實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。 (2)方法：將待檢菌接種于葡萄糖磷酸鹽蛋白胨水中，35孵育2448h，參與50g/L萘酚95乙

31、醇溶液0.6ml，悄然振搖試管，然后加0.2ml 400g/L KOH，悄然振搖試管30s至1min，然后靜置察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：紅色者為陽(yáng)性，黃色或類似銅色為陰性。 (4)運(yùn)用：主要用于大腸埃希菌和產(chǎn)氣腸桿菌的鑒別。本實(shí)驗(yàn)常與MR實(shí)驗(yàn)一同運(yùn)用，普通情況下，前者為陽(yáng)性的細(xì)菌，后者常為陰性，反之亦然。但腸桿菌科細(xì)菌不一定都這樣規(guī)律，如蜂房哈夫尼亞菌和奇特變形桿菌的VP實(shí)驗(yàn)和MR實(shí)驗(yàn)常同為陽(yáng)性。 6膽汁七葉苷水解實(shí)驗(yàn) 1原理：在10%40膽汁存在下，測(cè)定細(xì)菌水解七葉苷的才干。七葉苷被細(xì)菌分解生成的七葉素，七葉素與培育基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子發(fā)生反響構(gòu)成黑色化合物。 (2)方法：將被檢菌接種于

32、膽汁七葉苷培育基中，35孵育1824h后，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：培育基完全變黑為陽(yáng)性，不變黑為陰性。 (4)運(yùn)用：主要用于鑒別D群鏈球菌與其它鏈球菌的區(qū)別，以及腸桿菌科的某些種、某些厭氧菌如脆弱擬桿菌等的初步鑒別。D群鏈球菌本實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性。 7淀粉水解實(shí)驗(yàn) (1)原理：產(chǎn)生淀粉酶的細(xì)菌能將淀粉水解為糖類，在培育基上滴加碘液時(shí)，可在菌落周圍出現(xiàn)透明區(qū)。 (2)方法：將被檢菌劃線接種于淀粉瓊脂平板或試管中，35孵育1824h，參與革蘭碘液數(shù)滴，立刻察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：陽(yáng)性反響，菌落周圍有無(wú)色透明區(qū)，其它地方藍(lán)色；陰性反響，培育基全部為藍(lán)色。 (4)運(yùn)用：用于白喉棒狀桿菌生物型的分型，重型淀粉水

33、解實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，輕、中型陰性；芽胞桿菌屬菌種和厭氧菌某些種的鑒定。 8甘油復(fù)紅實(shí)驗(yàn) (1)原理：甘油可被細(xì)菌分解生成丙酮酸，丙酮酸脫去羧基為乙醛，乙醛與無(wú)色的復(fù)紅生成醌式化合物，呈深紫紅色。 (2)方法：取被檢菌接種于甘油復(fù)紅肉湯培育基中，于35孵育，察看28d。應(yīng)同時(shí)做陰性對(duì)照。 (3)結(jié)果：紫紅色為陽(yáng)性，與對(duì)看管顏色一樣為陰性。 (4)運(yùn)用：主要用于沙門菌屬內(nèi)各菌種間的鑒別。傷寒沙門菌、甲丙型副傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌、孔道夫沙門菌和仙臺(tái)沙門菌本實(shí)驗(yàn)為陰性， 乙型副傷寒沙門菌結(jié)果不定，其它不常見(jiàn)沙門菌多數(shù)為陽(yáng)性。 9葡萄糖酸氧化實(shí)驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌可氧化葡萄糖酸鉀，生成-酮基葡萄糖酸。-

34、酮基葡萄糖酸是一種復(fù)原性物質(zhì)，可與班氏試劑起反響，出現(xiàn)棕色或磚紅色的氧化亞銅沉淀。 (2)方法：將待檢菌接種于葡萄糖酸鹽培育基中(1ml)，置35孵育48h,參與班氏試劑1ml，于水浴中煮沸10min并迅速冷卻，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)黃到磚紅色沉淀為陽(yáng)性。不變或仍為藍(lán)色為陰性。 (4)運(yùn)用：主要用于假單胞菌的鑒定和腸桿菌科菌分群。 二、氨基酸和蛋白質(zhì)的代謝實(shí)驗(yàn) 1硫化氫實(shí)驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌能分解含硫氨基酸生成硫化氫，與亞鐵離子或鉛離子結(jié)合構(gòu)成黑色沉淀物。 (2)方法：將待檢菌接種于含硫化物及亞鐵離子的培育基或克氏雙糖鐵瓊脂KIA中，35孵育1824h，察看有無(wú)黑色沉淀出現(xiàn)?；蛴么姿?/p>

35、鉛紙 條，懸掛于KIA管中白色濾紙，根據(jù)試管大小裁剪適當(dāng)，在熱的50g/L醋酸鉛飽和水溶液中浸泡，然后于5060烘干，12115min高壓滅菌備用。醋酸鉛是最敏感的方法。 (3)結(jié)果：有黑色沉淀物為陽(yáng)性。 (4)運(yùn)用：主要用于鑒別腸桿菌科細(xì)菌，如沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛(ài)德華菌屬等為陽(yáng)性，其它菌屬大多為陰性。但沙門菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙臺(tái)、豬霍亂沙門菌等。 2明膠液化實(shí)驗(yàn) (1)原理：細(xì)菌分泌的胞外蛋白水解酶明膠酶能分解明膠，使明膠失去凝固才干而液化。 (2)方法：將待檢菌接種于明膠培育基中，35孵育24h到7d或更長(zhǎng)時(shí)間，每24h取出放入4冰箱約2h后，察

36、看有無(wú)凝固。 (3)結(jié)果：如無(wú)凝固，那么表示明膠已被水解，液化實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。如凝固，那么繼續(xù)培育。 (4)運(yùn)用：奇特變形桿菌、普通變形桿菌、沙雷菌屬和陰溝腸桿菌等到能液化明膠，腸桿菌科中的其它細(xì)菌很少液化明膠。有些厭氧菌如產(chǎn)氣莢膜梭菌、脆弱類桿菌等也能液化明膠。另外，許多假單胞菌也能產(chǎn)生明膠酶而使明膠液化。 3吲哚實(shí)驗(yàn)靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌有色氨酸酶，能分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚與對(duì)二甲氨基苯甲醛構(gòu)成紅色的玫瑰吲哚。 (2)方法：將待檢菌接種于富含色氨酸的蛋白胨水培育基中，35孵育2448h，參與靛基質(zhì)試劑，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：紅色為陽(yáng)性，無(wú)色為陰性。 (4)運(yùn)用：主要用于腸桿菌科細(xì)菌

37、的鑒定，如大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產(chǎn)酸克雷伯菌等的鑒別。 4苯丙氨酸脫氨酶實(shí)驗(yàn) (1)原理：測(cè)定細(xì)菌能否產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶。細(xì)菌產(chǎn)生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨后生成苯丙酮酸，參與三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反響。假設(shè)延伸時(shí)間，會(huì)引起退色。 (2)方法：將待檢菌大量接種入苯丙氨酸培育基中，35孵育1824h，滴加100g/L三氯化鐵試劑45滴，立刻察看菌落生優(yōu)點(diǎn)有無(wú)綠色出現(xiàn)。 (3)結(jié)果：有綠色出現(xiàn)為陽(yáng)性。 (4)運(yùn)用：變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽(yáng)性，腸桿菌科其它細(xì)菌均為陰性。 5氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶使氨基酸脫羧生成胺和二氧化碳。由于胺

38、的生成使培育基變?yōu)閴A性，可用指示劑指示出來(lái)。 (2)方法：將待檢菌分別接種于1支氨基酸賴氨酸，鳥(niǎo)氨酸或精氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)管和1支氨基酸脫羧酶對(duì)看管無(wú)氨基酸，各覆蓋至少0.5cm高度 的無(wú)菌石蠟油，35孵育14d，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：假設(shè)為溴甲酚紫指示劑，那么實(shí)驗(yàn)管紫色為陽(yáng)性，黃色為陰性，對(duì)看管應(yīng)為黃色。 (4)運(yùn)用：主要用于某些細(xì)菌種間的鑒別，如賴氨酸用于產(chǎn)氣腸桿菌陽(yáng)性與陰溝腸桿菌陰性；鳥(niǎo)氨酸用于陰溝腸桿菌陽(yáng)性和克雷伯菌陰性；精氨酸用于陰溝腸桿菌陽(yáng)性和產(chǎn)氣腸桿菌陰性等。 6精氨酸雙水解酶實(shí)驗(yàn) (1)原理：精氨酸經(jīng)兩次水解后,生成鳥(niǎo)氨酸、氨及二氧化碳。鳥(niǎo)氨酸又在脫羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺

39、均為堿性物質(zhì)，故可使培育基變堿，用 指示劑指示出來(lái)。 (2) 方法：將待檢菌接種于實(shí)驗(yàn)培育上，置35孵箱孵育14d，察看結(jié)果。 (3) 結(jié)果：溴甲酚紫指示劑呈紫色為陽(yáng)性，酚紅指示劑呈紅色為陽(yáng)性。黃色為陰性。 (4) 運(yùn)用：主要用于腸桿菌科及假單胞菌屬的鑒定。 7尿素酶實(shí)驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培育基變堿。 (2)方法：將待檢菌接種于含有尿素的培育基中，35孵育1824h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：紅色為陽(yáng)性，不變?yōu)殛幮浴?(4)運(yùn)用：主要用于腸桿菌科變形桿菌屬、普羅威登菌屬、克雷伯菌屬及假單胞菌屬的鑒定。 8霍亂紅實(shí)驗(yàn) (1)原理：霍亂弧菌分解色氨酸生成吲哚

40、，并能使硝酸鹽復(fù)原為亞硝酸鹽，當(dāng)參與硫酸后生成亞硝酸吲哚，呈紅色反響。 (2)方法：將待檢菌接種于蛋白胨水中，置35孵育24h，參與濃硫酸數(shù)滴，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：呈紅色者為陽(yáng)性。 (4)運(yùn)用：霍亂弧菌呈陽(yáng)性反響，但本實(shí)驗(yàn)并非霍亂弧菌所特有。凡能產(chǎn)生吲哚并復(fù)原硝酸鹽為亞硝酸鹽的細(xì)菌，均可呈現(xiàn)陽(yáng)性反響。 三、碳源和氮源利用實(shí)驗(yàn) 1枸櫞酸鹽利用實(shí)驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌能利用枸櫞酸鹽作為獨(dú)一碳源，而在此培育基上生長(zhǎng)，并分解枸櫞酸鹽生成碳酸鈉，使培育基變堿性。 (2)方法：將待檢菌接種于枸櫞酸鹽培育基上，置35孵育14d，逐日察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：假設(shè)用溴麝香草酚蘭指示劑，斜面出現(xiàn)菌落或菌苔，

41、培育基變藍(lán)色為陽(yáng)性；無(wú)菌落生長(zhǎng)，培育基綠色為陰性。 (4)運(yùn)用：可用此實(shí)驗(yàn)作細(xì)菌種屬間鑒定。埃希菌屬、志賀菌屬、愛(ài)德華菌屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬、克雷伯菌屬通常陽(yáng)性，粘質(zhì)和液化沙雷菌和某些變形桿菌及枸櫞酸桿菌陽(yáng)性。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌和嗜水氣單胞菌也能利用枸櫞酸鹽。 2丙二酸鹽利用實(shí)驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌能利用丙二酸鹽作為獨(dú)一碳源，丙二酸鹽被分解生成碳酸鈉，使培育基變堿。 (2)方法：將待檢菌接種于丙二酸鹽培育基中，置35孵育2448h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：培育基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽(yáng)性。顏色無(wú)變化為陰性。 (4)運(yùn)用：腸桿菌科中亞利桑那菌和克雷伯菌屬為陽(yáng)性，枸櫞酸桿

42、菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬有不同生物型反響，其它各菌屬均為陰性。 3醋酸鈉利用實(shí)驗(yàn) (1)原理：細(xì)菌利用銨鹽作為獨(dú)一氮源，同時(shí)，利用醋酸鹽作為獨(dú)一碳源時(shí)，可在醋酸鹽培育上生長(zhǎng)，分解醋酸鹽生成碳酸鈉，使培育基變?yōu)閴A性。 (2)方法：將被檢菌接種于醋酸鹽培育基中，置35孵育27d，逐日察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：培育基上有細(xì)菌生長(zhǎng)，并變?yōu)樗{(lán)色為陽(yáng)性。 (4) 運(yùn)用：主要用于大腸埃希菌和志賀菌屬的鑒別，前者為陽(yáng)性，而后者為陰性。 4馬尿酸鈉水解實(shí)驗(yàn) (1)原理：某些細(xì)菌可具有馬尿酸水解酶，可使馬尿酸水解為苯甲酸和甘氨酸，苯甲酸與三氯化鐵試劑結(jié)合，構(gòu)成苯甲酸鐵沉淀。 (2)方法：將待檢菌接種于馬尿酸鈉培

43、育基中，置35孵育48h，離心沉淀，取上清液0.8ml，參與三氯化鐵試劑0.2ml，立刻混勻，經(jīng)1015min察看 結(jié)果。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)恒定之沉淀物為陽(yáng)性。 (4) 運(yùn)用：主要用于B群鏈球菌的鑒定。 5、乙酰胺利用實(shí)驗(yàn) (1)原理：許多非發(fā)酵菌產(chǎn)生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經(jīng)脫酰胺作用釋放氨，使培育基變堿。 (2)方法：將被檢菌接種于乙酰胺培育基中，置35孵育2448h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：培育基由綠色變?yōu)樗{(lán)色為陽(yáng)性。如不生長(zhǎng)，或稍有生長(zhǎng)，但培育基顏色不變?yōu)殛幮浴?(4)運(yùn)用：主要用于非發(fā)酵菌的鑒定。銅綠假單胞菌、去硝化產(chǎn)堿桿菌、食酸假單胞菌為陽(yáng)性，其它非發(fā)酵菌大多數(shù)為陰性。 四、酶類實(shí)

44、驗(yàn) 1.氧化酶實(shí)驗(yàn) (1)原理：氧化酶又稱細(xì)胞色素氧化酶，是細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)中的最終呼吸酶。此酶并不直接與氧化酶試劑起反響，而是先使細(xì)胞色素C氧化，然后 此氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反響。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞色素C的存在有關(guān)。 (2)方法：取干凈濾紙條，沾取菌落少許，加氧化酶試劑10g/L鹽酸四甲基對(duì)苯二胺水溶液或10g/L鹽酸二甲基對(duì)苯二胺水溶液1滴，1min內(nèi)察看結(jié)果。也可將試劑滴加到菌落上進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。 (3)結(jié)果：陽(yáng)性者立刻變粉紅色，510s內(nèi)呈深紫色。無(wú)色為陰性。 (4)運(yùn)用：用于奈瑟菌屬的菌種鑒定，該屬細(xì)菌均陽(yáng)性。此外，也用于假單胞菌屬與腸桿菌科細(xì)菌的區(qū)別，前者陽(yáng)性

45、，而后者陰性。莫拉菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等均為陽(yáng)性。 本卷須知： 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)防止接觸含鐵物質(zhì)，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性。10g/L鹽酸四甲基對(duì)苯二胺或10g/L鹽酸四甲基對(duì)苯二胺水溶液為無(wú)色溶液，在空氣中易被氧化而失效，故應(yīng)經(jīng)常改換新試劑，并盛于棕色瓶中，假設(shè)試劑已變成深藍(lán)色，應(yīng)棄去不用。 2觸酶實(shí)驗(yàn) (1)原理：觸酶又稱過(guò)氧化氫酶，具有過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過(guò)氧化氫成為水和原子態(tài)氧，繼而構(gòu)成氧分子，出現(xiàn)氣泡。 (2)方法：取干凈玻片1張，用接種環(huán)挑取細(xì)菌，加3H2O2 1滴，立刻察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：假設(shè)立刻出現(xiàn)大量氣泡為陽(yáng)性。無(wú)氣泡為陰性。 (4)運(yùn)用：大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，但鏈球菌科陰

46、性，故常用此實(shí)驗(yàn)來(lái)鑒定。此外，金氏桿菌屬的細(xì)菌也為陰性。分枝桿菌的鑒別那么用耐熱觸酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)核分枝桿菌為陰性，戈氏分枝桿菌和地分枝桿菌為陽(yáng)性。 本卷須知：3H2O2溶液要新穎配制。不宜用血瓊脂平板上生長(zhǎng)的菌落，因紅細(xì)胞含有觸酶，可致假陽(yáng)性反響，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌。 3凝固酶實(shí)驗(yàn) (1)原理：凝固酶實(shí)驗(yàn)是鑒定葡萄球菌致病性的重要實(shí)驗(yàn)。致病性葡萄球菌可產(chǎn)生兩種凝固酶，一種是與細(xì)胞壁結(jié)合的凝聚因子，稱結(jié)合凝固酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，使發(fā)生沉淀，包圍于細(xì)菌外面而凝聚成塊，玻片法陽(yáng)性結(jié)果是由此凝聚因子所致；另一種凝固酶是分泌至菌體外，稱為游離凝固酶，它能使凝血酶原變成凝血酶類產(chǎn)物，使纖維蛋白原

47、變?yōu)槔w維蛋白，從而使血漿凝固。試管法可同時(shí)測(cè)定結(jié)合型和游離型凝固酶。 (2)方法: 玻片法：在一張干凈玻片中央加1滴生理鹽水，用接種環(huán)取待檢培育物與其混合設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照制成菌懸液，假設(shè)經(jīng)1020s內(nèi)無(wú)自凝 景象發(fā)生，那么參與人或兔新穎血漿1環(huán)，與菌懸液混合，察看結(jié)果。試管法：于試管內(nèi)加14稀釋的兔或人血漿0.5ml，再加12個(gè)待試菌菌落，置37水浴，每30min察看1次結(jié)果。 (3)結(jié)果：玻片法：510s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽(yáng)性。試管法：如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽(yáng)性。2h后無(wú)上述景象出現(xiàn)，那么放置過(guò)夜后再察看。 (4)運(yùn)用：本實(shí)驗(yàn)僅用于致病性葡萄球的鑒定。 本卷須知：玻片法為挑選實(shí)驗(yàn)，陽(yáng)性、陰性均

48、需進(jìn)展試管法測(cè)定。血漿必需新穎。應(yīng)運(yùn)用肝素而非枸櫞酸鹽作抗凝劑抗凝的血漿。本實(shí)驗(yàn)也可用市購(gòu)的膠乳凝集實(shí)驗(yàn)試劑盒測(cè)定。 4DNA酶實(shí)驗(yàn) (1)原理： 某些細(xì)菌能產(chǎn)生DNA酶，水解外源性DNA使之成為寡核苷酸。DNA可被酸沉淀，而寡核苷酸那么不會(huì)。故在DNA瓊脂平板上加鹽酸后，可在 菌落周圍構(gòu)成透明區(qū)。 (2)方法：在DNA瓊脂平板上點(diǎn)種待檢菌，35孵育1824h，用1 mol/L鹽酸傾注平板，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：如菌落周圍有透明區(qū)者為陽(yáng)性，無(wú)透明區(qū)為陰性。 (4)運(yùn)用：主要用于腸桿菌科及葡萄球菌屬某些菌種的鑒定。沙雷菌、變形桿菌和金黃色葡萄球菌DNA酶均陽(yáng)性。 5膽汁溶菌實(shí)驗(yàn) (1)原理：膽

49、汁或去氧膽酸鈉能導(dǎo)致某些細(xì)菌溶解，一方面是由于膽汁或去氧膽酸鈉降低了細(xì)菌細(xì)胞膜上的外表張力，使細(xì)菌的細(xì)胞膜破損或使菌體裂 解。另一方面能夠與激活細(xì)菌體內(nèi)的自溶酶有關(guān)。 (2)方法：試管法：用純培育物制備1ml生理鹽水濃菌懸液，pH調(diào)至7.0，分裝兩支試管，各0.5ml。其中一管加0.5ml 100g/L去氧膽酸鈉為實(shí)驗(yàn) 管，另一管加0.5ml生理鹽水作對(duì)照。35孵育每小時(shí)察看1次結(jié)果。平板法：在血平板上選取單個(gè)可疑菌落，作好標(biāo)志，直接在菌落上加1接種環(huán)20g/L去氧膽酸鈉pH7.0，置35孵育30min平板不要翻轉(zhuǎn)察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：試管法：在3h內(nèi)液體透明為陽(yáng)性。平板法：如菌落消逝，僅留

50、下溶血區(qū)為陽(yáng)性，菌落不消逝為陰性。 (4)運(yùn)用：用于肺炎鏈球菌的鑒定。 6硝酸鹽復(fù)原實(shí)驗(yàn) (1)原理：硝酸鹽復(fù)原反響包括兩個(gè)過(guò)程，其一是在合成代謝過(guò)程中，硝酸鹽復(fù)原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉(zhuǎn)化為氨基酸和細(xì)胞內(nèi)其它含氮化合物；另一是在分解代謝過(guò)程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽替代氧作為呼吸酶系統(tǒng)中的終末受氫體。硝酸鹽復(fù)原過(guò)程可因細(xì)菌不同而異。有的細(xì)菌僅使硝酸鹽復(fù)原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌等；有的細(xì)菌可使其復(fù)原為亞硝酸鹽和離子態(tài)的銨；有的細(xì)菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽復(fù)原為氮，如沙雷菌屬；有的細(xì)菌還可以將其復(fù)原產(chǎn)物在合成性代謝中完全利用。硝酸鹽或亞硝酸鹽假設(shè)復(fù)原生成氣體的終末產(chǎn)物如氮或氧化氮，那么稱為脫硝化或脫氮化

51、作用。某些細(xì)菌能復(fù)原硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對(duì)氨基苯磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與-萘胺結(jié)合生成N-萘胺偶苯磺酸。 (2)方法：將待檢菌接種于硝酸鹽培育基內(nèi)含小倒管中，35孵育14d。將甲、乙等量混合液用時(shí)混合0.1ml加于試管內(nèi)，立刻或10min內(nèi)察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性反響。如欲察看有無(wú)氮?dú)猱a(chǎn)生，可于培育基管內(nèi)加1只小倒管，有氣泡產(chǎn)生，那么表示有氮?dú)馍伞Ｈ缬麢z查培育基中硝酸鹽能否被分解，可取鋅粉少許參與培育基內(nèi)，如出現(xiàn)紅色闡明硝酸鹽仍存在；假設(shè)不出現(xiàn)紅色，表示硝酸鹽已被分解。 (4)運(yùn)用：本實(shí)驗(yàn)廣泛用于細(xì)菌鑒定。腸桿菌科細(xì)菌均能復(fù)

52、原硝酸鹽為亞硝酸鹽；假單胞菌屬中有的細(xì)菌能產(chǎn)生氮?dú)?，如銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、斯氏假單胞菌，有的那么能復(fù)原硝酸鹽為亞硝酸鹽，如鼻疽假單胞菌等；厭氧菌如韋榮菌也能復(fù)原硝酸鹽為亞硝酸鹽。 7卵磷脂酶實(shí)驗(yàn) (1)原理：細(xì)菌產(chǎn)生的卵磷脂酶，經(jīng)鈣離子作用，能迅速分解卵黃或血清中的卵磷脂構(gòu)成混濁沉淀狀的甘油酯和水溶性磷酸膽堿。 (2)方法：取待檢菌劃線接種或點(diǎn)種在卵黃瓊脂平板上，置35孵育36h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：3h后在菌落周圍構(gòu)成乳白色混濁，即為卵磷脂酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，6h后該混濁圈可擴(kuò)展到直徑56mm。 (4) 運(yùn)用：該實(shí)驗(yàn)主要用于厭氧的鑒定。產(chǎn)氣莢膜梭菌和諾維梭菌為陽(yáng)性，其他梭菌為陰性。蠟

53、樣芽孢桿菌亦為陽(yáng)性。 8磷酸酶實(shí)驗(yàn) (1)原理：磷酸酶是磷酸脂的水解酶，可使單磷脂水解，其反響可根據(jù)反響基質(zhì)不同而異，如用磷酸酚酞為基質(zhì)，經(jīng)磷酸酶水解后可釋放酚酞，在堿性環(huán)境中呈紅色。 (2)方法：取待檢菌接種于磷酸酚酞瓊脂平板上，置35孵育1824h，于平皿蓋內(nèi)加1滴濃氨水，熏蒸片刻，察看結(jié)果。亦可用液體培育基，經(jīng)孵育后，向管內(nèi)加400g/L氫氧化鈉溶液1滴，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：菌落變?yōu)榧t色者為陽(yáng)性。 (4)運(yùn)用：主要用于致病性葡萄球菌與非致病性葡萄球菌的鑒別，前者為陽(yáng)性，后者為陰性。 9脂酶實(shí)驗(yàn) (1)原理：細(xì)菌產(chǎn)生的脂酶可分解脂肪為游離脂肪酸。在培育基中參與維多利亞藍(lán)可與脂肪結(jié)合成為

54、無(wú)色化合物，假設(shè)脂肪被分解，那么維多利亞藍(lán)釋出，呈藍(lán)色。 (2)方法：將待檢菌接種于含維多利亞藍(lán)的脂酶培育基中，置35孵育24h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：培育基變?yōu)樯钏{(lán)色者為陽(yáng)性，否那么可呈無(wú)色或粉紅色。 (4)運(yùn)用：主要用于厭氧菌鑒定。在擬桿菌中產(chǎn)黑色素?cái)M桿菌中間亞種產(chǎn)生脂酶，其它擬桿菌陰性；在梭菌屬中諾維梭菌和產(chǎn)芽胞梭菌也產(chǎn)生此酶，其它梭菌為陰性。 10CAMP實(shí)驗(yàn) (1)原理：B群鏈球菌無(wú)乳鏈球菌產(chǎn)生一種“CAMP因子，此種物質(zhì)能促進(jìn)葡萄球菌的-溶血素的活性。因此，可在兩種細(xì)菌的交界處溶血力加強(qiáng)，出現(xiàn)箭頭型透明溶血區(qū)。 (2)方法：在羊血或馬血瓊脂平板上，先以-溶血的金黃色葡萄球菌劃一橫

55、線接種。再將待檢菌與前一劃線作垂直接種，兩者應(yīng)相距1cm，于35孵育1824h，察看結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)做陰陽(yáng)性對(duì)照。 (3)結(jié)果：兩種細(xì)菌劃線交接處出現(xiàn)箭頭型溶血區(qū)為陽(yáng)性。 (4)運(yùn)用：主要用于B群鏈球菌陽(yáng)性的鑒定，其他鏈球菌均為陰性。 11石蕊牛乳實(shí)驗(yàn) (1)原理：由于牛乳內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)和糖類，各種細(xì)菌對(duì)這些物質(zhì)的分解才干不同，故可有數(shù)種不同反響，用以鑒別細(xì)菌。 (2)將待檢菌接種于石蕊牛乳培育基中，假設(shè)為芽胞梭菌，要在培育基中參與無(wú)菌鐵末，置35孵育1824h，必要時(shí)可延伸至14d。察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：產(chǎn)酸：發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，使指示劑變?yōu)榉奂t色。產(chǎn)氣：發(fā)酵乳糖而同時(shí)產(chǎn)氣，可沖開(kāi)上面的凡士

56、林。凝固：因產(chǎn)酸太多而使牛乳中的酪蛋白凝固。胨化：將凝固的酪蛋白繼續(xù)水解為胨，培育基上層液體變清，底部可留有未被完全胨化的酪蛋白。產(chǎn)堿：乳糖未發(fā)酵，因分解含氮物 質(zhì)，生成胺及氨，培育基變堿，指示劑變?yōu)樗{(lán)色。 (4)運(yùn)用：主要用于梭菌、鏈球菌和丙酸桿菌的鑒定。 腦腦2021-07-13 09:48五、抑菌實(shí)驗(yàn) 1Optochin敏感實(shí)驗(yàn) (1)原理：Optochin(奧普托欣)是鹽酸乙基氫化羥基奎寧的商品名。對(duì)肺炎鏈球菌有特異抑制造用，其作用機(jī)制能夠是干擾葉酸生物合成作用，而對(duì)其它鏈球菌那么無(wú)此作用。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌的肉湯培育物均勻涂布于血瓊脂平板上，貼上一張含5g奧普托欣紙片，置

57、燭缸或二氧化碳孵箱，35 孵育1824h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：抑菌圈直徑大于14mm為敏感，小于或等于 14mm為陰性。 (4)運(yùn)用：主要用于肺炎鏈球菌敏感與其它鏈球菌耐藥的鑒別。 2桿菌肽敏感實(shí)驗(yàn) (1)原理：A群鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎是100%敏感，而其它群鏈球菌對(duì)桿菌肽通常耐藥。故此實(shí)驗(yàn)可對(duì)鏈球菌進(jìn)展鑒別。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌的肉湯培育物均勻涂布于血瓊脂平板上，稍干后貼一張含0.04U的桿菌肽紙片，置35 孵育1824h，察看結(jié)果。 (3) 結(jié)果：抑菌圈直徑大于10mm為敏感，小于10mm為耐藥。 (4)運(yùn)用：主要用于A群與非A群鏈球菌的鑒別。從臨床分別的菌株中有5%15%非

58、A群鏈球菌也對(duì)桿菌肽敏感，如6%的B群鏈球菌、7.5%的C群鏈球 菌和G群鏈球菌等。 3新生霉素敏感實(shí)驗(yàn) (1)原理：金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌可被低濃度新生霉素所抑制，表現(xiàn)為敏感，而腐生葡萄球菌那么表現(xiàn)為耐藥。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌菌懸液均勻涂布于M-H瓊脂平板或血平板上，在平板中央貼含5g/片新生霉素診斷紙片一張，置35孵育1618h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：抑菌圈直徑大于16mm為敏感，小于或等于16mm為耐藥。 (4)運(yùn)用：主要用于葡萄球菌某些種的鑒定。 4O/129實(shí)驗(yàn) (1)原理：O/1292，4二氨基-6，7-二異丙基喋啶能抑制弧菌屬、發(fā)光桿菌屬和鄰單胞菌屬細(xì)菌生長(zhǎng)，而

59、氣單胞菌屬和假單胞菌屬細(xì)菌那么耐藥。 (2)方法：用棉拭子將待檢菌菌懸液均勻涂布于堿性瓊脂平板上，將10g/片及150g/片的O/129診斷紙片貼于平板上，置35孵育1824h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：出現(xiàn)抑菌圈者表示敏感，無(wú)抑菌圈者為耐藥。 (4)運(yùn)用：主要用于弧菌屬、鄰單胞菌屬與氣單胞菌屬的鑒別，弧菌屬和鄰單胞菌屬菌為敏感，氣單胞菌屬菌為耐藥。其它菌屬有發(fā)光桿菌屬為敏感，假單胞菌屬為耐藥。 5氰化鉀實(shí)驗(yàn) (1)原理：氰化鉀可抑制某些細(xì)菌的呼吸酶系統(tǒng)。細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶均以鐵卟啉作為輔基，氰化鉀與鐵卟啉結(jié)合，使這些酶失去活性，使細(xì)菌生長(zhǎng)遭到抑制。 (2)方法：將

60、待檢菌接種于氰化鉀培育基中，同時(shí)接種一支不含氰化鉀的對(duì)照培育基，置35孵育2448h，察看結(jié)果。 (3)結(jié)果：細(xì)菌在氰化鉀培育基中生長(zhǎng)的不受抑制為陽(yáng)性，不生長(zhǎng)抑制為陰性。 (4)運(yùn)用：腸桿菌科中的沙門菌屬、志賀菌屬和埃希菌屬細(xì)菌的生長(zhǎng)遭到抑制，而其它各菌屬的細(xì)菌均可生長(zhǎng)。 六、其它實(shí)驗(yàn) 1克氏雙糖鐵或三糖鐵瓊脂培育基實(shí)驗(yàn) (1)原理：克氏雙糖鐵(KIA)或三糖鐵瓊脂(TSI)培育基制成高層和短的斜面，其中葡萄糖含量?jī)H為乳糖或蔗糖的非常之一，假設(shè)細(xì)菌只分解葡萄糖而不分解乳糖和蔗糖，分解葡萄糖產(chǎn)酸使pH降低，因此斜面和底層均先呈黃色，但因葡萄糖量較少，所生成的少量酸可因接觸空氣而氧化，并因細(xì)菌生長(zhǎng)