噬菌體效價的測定在菌苔上逐步形成的噬菌體群體由于其

1、2.噬菌體效價的測定 在菌苔上逐步形成的噬菌體群體，由于其侵蝕宿主細胞的結(jié)果， 會使菌苔上出現(xiàn)一個個噬菌斑。因每種噬菌體的噬菌斑有一定的形狀、大小、邊緣和透明度， 故可用作鑒定的指標，也可利用噬菌斑進行純種分離和計數(shù)。這種情況甚像利用菌落可進行有關(guān)微生物的分離、計數(shù)和鑒定那樣。所不同的是噬菌體只形成“負菌落”。據(jù)測定，一個直徑僅為2mm的噬菌斑，其中噬菌體粒子的數(shù)目即高達107109個。. 效價(titre，titer)這一名詞在不同的場合有其不同的含義。在這里，(pfu，plaque-forming unit)數(shù)或感染中心(infective centre)數(shù)。 1 由于試祥中一般噬菌體粒子

2、含量較高，故應(yīng)先對試樣進行梯級稀釋，然后再選用合適的方法（見以下表解)測定其效價。2（1）雙層平板法 是一種被普遍采用并能精確測定效價的方法。預(yù)先分別配制含2%和1%瓊脂的底層培養(yǎng)基和上層培養(yǎng)基。先用前者在培養(yǎng)皿上澆一層平板，再在后者(須先融化并冷卻到45以下)中加入較濃的對數(shù)期敏感菌和一定體積的待測噬菌體樣品，于試管中充分混勻后，立即倒在底層平板上鋪平待凝，然后保溫。一般經(jīng)十余小時后即可進行噬菌斑計數(shù)。現(xiàn)把雙層平板法簡括如下: 34 雙層平板法主要有以下幾個優(yōu)點；加了底層培養(yǎng)基后，可使原來底面不平的玻璃皿的缺陷得到了彌補；所形成全部噬菌體斑都接近處于同一平面上，因此不僅每一噬菌斑的大小接近、

3、邊緣清晰，而且不致發(fā)生上下噬菌斑的重疊現(xiàn)象(下圖)；因上層培養(yǎng)基中瓊脂較稀，故形成的噬菌斑較大，更有利于計數(shù)。 5（2）單層平板法 在上述雙層平板中省略底層，但所用培養(yǎng)基的濃度和所加的量均比雙層平板法的上層為高和多。此法雖較簡便，但其實驗效果較差。（3）玻片快速法 將噬菌體和敏感的宿主細胞與適量的瓊脂培養(yǎng)基(0.50.8%瓊脂，事前融化)充分混合。涂布在無菌載玻片上，經(jīng)短期培養(yǎng)后，即可在低倍顯微鏡或放大鏡下計數(shù)。例如，用于金黃色葡萄球菌噬菌體的效價測定，僅需2.54.0小時即可，唯精確度較差。 6(4)斑點試驗法 這是一種半定量的預(yù)試驗方法。先將敏感的宿主菌濃懸液涂布于合適的培養(yǎng)基平板上，然后

4、使平板表面朝下，在45左右的溫箱中使平板表面不留水膜。再把不同稀釋度待測試樣依次用接種環(huán)點種在上述平板上。保溫數(shù)小時后，根據(jù)點樣處是否產(chǎn)生噬菌斑即可初步判斷該試樣的效價。(5)液體稀釋管法 與用于細菌活菌計數(shù)中的系列稀釋法相似。不同處是：各試管中均加有培養(yǎng)液；各管中均須接入處于對數(shù)期的宿主細胞；以不長菌的最高稀釋管來計算效價。 成斑率7 3.一步生長曲線 一步生長曲線：定量描述烈性噬菌體生長規(guī)律的實驗曲線稱為一步生長曲線。潛伏期，裂解期，平穩(wěn)期。效價8(1)潛伏期 指噬菌體的核酸侵入宿主細胞后至第一個噬菌體粒子裝配前的一段時間，故整段潛伏期中沒有一個成熟的噬菌體粒子從細胞中釋放出來。潛伏期又可

5、分兩段：隱晦期(eclipse phase），指在潛伏期前期人為地(用氯仿)裂解細胞，裂解液仍無侵染性的一段時間。胞內(nèi)累積期(intracellular accumulation phase)，又稱潛伏后期。指在隱晦期后，如人為地裂解細胞，其裂解液已出現(xiàn)侵染性的一段時間。這是菌體開始裝配的時期，在電鏡下可觀察到己初步裝配好的噬菌體粒子。9(2)裂解期 緊接在潛伏期后的一段宿主細胞迅速裂解、溶液中噬菌體粒子急劇增多的一段時間。噬菌體或其他病毒因沒有個體生長，只有個體裝配再加上其宿主細胞裂解的突發(fā)性，因此，從理論上來分析，裂解期應(yīng)是瞬時的。但事實上因為細菌群體中各個細胞的裂解不可能是同步的，故實際

6、上的裂解期還是較長的（見圖）。 (3)平穩(wěn)期(plateau) 指感染后的宿主已全部裂解，溶液中噬菌體效價達到最高點后的時期。10 一步生長曲線實驗最早由Ellis和Delbruck(1939)所設(shè)計。其基本步驟是：用噬菌體的稀懸液去感染高濃度的宿主細胞，以保證每個細胞至多不超過一個噬菌體吸附。經(jīng)數(shù)分鐘吸附后，混合液中加入一定量的該噬菌體的抗血清，借以中和尚未吸附的噬菌體。然后用保溫的培養(yǎng)液稀釋此混合液，同時可中止抗血清的作用。隨即置于該細菌最適生長溫度下培養(yǎng)。在一定的時間內(nèi)，每隔數(shù)分鐘從混合懸液中取出一份試樣，并作效價測定。114 .溶源性（1）溫和噬菌體 吸附并侵入宿主細胞后，噬菌體的DN

7、A只整合在宿主的基因組上，并可長期隨宿主DNA的復(fù)制而進行同步復(fù)制，因而在一般情況下不進行增殖和引起宿主細胞裂解的噬菌體，稱溫和噬菌體(temperate phage)或溶源噬菌體（lysogenic phage)。這種溫和噬菌體侵入宿主細胞而不引起宿主細胞裂解，即稱溶源性或溶源現(xiàn)象。其宿主細胞稱為溶原菌。12概括地說，溫和噬菌體的特點為：具有整合能力，當溫和噬菌體侵入其敏感宿主的細胞后，前者的核酸可整合到后者的核基因組(genome，即核染色體)上，這種處于整合態(tài)的噬菌體核酸，稱作前噬菌體(prophage）；具有同步復(fù)制能力，前噬菌體在一般情況下不進行復(fù)制和增殖， 而是隨宿主細胞的核基因組

8、的復(fù)制而同步復(fù)制，并平均分布到兩個子代細胞中去，如此代代相傳。13由此可見，溫和噬菌體的存在形式有三種：游離態(tài)：指已成熟釋放并有侵染性的游離噬菌體粒子；整合態(tài)：指整合在宿主核染色體上處于前噬菌體的狀態(tài)（一種潛伏的形式）營養(yǎng)態(tài)：指前噬菌體經(jīng)外界理化因子誘導(dǎo)后，脫離宿主核基因組而處于積極復(fù)制和裝配的狀態(tài)。 溫和噬菌體的種類很多，常見的有E.coli的 Mu-1、P-1和P-2噬菌體等。其中， 噬菌體是研究最為透徹的一種溫和噬菌體。14E.coli K12(): 表示一株帶有前噬菌體的大腸桿菌的K12溶源菌株。15（2）溶源菌(1ysogen或lysogenic bacteria)溶源菌有以下幾個特

9、性：自發(fā)裂解，在溶源菌的分裂過程中，會有10-210-5個細胞發(fā)生自發(fā)裂解(spontaneous lysis），其原因是由于少數(shù)細胞中原來處于整合態(tài)的前噬菌體轉(zhuǎn)變成營養(yǎng)態(tài)的裂解性噬菌體(lytic phage)之故；復(fù)愈，在溶源性細菌群體的增殖過程中，一般有10-5的個體喪失其前噬菌體，并成為非溶源性的細菌，這一過程稱為復(fù)愈或非溶源化，復(fù)愈后的細胞其免疫性也隨之喪失； 還有其他特征，以后的章節(jié)將有陸續(xù)介紹。在自然界中各種細菌、放線菌等都有溶源菌存在。16檢驗溶源菌的方法是將少量溶源菌與大量的敏感性指示菌（遇溶源菌裂解后所釋放的溫和噬菌體會發(fā)生裂解性生活周期者）相混合，然后與瓊脂培養(yǎng)基混勻后倒

10、一平板。過一段時間后溶源菌就長成菌落。由于在溶源菌分裂過程中有極少數(shù)個體會發(fā)生自發(fā)裂解，其釋放的噬菌體可不斷侵染溶源菌菌落周圍的指示菌菌苔，所以會產(chǎn)生一個個中央有溶源菌小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。17（二）植物病毒1、大多為ssRNA病毒。2、基本形態(tài)為桿狀、絲狀、球狀。3、對宿主的專一性較差，如TMV等。4、引起植物病害癥狀：破壞植物的葉綠體或葉綠素，是植 物葉片發(fā)生黃化、紅化或發(fā)生花葉；使植物發(fā)生矮化、叢枝或畸形；形成枯斑或壞死。5、增值中的侵入是被動方式。6、已知植物病毒有700多種（1989）。18（三）人類和脊椎動物病毒1、核酸類型很多，dsDNA，ssDNA，dsRNA，ssRNA。2、一般呈球狀。3、種類：300+9004、常見的人病毒 引起的疾病：感冒、肝炎、皰疹、流行性乙型腦炎、狂犬病以及艾滋病等。動物疾病：豬瘟、