宏基因組測(cè)序中短序列的注釋

1、宏基因組中短底列的注釋是理解測(cè)序微生物群落潛在功能的重 要步驟之一。單純利用局部匹配的注釋容易混淆那些蛋白同源性且 局部序列非常相似的序列,進(jìn)而不能真實(shí)準(zhǔn)確反映復(fù)雜蛋白質(zhì)家族 中多變的結(jié)構(gòu)和功能域。今天我們介紹一種新方法MetaGeneHunt，該方法可以識(shí)別特定的 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域,并根據(jù)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度對(duì)hit-counts進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 使用MetaGeneHunt對(duì)MG-RAST對(duì)公開獲取的宏基因組進(jìn)行分 析，包括哺孚物微生物群和Twin Gut腸道菌群研究，以評(píng)估短序列中含GH蛋白的頻率和位于GH區(qū)域的匹配頻率。在對(duì)糖苗水解酶(GHs)的研究，發(fā)現(xiàn)在所有樣本中4726,023條含 有GH區(qū)域蛋

2、白匹配的短讀序列中，有58.3%的廂列位于目標(biāo)區(qū)域 之外。接下來，在比較樣本之前，將匹配到目標(biāo)區(qū)域的hit-counts 標(biāo)準(zhǔn)化,以說明對(duì)應(yīng)的域長(zhǎng)度。腸道和盲腸中的菌群顯示出與不同 微生物組合相匹配的GH譜特征。相反，胃和結(jié)腸的菌群在結(jié)構(gòu)和功能上顯示出更多樣性和多變性。 在樣本中，盡管有波動(dòng)，但碳水化合物處理的潛在功能變化與群落 組成的變化相關(guān)。這表示，在利用MG-RAST平臺(tái)處理宏基因組測(cè) 廂寤列時(shí)，MetaGeneHunt是一種能快速準(zhǔn)確地識(shí)別短序列宏基因 組中離散蛋白結(jié)構(gòu)試的新方法。在過去的幾十年里，宏基因組DNA的高通量測(cè)序已經(jīng)產(chǎn)生了大量 的廂列，這些序列的特征為我們了解微生物群落的結(jié)

3、構(gòu)和功能提供了許多認(rèn)知。例如，截至2019年12月，MG-RAST托管了約40 萬(wàn)個(gè)可公開訪問的帶注釋的數(shù)據(jù)集。在數(shù)據(jù)處理過程中，不考慮目 標(biāo)區(qū)域（或蛋白質(zhì)）的長(zhǎng)度會(huì)導(dǎo)致兩個(gè)主要的系統(tǒng)偏差。首先，目標(biāo)區(qū)城越長(zhǎng)，他們的頻率就越容易被高估。其次，如果數(shù) 據(jù)處理涉及稀疏性r較短的、不太豐富的域，盡管重要,也可能被 丟棄。為了解決這些問題，研究人員設(shè)計(jì)了 MetaGeneHunt來精確 注釋從MG-RAST檢索到的短序列宏基因組中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。MetaGeneHunt將MG-RAST提供的短陰列局部比對(duì)與M5nr數(shù)據(jù) 庫(kù)中精確的基于PFam的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域識(shí)別相結(jié)合，以在公共可訪 問數(shù)據(jù)集中識(shí)別蛋白質(zhì)

4、結(jié)構(gòu)域。方法MetaGeneHunt 簡(jiǎn)要說明：MetaGeneHunt 的設(shè)計(jì)基于 MG-RAST 平臺(tái)注釋的數(shù)據(jù)集的。在使用GeneHunt創(chuàng)建的M5nr數(shù)據(jù)庫(kù)中， MetaGeneHunt使用了糖昔水解酶和輔助結(jié)構(gòu)域（如CBMs）的精確的 特定結(jié)構(gòu)懺注釋（PFam）作為參考注釋表（RAT）。首先，MetaGeneHunt使用MG-RAST應(yīng)用程序接口從MG-RAST （330和650文件）檢索M5n注釋的宏基因組。接下來，使 用來自RAT的注釋命中的MD5id ,在文件650中識(shí)別與潛在的 GHs匹配的序列。接下來，對(duì)于這些局部匹配”將精確對(duì)齊位置與RAT中特定于域的 注釋進(jìn)行比較。如果

5、查詢中的20AAs與特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（考慮 到RAT中的HMMenvelope位置）對(duì)齊，則該結(jié)構(gòu)域注釋被轉(zhuǎn)移到查 詢中。相反，如果查詢的20AAS匹配在目標(biāo)區(qū)域之外（例如，在連接域、輔 助域、信號(hào)肽中），則該注釋被認(rèn)為是否定的。用戶可以隨意修改重 疊（overlapping ）的閾值。接下來，從序列聚集文件（330文件） 中檢索每個(gè)識(shí)別出的命中的實(shí)際序列計(jì)數(shù)。最后，在后續(xù)的數(shù)據(jù)處理 和標(biāo)準(zhǔn)化過程中，根據(jù)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的大小，對(duì)每個(gè) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的命中計(jì)數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。方法驗(yàn)證：文中使用的原始數(shù)據(jù)和預(yù)處理數(shù)據(jù)可在MG-RAST服務(wù)器上 公開訪問。在mgp20861項(xiàng)目中可獲得對(duì)應(yīng)

6、于555百萬(wàn)個(gè)100 bp序 列的小鼠微生物組數(shù)據(jù)。使用MG-RAST API檢索了哺孚物微生物 組數(shù)據(jù)（nigpll6 ）和雙腸腸道菌群硏究（mgplO ）其他數(shù)據(jù)集。哺乳 動(dòng)物微生物組研究糖苗水解酶（GHs ）和相關(guān)酶的附加注釋表是從 Brian Muegge （直接對(duì)應(yīng)）獲得的。使用MG-RAST API檢索了預(yù)處理 的數(shù)據(jù)，包括從門到屬水平的讀物分類注釋。數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)使用R 統(tǒng)計(jì)語(yǔ)言。主要結(jié)果 糖莒水解酶的識(shí)別識(shí)別蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域并考慮其長(zhǎng)度產(chǎn)生了一個(gè) 健壯的功能注釋系統(tǒng)，對(duì)hit-count的標(biāo)準(zhǔn)化反應(yīng)了目標(biāo)區(qū)域的實(shí)際 分布。bGH 27L33 (Raw fl count)GH125C

7、oLmnZ-SarcCBM4/9 GH42 GH4 GH4C GH42Mgpe.CG心4Domain Length 1 r-jItII 11. OH M LF:L M2 F:L F M3M L m? F：C M5 M S M2 F:S M3M S M8 F:l M5ML M3 M I M2 F:l M5M I M6 M I M5 M C MS F:S M8 F：C M3 M C M6 M CG粼GH63GH42CCBM48 GH24 GH66 GH39Normalized Hit Count500010000aaSex Female MaleLocationCecum IntestineE C

8、olona）.橫軸為目標(biāo)區(qū)域的原始hit-count,縱軸為標(biāo)準(zhǔn)化后的hit-count, 圖中的顏色階梯表示目標(biāo)區(qū)域的長(zhǎng)度。這種標(biāo)準(zhǔn)化主要影響長(zhǎng)度短的 域（例如,GH78、GH25）、小的亞域（例如,GH31N、GH36C）和目 標(biāo)區(qū)域的附屬域（例如，CMB5J2）Ob）.小鼠胃腸道中目標(biāo)區(qū)域的標(biāo)準(zhǔn)化后的hit-count （僅顯示大于100 的hit-count的區(qū)域），可見，標(biāo)準(zhǔn)化后的hit-count與結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度無(wú) 關(guān)（附加文件中有對(duì)兩者做相關(guān)分析，結(jié)果分別為P.pearson=0.38 , P.spearman二0.33 ）c）.熱圖顯示了小鼠胃腸道中最受樣本來源影響的被稀疏標(biāo)準(zhǔn)化的

9、 GH區(qū)域的分布（two-way方差分析）?？v軸的注釋列Mx:F/M:S/l/C/L 分別表示小鼠（樣本號(hào)）雌性/雄性:胃/腸/盲腸/結(jié)腸 小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)，與盲腸中的微生物群落相比，結(jié)腸與腸道 中的微生物群落結(jié)構(gòu)更相似結(jié)腸和胃中的微生物群落有較高的相似 性。匚&5S2SSGonus (Phylum)50() AO&H0Q 匸b 7525s O_i S SAkkermansia (V) Alistipes (B) Bacillus (F) Bacteroides (B) Bifidjbaderium (A) Blautia (F) Bryantella (F) ButyrMbno (F) C

10、lostridium (F) Doroa (F) Eubacterium (F) HokJemama (F) Lactobacillus (F) Pa陽(yáng)bacteroides (B) Porphyromonas (B) Prevotella (B) Roseburia (F) Ruminococcus (F) Turidbacter (F).26PhyljnnBiftdobactenum (MDS2=0.23)Turidbacter (MDS2=0.35ActinobactoriaLactobacillus BacterodetesFlrrhculesHoldemaniaPrevoteilaS

11、tomachButyrivibrioAkkermansiaProteoOactoria VorruoomicrobaEubaaenumClostridiumRuminococcusBlautia Dorea RoseburKParabacteroidesPorphyromonascteroidsIntestneCecumfl Colon4342剛 MDS1 M3禍樓恥a）.對(duì)受樣本來源影響較大的樣本根據(jù)屬水平進(jìn)行樣本聚類 （Bray-Curtis 距離指數(shù),complete linkage ）。b）.樣本間的微生物群落組成，只展示了相對(duì)豐度至少占群落中1 %的 屬水平物種（V:疣微菌門,B:擬

12、桿菌門,A:放線菌門，F(xiàn):厚壁菌門）。20o.NMDS分析(2D stress=0.020),展示了在樣本聚類中都存在的這 些菌屬,在b)中的主要類群用標(biāo)簽指示，不同門水平按顏色區(qū)分，點(diǎn) 的大小反映該屬在樣本中的最大頻率。微生物組中的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系, 多樣性仍然與潛在功能高度相關(guān)。胃和盲腸的群落在結(jié)構(gòu)和功能上是 最多樣化的。其次，腸道中的群落組成和功能大多是保守的，而與保 守的微生物群落相關(guān)的大腸則顯示出可變功能潛力。(ee_E一 SSQs 一 Mo-Aem閹 Aqed)_susod leuoBunLL0.05-山口 口0.00-0 Stomach(九5= 0 82 PpyVO 01) Inte

13、stine (RPoafSor= 0.73. Pp0.001) Cecum (RPearscn= 0.89, P0.001) Colon (Rpag= 0.56. PPMrscn0.01)0.00.1 0.2Microbial Community Structure(Pairwise Bray-Curtis Dissimilarity)0.3AO對(duì)同一位置的樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能差異進(jìn)行成對(duì)比較 (Bray-Curtis )，線條為線性回歸的結(jié)果。在胃，腸，盲腸和結(jié)腸中， 屬水平群落結(jié)構(gòu)的變化與多糖解構(gòu)功能的相關(guān)性分析結(jié)果表示除大 腸外，其余的P.pearson的值都在0.001以下。胃和盲腸的群落在結(jié) 構(gòu)和功能上是最多樣化的,盡管多樣性仍然與功能潛力高度相關(guān)。其 次，腸道中的群落組成和功能大多是保守的，而與保守的微生物群落 相關(guān)的大腸則顯示出可變的功能潛力。MetaGeneHune提供了一種新的方法來識(shí)別短序列宏基因組中的 GHs及其相關(guān)結(jié)構(gòu)域。識(shí)別結(jié)構(gòu)域而不是蛋白質(zhì)是至關(guān)重要的，因 為GH結(jié)構(gòu)域與許多可變結(jié)構(gòu)域相關(guān)。這種新方法基于GeneHunt 注釋方法，并對(duì)其進(jìn)行補(bǔ)充，旨在分析MG-RAST中的短序列宏基因 組。因此，它不需要大型計(jì)算機(jī)基礎(chǔ)設(shè)施。通過這種新