原核生物RNA基本概念和轉(zhuǎn)錄

1、原核生物RNA基本概念和轉(zhuǎn)錄 基本概念；原核生物轉(zhuǎn)錄起始、RNA聚合酶、啟動子； 轉(zhuǎn)錄的基本過程； 真核生物轉(zhuǎn)錄起始、RNA聚合酶、啟動子；轉(zhuǎn)錄的基本過程； 真核生物轉(zhuǎn)錄后的加工； 原核生物與真核生物mRNA的特征比較； RNA合成與DNA合成異同點；第一節(jié) 若干基本概念 基因表達的第一步； 以D. S. DNA中的一條單鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板； 在依賴DNA的RNA聚合酶的作用下進行的； 模板單鏈 DNA的極性方向為3 5, 而非模板單鏈 DNA的極性方向與RNA鏈相同，均為5 3；(書寫基因序列時，僅寫非模板序列，可不注明極性方向)DNA 3-TACTCAT-5RNA 5-AUGAGUA-35-

2、ATGAGTA-3Non-template (sense strand)template (antisense strand) 按A U，C G 配對的原則，合成RNA分子； RNA的轉(zhuǎn)錄包括promotion, elongation, termination 三過程 從啟動子（promoter）到終止子（terminator）稱為 轉(zhuǎn)錄單位 （transcriptional unit） 轉(zhuǎn)錄原點記為+1，其上游記為負值，下游記為正值 原核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為 polycistron in operon 真核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為monocistron, No operon +1 -10 +10

3、upstreamstart pointdownstream 位于起始位點之前的序列稱為轉(zhuǎn)錄單位的上游(Upstream)，起始 位點之后(在轉(zhuǎn)錄序列之內(nèi))的序列被稱為下游(Downstream)。轉(zhuǎn)錄的不對稱性： 在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板，稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。編碼鏈與模板鏈與mRNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈；將另一條根據(jù)堿基互補原則指導(dǎo)mRNA合成的DNA鏈稱為模板鏈。模板鏈并非永遠在同一條單鏈上轉(zhuǎn)錄方向5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈轉(zhuǎn)錄方向第二節(jié) 原核生物的轉(zhuǎn)錄一、原核生物轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)；二、轉(zhuǎn)錄的起始，延伸；三、轉(zhuǎn)錄的終止；四、轉(zhuǎn)錄的抗終止。一

4、、原核生物轉(zhuǎn)錄的分子基礎(chǔ)：（一）、RNA聚合酶：1、E. coli的聚合酶負責所有mRNA、rRNA和tRNA的合成。 一個E. coli細胞中約有7000 個RNA聚合酶分子。任意時刻大概有20005000 RNA聚合酶在合成RNA；2、E. coli的全酶是一個質(zhì)量約465kD 的分子，由兩個、亞基及一個 因子所組成。其中， 、亞基構(gòu)成了核心酶，加上因子之后便構(gòu)成了全酶。即： 全酶=核心酶+ 因子（1） 亞基的功能： 當噬菌體T4感染E. coli時，宿主亞基被糖基化修飾。修飾導(dǎo)致了原來被全酶所識別的啟動子親和力下降，這就提示：3、各亞基的功能：亞基在啟動子識別中起作用。亞基的作用： 位于

5、前端的因子使雙鏈解鏈為單鏈 ； 位于尾端的因子使單鏈新聚合為雙鏈。 核心酶的組建順序：因子+ 2+ + （2）亞基： 重復(fù)使用(Reusable) 使 Holo-enzyme識別啟動子, 并與模板鏈結(jié)合 修飾 RNApol 構(gòu)型，降低全酶與DNA的非特異性結(jié)合力增強全酶與啟動子位點的特異性結(jié)合力RNA鏈合成達89個堿基時，因子釋放，離開核心酶，由核心酶負責延伸。因子能夠保證細菌RNA 聚合酶穩(wěn)定地結(jié)合到某個特異的、唯一的DNA啟動子上。例如：正常情況下負責大多數(shù)基因轉(zhuǎn)錄的是70 。但32和E在環(huán)境變化（熱激）時被表達。28用于正常生長時鞭毛基因的表達。 在大腸桿菌中，存在多種因子。不同的因子可

6、以識別不同的啟動子序列，從而可以啟動不同基因的表達； 大腸桿菌的熱激應(yīng)答基因的表達的調(diào)控是通過32實現(xiàn)的。溫度升高時32數(shù)量增加，而溫度恢復(fù),32活性降低來完成誘導(dǎo)。 32合成的基本信號是溫度增加導(dǎo)致未折疊蛋白質(zhì)(部分變性蛋白質(zhì))在細胞內(nèi)累積。 另一組熱調(diào)控基因的表達是由E 因子控制，它負責對比32 更劇烈的溫度變化應(yīng)答。它是由熱變性蛋白質(zhì)的積聚所誘導(dǎo)的。 大腸桿菌細胞含有少量54 ，當培養(yǎng)基中缺乏氮時被激活。在這些情況下，基因被開啟以便利用可替代氮源。因子： 促進RNA pol + NTP RNA elongation ； 完成 NTP之間的磷酸脂鍵的連接 ； 與 Rho()因子競爭RNA

7、3-end 。 因子； 強堿性亞基 促使RNA聚合酶與 有義鏈（sense strand）的結(jié)合 總結(jié)：Holo Enzyme 含有的功能位點 sense strand DNA binding point( ) DNA/RNA hybrid site() D. S.DNA unwinding point() D. S.DNA rewinding point() 原核生物RNApol (Core) 的結(jié)構(gòu)與功能Enzyme MovementDNA coding strand ( )Rewinding point ()Unwinding point ()RNA binding site RNA/D

8、NA hybrid ()DNA template strand 10-17bp 總結(jié)：大腸桿菌RNA聚合酶的組成分析亞基基因相對分子量亞基數(shù)組分功能rpoA365002核心酶核心酶組裝，啟動子識別。解螺旋及重新螺旋rpoB1510001核心酶和共同形成RNA合成的活性中心rpoC1550001核心酶？110001核心酶？rpoD700001因子存在多種因子，用于識別不同的啟動子RNA聚合酶與DNA聚合酶的區(qū)別RNA聚合酶DNA聚合酶大小(M)大，4.8105dol小，1.09105dol引物無有產(chǎn)物較短，游離較長，與模板以氫鍵相連作用方式一條鏈的某一段兩條鏈同時進行外切酶活性無5 3，3 5校

9、對合成能力無有修復(fù)能力無有（二）、啟動子1、啟動子的發(fā)現(xiàn)方法：Promoter region identified by DNAase method RNA polymerase (no NTP) DNA sequencing DNase digestion DNA +dissolve大腸桿菌RNA聚合酶全酶所識別的啟動子區(qū) 通過比較不同基因的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)細菌具有四個保守位點：起始位點、-10 區(qū)、-35 區(qū)以及-10 和-35 區(qū)之間間隔距離。2、原核生物啟動子的特點：（1）、起始位點通常(90%)都是嘌呤堿基。該堿基左右兩側(cè)的堿基通常是C（左側(cè)），T（右側(cè)），即：組成CAT序列。啟動子

10、定義：指能被RNA聚合酶全酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。 （2）、在起始位點上游，在幾乎所有的啟動子中都可以發(fā)現(xiàn)一個6bp 的區(qū)域。六聚物的中心通?？拷鹗键c上游的10bp。該區(qū)稱為10區(qū)。它的同源序列為TATAAT。 可被總結(jié)為如下形式：T(80)A(95)T(45)A(60)A(50)T(96) ，其中，數(shù)字表示堿基出現(xiàn)最大頻率的百分數(shù)。該區(qū)又稱為Pribnow Box。 -10 序列中開始的高度保守的TA 和最后一個幾乎完全保守的T 是最重要的堿基。（3）、TTGACA區(qū)：大腸桿菌啟動子中另外一個保守區(qū)是以起始位點上游-35bp為中心的，稱-35區(qū)。其共有序列為TTGACA

11、，各堿基出現(xiàn)的頻率為：T(82)T(84)G(78)A(65)C(54)A(45)。其中括號數(shù)字表示該堿基出現(xiàn)的頻率。該區(qū)又稱為 Sextama Box 。（4）、在90%啟動子中，-35 和-10 區(qū)之間的分隔距離在16 到18bp 之間，其中最適距離為17bp，這個距離對于啟動子啟動基因表達效率是最佳的。個別例外的可以小于15 或者大于20bp。盡管間隔區(qū)的真實序列并不重要，但間隔距離大小可以保持兩個區(qū)恰當?shù)木嚯x，從而使兩個區(qū)適合于RNA 聚合酶的幾何結(jié)構(gòu)，所以可以增加啟動子的啟動效率。 原核生物啟動子的結(jié)構(gòu)：典型啟動子的結(jié)構(gòu) -35 -10 轉(zhuǎn)錄起點TTGACA 16-19bp TATA

12、AT 5-9bp3、Sextama Box 與Pribnow Box的功能：（2）、-10 區(qū)序列的突變不影響轉(zhuǎn)錄閉合復(fù)合體的形成，但是其向轉(zhuǎn)錄開放復(fù)合體的轉(zhuǎn)變變慢。（1）、兩個區(qū)功能的研究方法：利用堿基突變來驗證序列功能。該結(jié)果表明， -10 區(qū)序列組成了啟動子的“解旋域” (Unwinding domain) 。（3）、 -35 區(qū)序列的突變使轉(zhuǎn)錄閉合復(fù)合體的形成速度減慢，但并不抑制其轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄開放復(fù)合體。因此-35 區(qū)序列的功能是為RNA 聚合酶的識別提供信號，因此，可以將-35 區(qū)序列看作是“識別域” (Recognitiondomain) 。（4）、 Sextama Box 與Pri

13、bnow Box 間距17bp, 有利于RNApol啟動17bp的間距較17bp的序列特異性對轉(zhuǎn)錄更為重要（5）、Sextama Box or Pribnow Box mut. 轉(zhuǎn)錄率下降100XSextama Box and Pribnow Box mut. 轉(zhuǎn)錄率下降1000X4、Promoter與factor 間的作用 二者結(jié)合的專效性決定了 某個啟動子是strong promoter 還是 weak promoter 與標準啟動子序列同源性愈高 啟動強度愈大 與標準啟動子序列同源性愈低 啟動強度愈小 若與標準啟動子序列差異很大 則由另一種因子啟動E.coli ; 4factor rec

14、ognition 4 promoters Bacillus ; 10factor recognition 10 promoters二、原核生物基因轉(zhuǎn)錄的起始過程：1、全酶結(jié)合到啟動子序列上，形成一個閉合(Closed)的二元復(fù)合物而開始反應(yīng)；2、與酶結(jié)合的一小段DNA 序列的“溶解”導(dǎo)致了閉合復(fù)合體轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放(Open)復(fù)合體。對于強啟動子來說，閉合復(fù)合體向開放二元復(fù)合物的轉(zhuǎn)變是不可逆轉(zhuǎn)的。（一）、轉(zhuǎn)錄的起始：3、第三步是最開始的兩個核苷酸之間的連接。在它們之間會形成一個磷酸二酯鍵，這樣，所產(chǎn)生的三元復(fù)合物(Ternary complex)就包括RNA、DNA、聚合酶。4、當起始過程完成后，聚

15、合酶釋放出因子而轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵拿福笳吆虳NA、新生RNA 組成延伸三元復(fù)合物。 接下來加入的前九個核苷酸，聚合酶是一直不移動的，產(chǎn)生一條短RNA鏈，直到九個堿基為止。九個堿基中的任何一個加入后，聚合酶都有釋放RNA的可能性，導(dǎo)致流產(chǎn)起始(Abortive initiation)。但流產(chǎn)起始之后聚合酶又開始合成第一個堿基。流產(chǎn)起始常常產(chǎn)生一系列短的寡聚核苷酸(29 個堿基)。總結(jié)：轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄延伸之前，RNA聚合酶要經(jīng)過數(shù)個步驟。閉合二元復(fù)合物轉(zhuǎn)化為開放二元復(fù)合物，開放二元復(fù)合物再轉(zhuǎn)化為三元復(fù)合物。（二）、起始過程中的RNA聚合酶的形態(tài)變化：1、當RNA聚合酶全酶最初結(jié)合到DNA上時，它覆蓋了從

16、-55 到+20大約7580bp 的長度。2、伴隨因子的失去，聚合酶與-55到-35 的結(jié)合也失去，僅剩下約60bp 的DNA被聚合酶所覆蓋。 這說明：啟動子的上游部分僅參與RNA 聚合酶的起始識別，起始以后便不再起作用。3、當RNA 鏈延伸到1520 個堿基時，酶會發(fā)生進一步的形態(tài)變化，轉(zhuǎn)變成負責轉(zhuǎn)錄延伸的復(fù)合體，僅覆蓋3040bp長度。RNA聚合酶首先與-55到+20之間的區(qū)域接觸，當 因子解離下來后，核心酶與-30 左右的序列結(jié)合。接著核心酶向前移動，結(jié)構(gòu)逐漸致密并最終形成延伸復(fù)合物?？偨Y(jié)：轉(zhuǎn)錄起始過程中復(fù)合物的變化象蠕蟲一樣移動三、轉(zhuǎn)錄的延伸： 因子釋放后，進入鏈的延長階段1、RNA

17、合成在一個“轉(zhuǎn)錄泡(Bubble)”中進行，在轉(zhuǎn)錄泡中，DNA被瞬間分離成單鏈，其中一條被作為RNA合成的模板。當RNA聚合酶沿DNA移動時，空泡也隨之移動。RNA 鏈 的 延 伸35RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動方向新生RNA復(fù)鏈解鏈有義鏈模板鏈（反義鏈）延長部位DNARNA鏈的合成方向53 各種結(jié)果表明，RNA-DNA雜交區(qū)的長度在39 個堿基對之間。所有核苷酸的合成都是從游離核苷酸的5-三磷酸基團與RNA鏈末端的3-OH之間的縮合反應(yīng)。新加入核苷酸失去末端的兩個磷酸基(和)；其磷酸基與RNA鏈形成磷酸二酯鍵。這個反應(yīng)發(fā)生在催化位點。2、磷酸二酯鍵的形成： 37時反應(yīng)速度約為每秒40

18、個核苷酸(細菌RNA聚合酶)；這與翻譯的速度(每秒15個氨基酸)大致相同， RNA 聚合酶控制著下一個核苷酸的加入。該酶可能僅當一個核苷酸與模板形成氫鍵互補配對時才允許磷酸二酯鍵的形成。如果該核苷酸與模板不匹配，則將其去除，接著另一個核苷酸加入。3、延伸的速度：4、核苷酸加入的控制：四、細菌RNA 轉(zhuǎn)錄的終止：1、一旦RNA 聚合酶開始轉(zhuǎn)錄，酶就沿模板向前移動合成RNA，直到遇到一個終止子(Terminator)，聚合酶停止向正在生長的RNA鏈添加核苷酸，釋放合成的RNA產(chǎn)物，從DNA模板上解離。 終止子：是RNA聚合酶停止RNA轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。 終止過程需要所有維持RNA-DNA雜交的

19、氫鍵斷裂，然后DNA 重新形成雙螺旋。2、根據(jù)體外實驗中RNA 聚合酶是否需要輔助蛋白質(zhì)參與終止，可將E. coli 中的終止子分為兩種類型： 在體外，沒有任何其它因子參與，核心酶也能在某些位點終止轉(zhuǎn)錄，這些位點被稱為“內(nèi)源性終止子(Intrinsic terminator)”?！耙蜃右蕾囆徒K止子”：體外需要因子的輔助；突變實驗顯示體內(nèi)該因子參與了終止過程 。（1）、內(nèi)源性終止子：A、終止子的結(jié)構(gòu)特點： 內(nèi)源性終止子有兩個明顯的結(jié)構(gòu)特點：一個二級結(jié)構(gòu)中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄單位最末端的連續(xù)約6個U 殘基的區(qū)段。這兩個特點都是終止所必需的。 發(fā)夾的基底部通常包含一個富含G:C區(qū)。 發(fā)夾和U區(qū)段的典型距離為79個堿基。有時U區(qū)段可以插有其它堿基。終止子內(nèi)部包含能夠形成7-20bp長度發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū)。莖環(huán)結(jié)構(gòu)有富含尿嘧啶核苷酸的G-C 區(qū)。內(nèi)源性終止子的結(jié)構(gòu)B、內(nèi)源性終止子終止的機理： RNA聚合酶遇到發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物合成速度會減慢(或者是暫停)； 正確位置的一段U 殘基是RNA 聚合酶遇到發(fā)夾而暫停時從模板解離下來所必需的。 rU:dA(RNA-DNA雜交)是一個不常見的弱堿基配對結(jié)構(gòu)，對它的破壞所需能量最少。當聚合酶暫停時，RNA-DNA 雜交鏈從終止區(qū)的弱鍵rU:dA 處解開。 -依賴型終止作用所需的序列長5090 個堿基，該區(qū)域的共同特征是