核酸檢測實(shí)驗(yàn)室建立和應(yīng)用

1、關(guān)于核酸檢測實(shí)驗(yàn)室建立與應(yīng)用第一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.20222核酸擴(kuò)增檢測實(shí)驗(yàn)室的建立人員場地檢測方法選擇實(shí)施方案依據(jù)：衛(wèi)生部頒發(fā)的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法（衛(wèi)醫(yī)發(fā)200210號(hào)）第二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.20223核酸實(shí)驗(yàn)室人員要求資質(zhì):經(jīng)過臨檢中心PCR培訓(xùn)班培訓(xùn)并取得上崗證；通過血站核酸實(shí)驗(yàn)室崗前培訓(xùn)考試合格。 培訓(xùn):無”核酸”的概念形成, 防污染的概念良好工作習(xí)慣的培養(yǎng). 報(bào)告的正確發(fā)放.后備人員的培養(yǎng).第三張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.20224試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析

2、區(qū)樣本離心交接區(qū)報(bào)告發(fā)放區(qū)核酸實(shí)驗(yàn)場地第四張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.20225 方法選擇: TMA與PCRTMAPCR擴(kuò)增原理模擬自然 DNA 轉(zhuǎn)錄成 mRNA 的過程模擬自然DNA復(fù)制的過程靶目標(biāo)RNADNA酶MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7 RNA聚合酶 DNA聚合酶反應(yīng)體系兩種酶，兩條引物，dNTP, NTP一種酶，一對引物，dNTP溫度條件恒溫（41.5 ）循環(huán)導(dǎo)熱（變性，退火，延伸）擴(kuò)增儀器水浴箱或者加熱塊熱循環(huán)儀擴(kuò)增產(chǎn)物RNADNA擴(kuò)增速度每個(gè)循環(huán)可以生成100-1000個(gè)復(fù)制物，在15-30分鐘內(nèi)可增加10億倍復(fù)制物以2n擴(kuò)增，23 h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大

3、10億倍第五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.20226 TMA的優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)自動(dòng)化程度高靈敏度高擴(kuò)增效率高：10n 不能絕對定量第六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.20227 PCR的優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)易于自動(dòng)化靈敏度高 擴(kuò)增效率高匯集拆分過程繁瑣 拆分可減低非反應(yīng)性比率第七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.20228核酸試劑質(zhì)控試劑的確認(rèn) 試劑運(yùn)輸過程的控制(溫度條件時(shí)限) 靈敏度的要求 內(nèi)標(biāo)的要求試劑涵蓋的基因型 第八張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.20229檢測流程(1):常規(guī)篩查合格匯集標(biāo)本檢測流程第九張，PP

4、T共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202210檢測流程(2):常規(guī)篩查合格單人份標(biāo)本檢測流程第十張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202211檢測流程(3):平行檢測流程樣本清點(diǎn)交接核酸單份檢測常規(guī)檢測合格標(biāo)本不合格標(biāo)本陰性標(biāo)本反應(yīng)性標(biāo)本合格標(biāo)本發(fā)布結(jié)果單項(xiàng)目反應(yīng)性無反應(yīng)性 陽性或可疑結(jié)果淘汰 陽性或可疑結(jié)果淘汰第十一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202212標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫核酸實(shí)驗(yàn)室設(shè)置與管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本檢測流程核酸實(shí)驗(yàn)室崗位職責(zé)核酸實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵試劑管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室檢測標(biāo)本管理規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室室

5、間質(zhì)量評價(jià)規(guī)范核酸實(shí)驗(yàn)室記錄管理制度核酸實(shí)驗(yàn)室生物防護(hù)規(guī)范核酸反應(yīng)性獻(xiàn)血者追蹤規(guī)程核酸實(shí)驗(yàn)室檢測應(yīng)急措施第十二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202213標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)的編寫核酸標(biāo)本離心交接操作規(guī)程核酸標(biāo)本提取及匯集操作規(guī)程(科華) 核酸標(biāo)本擴(kuò)增檢測操作規(guī)程（科華）核酸標(biāo)本全自動(dòng)檢測分析系統(tǒng)操作規(guī)程（CHIRON）核酸標(biāo)本檢測報(bào)告發(fā)布操作規(guī)程（唐山軟件）核酸標(biāo)本檢測復(fù)檢操作規(guī)程生物安全柜標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程可移動(dòng)紫外線燈標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程低溫高速離心機(jī)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程ABI 7300型核酸擴(kuò)增熒光檢測儀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 第十三張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202

6、214 核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施主要的污染源擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)本之間產(chǎn)生的氣溶膠操作人員手衣服第十四張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202215核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施要有獨(dú)立的空氣處理系統(tǒng).各區(qū)始終處于完全分隔的狀態(tài)，不能有空氣的直接相通實(shí)驗(yàn)室保持合理的通風(fēng)對各區(qū)內(nèi)的設(shè)備、物料進(jìn)行標(biāo)示，專區(qū)專用；其他物品不得混用（例如：筆、紙張）空氣：試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴(kuò)增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)試劑陽性對照儲(chǔ)存在標(biāo)本制備區(qū)使用帶濾芯的吸頭 第十五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202216核酸實(shí)驗(yàn)室防污染措施使用外排式的生物安全柜自配試劑應(yīng)分裝成小規(guī)格，未用完的試劑應(yīng)廢棄使用次氯酸鈉溶液

7、消毒（臺(tái)面、地面）使用1mol/L的HCL溶液（吸頭）使用紫外線照射（空氣和臺(tái)面）使用無水乙醇溶液（空氣噴霧）第十六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202217核酸實(shí)驗(yàn)室污染后措施實(shí)驗(yàn)室污染后，如何處理？通風(fēng)次氯酸鈉溶液（擴(kuò)增區(qū)不宜使用）HCL溶液（吸頭）紫外線（固定、移動(dòng)）酒精噴灑（空氣）應(yīng)設(shè)計(jì)有備用實(shí)驗(yàn)室 : 如開設(shè)獨(dú)立的報(bào)告發(fā)放區(qū)作為備用 第十七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202218中心理念：監(jiān)測全程的實(shí)驗(yàn)過程包含病毒核酸提取、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增過程的效率。血篩核酸檢測的內(nèi)標(biāo)的作用內(nèi)標(biāo)的作用質(zhì)控整個(gè)反應(yīng)。提示假陰性檢測結(jié)果。監(jiān)控反應(yīng)的外部條件內(nèi)

8、標(biāo)濃度要合適保持適度的內(nèi)標(biāo)失控.( ChiSq Intercept 1 -4.6852 1.5659 -7.7542 -1.6161 8.95 0.0028log10(Dose) 1 4.8000 1.4699 1.9190 7.6810 10.66 0.0011應(yīng)用SAS9.0軟件PROBIT分析結(jié)果第二十一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202222 Probit Analysis on Dose Probability Dose 95% Fiducial Limits 0.50 9.57017 5.12038 15.55110 0.55 10.63175 6.028

9、69 17.84047 0.60 11.83113 7.02737 20.77334 0.65 13.21316 8.12392 24.64098 0.70 14.84467 9.33581 29.90750 0.75 16.83205 10.69944 37.36963 0.80 19.35973 12.28641 48.54111 0.85 22.78900 14.24179 66.74000 0.90 27.97953 16.90417 101.07479 0.91 29.40116 17.58727 111.93157 0.92 31.02755 18.34915 125.13015

10、0.93 32.91988 19.21204 141.54165 0.94 35.17006 20.20878 162.54851 0.95 37.92474 21.39086 190.49822第二十二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202223第二十三張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202224陽性獻(xiàn)血者的追蹤溝通原則:專業(yè)授權(quán)、人性化、保密、尊敬。溝通方式：電話、面談溝通技巧：表揚(yáng)和鼓勵(lì)、合理解釋、知情、適當(dāng)?shù)膯柡虻诙膹垼琍PT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202225獻(xiàn)血者核酸檢測不合格解釋 由于核酸檢測方法目前尚不能排除假

11、陽性，對實(shí)驗(yàn)過程要求極高，另外乙肝和丙肝病毒進(jìn)入人體后，人體又有清除現(xiàn)象，但血液不能用于臨床，因此核酸檢測不合格血液僅表示該血液不能用于臨床輸血。不作為獻(xiàn)血者健康體檢指標(biāo)。更不宜作為疾病診療指標(biāo)。獻(xiàn)血者獻(xiàn)血權(quán)利仍保留。第二十五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202226關(guān)于核酸檢測的解釋匯集結(jié)果成反應(yīng)性,拆分結(jié)果為陰性.內(nèi)標(biāo)失敗.ELISA(+),核酸結(jié)果為(-)ELISA(-),核酸結(jié)果為(+)核酸單檢結(jié)果反應(yīng)性與血液發(fā)放.化學(xué)發(fā)光法與核酸檢測.第二十六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.2022271.靈敏度：匯集池大小要滿足靈敏度要求。靈敏度太低，

12、病毒低載量獻(xiàn)血者漏檢。HBV DNA 靈敏度宜50拷貝/ml.2.引物是否有效性,能否檢測亞型和突變株感染。3.假陽性，防污染措施（血篩主要要防止RNA酶的污染）。4.核酸提取效率與自動(dòng)化.5.需要規(guī)范化場地和高素質(zhì)的操作人員.6.參加國際間室間質(zhì)控,提高檢測水準(zhǔn).血液核酸篩查注意的問題第二十七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202228深圳血液中心核酸檢測概況對161228人份酶免疫檢測結(jié)果陰性標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測，共檢出33例不相同HBV DNA陽性獻(xiàn)血者，總比率為1：4885。檢出anti-HCV陰性、 HCV RNA陽性1例，定量結(jié)果為1.2105IU/ml。3個(gè)月后

13、追蹤結(jié)果發(fā)現(xiàn)anti-HCV（+），ALT由正常升高至700U/L。 第二十八張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202229項(xiàng)目科華（自動(dòng)化）科華（半自動(dòng)化）美國羅氏上海浩源凱榮（CHIRON）方法學(xué)全自動(dòng)提取+實(shí)時(shí)熒光PCR病毒離心富集+半自動(dòng)提取+實(shí)時(shí)熒光PCR全自動(dòng)提取+ PCR-ELISA半自動(dòng)提取+ PCR+毛細(xì)管電泳分離TMA匯集量 845ul8150ul2445ul5200ul500 ul 單人份檢測數(shù)6849637041315121412514603HBV DNA陽性數(shù)122838HBV陽性比率1：57081：185211：39391：47081：1825深

14、圳血液中心核酸檢測概況第二十九張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202230HBV DNA陽性獻(xiàn)血者追蹤情況 對17位HBV DNA陽性獻(xiàn)血者進(jìn)行了追蹤，9位獻(xiàn)血者發(fā)生血清轉(zhuǎn)換現(xiàn)象。4例呈窗口期特征（或部分），2例獻(xiàn)血者發(fā)現(xiàn)病毒感染后自愈現(xiàn)象1例獻(xiàn)血者原為乙肝大三陽患者，經(jīng)治療后HBsAg轉(zhuǎn)陰后，獻(xiàn)血，常規(guī)檢測為合格，核酸檢測HBV DNA（+），經(jīng)追蹤后HBsAg變?yōu)殛栃缘谌畯?，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202231第三十一張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202232第三十二張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.0

15、8.202233第三十三張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202234第三十四張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202235第三十五張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202236 HBV DNA檢測陽性獻(xiàn)血者追蹤概況追蹤時(shí)間(d)ALT（IU/L）HBsAgHBsAg抗-HBs抗-HBcHBeAg抗-HBeDNA（cp/ml）1(03/10/23)18+21241504528未檢出9126未檢出15631未檢出21429未檢出第三十六張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202237 1號(hào)獻(xiàn)血者在追蹤時(shí)表明曾經(jīng)是大三陽

16、,治療轉(zhuǎn)陰后獻(xiàn)血,被核酸檢出陽性,7天后 HBsAg 檢測(+). 第三十七張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202238第三十八張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.2022391.Pooling by STAR processor2.Virus enrichment by centrfugation3. Extracted by KHB-10004. Amplified and detected by ABI7300第三十九張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.202240第四十張，PPT共四十六頁，創(chuàng)作于2022年6月04.08.2022411.pooling and extraction by STAR LET2. Amplification and detection by ABI7300Automation process第四