ELISA原理、方法及操作細(xì)節(jié).課件

1、ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)主講人：劉 暢 研究生導(dǎo) 師：馬學(xué)恩 教 授第1頁，共32頁。ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）Enzymes linked immunosorbent assay第2頁，共32頁。簡 介1971年，瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann、荷蘭學(xué)者Van Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。ELISA 就是將抗原和抗體的免疫反應(yīng)和酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種新技術(shù)。該技術(shù)應(yīng)用非常廣泛，幾乎所有的可溶性抗原-抗體系統(tǒng)均可用以檢測。第3頁，共32頁。酶和抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體與抗原免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也

2、不影響酶本身的酶學(xué)活性，即在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使基質(zhì)水解而呈色，或使供氫體由無色的還原型變?yōu)橛猩难趸?。這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，也可用分光光度計加以測定。呈色反應(yīng)顯示了酶的存在，從而證明發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。所以，這是一種特異而敏感的技術(shù)，可以在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克，甚至納米水平上對其進(jìn)行定量。第4頁，共32頁?；?本 原 理先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測定時，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。用洗滌的方法分離抗原-抗體復(fù)合物和游離成分。 然后加入酶的

3、作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量。第5頁，共32頁。方 法 類 型酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、間接法、競爭法、捕獲法等。第6頁，共32頁。1，雙抗體夾心法：此法常用于檢測抗原它是利用待測抗原上的兩個抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標(biāo)記抗體B結(jié)合，形成抗體A-待測抗原-酶標(biāo)抗體B復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測抗原含量成正比，屬非競爭性反應(yīng)類型。第7頁，共32頁?？?體 A待測抗原酶標(biāo)抗體包被物第8頁，共32頁。2，間接法測定抗體此法常用于測定抗體將已知抗原連接在固相載體上，待測抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原-待測抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測

4、抗體量成正比，屬非競爭性反應(yīng)類型。第9頁，共32頁?？?原待測抗體酶標(biāo)二抗包被物第10頁，共32頁。3，競 爭 法此法既可用于檢測抗原和半抗原，也可以用于檢測抗體用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測的非標(biāo)記抗原（抗體）競爭性的與固相載體上的限量抗體（抗原）結(jié)合，待測抗原（抗體）多，則形成非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此，顯色程度與待測物含量成反比。第11頁，共32頁。限量的的抗體酶標(biāo)抗原 樣品抗原酶標(biāo)多于樣品顯色程度深樣品多于酶標(biāo)顯色程度淺顯色程度與待測物含量成反比包被物第12頁，共32頁。4，捕獲法（反向間接法）主要用于測定血清中某種抗體亞成分以目前最常用的IgM測定為

5、例，因血清中針對某種抗原的特異性IgM和IgG同時存在，而后者可干擾IgM的測定。因此，先針對IgM的第二抗體(如羊抗人IgM鏈抗體）連接于固相載體，用以“捕獲”樣品中所有IgM；洗滌除去IgG等無關(guān)物質(zhì)，然后加入特異性抗原與待測IgM結(jié)合；再次加入抗原特異的酶標(biāo)抗體；最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加酶底物顯色后，即可對待IgM進(jìn)行定性和定量測定。第13頁，共32頁。針對IgM的第二抗體待測物 其中含有IgM和IgG特異性抗原與IgM結(jié)合酶標(biāo)抗體包被物IgG等無關(guān)物質(zhì)被洗脫第14頁，共32頁。具 體 步 驟 包被 封閉 加待測物 加一抗，二抗 ，或抗原等 顯色第15頁，共32

6、頁。包 被 用包被液稀釋包被抗體至合適濃度，包被酶聯(lián)板（聚乙烯微量反應(yīng)板），每孔100。用保鮮膜包好 ，4過夜。 如急用，包被2h后，清洗也可用，但最好 過夜。 次日棄去孔內(nèi)溶液，并在面巾紙上拍干。 用PBST洗液，洗45次。 每次在洗板機(jī)清洗酶聯(lián)板上震蕩23min后，在面巾紙上拍干后進(jìn)行下一次清洗或下一步。第16頁，共32頁。包 被 液0.05M PH 9.6 磷酸鹽緩沖液Na2CO3 1.59 g ；NaHCO3 2.93g ； 加蒸餾水至1000ml第17頁，共32頁。PBST 洗 液2000ml PBS + 1ml Tween-20PBS：NaCl 8g ； KCl 0.2g ；Na2

7、HPO4 1.42g；KH2PO4 0.27g；加1000ml蒸餾水定容，調(diào)PH至7.4第18頁，共32頁。洗 板 機(jī)第19頁，共32頁。第20頁，共32頁。第21頁，共32頁。封 閉用封閉液封閉，每孔100。 室溫下，在微量振蕩器上，封閉2h。棄去孔內(nèi)溶液，并在面巾紙上拍干。 用PBST洗液，洗45次。（同包被） 用保鮮膜包好，4可保存一個月。第22頁，共32頁。封 閉 液 10 % 小牛血清 （1ml小牛血清加到9ml 1PBS中混勻）。 5%脫脂奶粉（用洗液稀釋）第23頁，共32頁。加標(biāo)準(zhǔn)樣及樣品 待測樣或標(biāo)準(zhǔn)一抗： 用PBST洗液進(jìn)行稀釋到適合濃度，每孔100l，包好保鮮膜。室溫下，在

8、微量振蕩器上孵育2小時。清洗。 二抗： 用PBST洗液進(jìn)行稀釋到適合濃度，每孔100l，包好保鮮膜。室溫下，在微量振蕩器上孵育1小時。清洗。第24頁，共32頁。注 意 抗體抗原反應(yīng)比較快，一般12個小時就達(dá)到峰值。延長反應(yīng)時間容易出現(xiàn)非特異結(jié)合，但反應(yīng)時間不能少于1.5小時。 二抗的使用濃度（一般，1：10000稀釋）應(yīng)當(dāng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，二抗的反應(yīng)時間不能過長，容易出現(xiàn)非特異反應(yīng)。一般，反應(yīng)4060分即可。第25頁，共32頁。OPD 顯 色臨用前取A液5.14ml，B液 4.86ml加入OPD (鄰苯二胺，在-20中保存）0.0040g（約4小片），溶解后加入50l的30%H2O2，配成顯色液

9、。（OPD要充分混勻，否則容易出現(xiàn)個別孔顏色太深） 顯色液每孔100l。避光顯色1520min。 用2molL H2SO4終止反應(yīng)，每孔50l第26頁，共32頁。顯 色 液 A液：0.2mol L Na2HPO4 Na2HPO412H2O 71.7g加水至1000ml B液：0.1 mol L 檸檬酸 檸檬酸 19.2g 檸檬酸，加水至1000ml第27頁，共32頁。結(jié) 果 判 定酶標(biāo)測定儀檢測（429nm），測定OD值：待測孔（P）與對照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者為陽性注意：要有陰性，陽性對照。第28頁，共32頁。第29頁，共32頁。應(yīng) 用ELISA 法由于測定靈敏、特異、操作簡便、酶標(biāo)記試劑比較穩(wěn)定、易于自動化、無反射性污染，且易與其他相關(guān)技術(shù)偶聯(lián)，使其成為目前應(yīng)用最廣泛而且發(fā)展最快的一種免疫測定技術(shù)。市場上符合質(zhì)量要求的商品試劑盒（提供有包裝好的固相載體、酶標(biāo)記物及其底物和洗滌液等全套試劑成分）和自動或半自動檢測儀不斷研究發(fā)明問世，