雞胚培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)

1、第一節(jié)雞胚接種一、雞胚的結(jié)構(gòu)雞胚是正在發(fā)育的活的機體，組織分化程度低，細胞代謝旺盛，適于許多人 類和動物病毒的生長增殖，是常用的病毒分離培養(yǎng)方法之一 （衣原體、立克次體 的分離亦用雞胚）。目前，雞胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、皰疹病毒及腦 炎病毒，尤其在禽類病毒的研究上應(yīng)用較多?？捎糜诓《镜姆蛛x、鑒定，抗原和 疫苗制備，以及病毒性質(zhì)的研究等。雖然隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展， 不少病 毒已不再用雞胚來分離培養(yǎng)，但對某些病毒來說，雞胚仍是一種不可缺少的培養(yǎng) 手段。雞胚培養(yǎng)的優(yōu)點是，來源充足，價格低廉，操作簡單，無需特殊設(shè)備或條 件，易感病毒譜較廣，對接種的病毒不產(chǎn)生抗體等。當然，雞胚培養(yǎng)也有其缺

2、點， 即除痘斑和雞胚死亡是特異性感染指征外， 多需用第二試驗系統(tǒng)來測定病毒存在 與否；非SPF雞胚，亦可能含有對某些家禽病毒的母源抗體，甚至還可能帶有 雞白痢沙門氏菌、霉形體、雞白血病等病毒。因此，用雞胚分離培養(yǎng)病毒時，必 須考慮這些問題。原則上應(yīng)使用非免疫蛋來孵雞胚，最好用 SPF雞胚。一般說來，孵育至8-14天的雞胚最有利于病毒的生長，因為此階段雞胚發(fā) 育日趨完善，各種臟器均已形成，已能經(jīng)受接種物的適當刺激，同時胚胎細胞幼 嫩，骨胳不健全，還未長出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同時也有利于收獲 高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛漸生，已不便感染病 毒，特別是已不利于收獲病

3、毒材料。在操作雞胚時）一定要注意到這一點。孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黃陷入胚胎 腹部，另一部分則仍留在體外，胚胎已發(fā)育成小雞，破殼而出。雞胚的基本結(jié)構(gòu) 如圖，從圖中可以看出，雞胚的最外層為石灰質(zhì)的卵殼，上有氣孔供氣體交換， 卵殼之下為殼膜，很易與卵殼分離，其功能是使氣體分子與胚胎內(nèi)的液體分子在 內(nèi)外進行交換，因此在孵育時需要有一定的濕度和空氣。 如果濕度太低，雞胚就 容易脫水、引起雞胚死亡。氣流不通，雞胚缺氧，同樣會造成雞胚死亡。雞胚的 鈍頭（俗稱“大頭”），是氣室，其功能是呼吸和調(diào)節(jié)胚內(nèi)壓力。殼膜之下為血 管豐富的絨毛尿囊膜，其外層為絨毛膜，系外胚層形成，內(nèi)層為

4、尿囊膜，系內(nèi)胚 層形成，兩膜所夾為中胚層。由于胚胎的肺發(fā)育不完善，此時絨毛尿囊膜代行胚 胎呼吸器官的作用，氣體的交換是在絨毛尿囊膜的血管內(nèi)通過卵殼進行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，內(nèi)含的尿囊液初為透明液體，成分極類似于生理鹽水溶液， 以后則尿酸鹽含量增高。尿囊液量在 11-13日齡時最高，平均達6毫升左右。羊膜是胚胎的最內(nèi)層包被，系外胚層和中胚層形成，羊膜腔內(nèi)含羊水，胚胎 浸于其中，羊水在起初是單純的生理鹽水溶液， 以后蛋白質(zhì)含量增加。羊水量在 8-15日齡時最高，平均約為1毫升左右。附著于胚胎上的是卵黃囊，其膜系由 內(nèi)胚層和中胚層形成，內(nèi)包卵黃，是胚胎發(fā)育的養(yǎng)料。卵的尖端（俗稱“小頭”） 是卵

5、白，是胚胎發(fā)育晚期的養(yǎng)料。干條腔二、雞胚培養(yǎng)實驗用器械不雞胚培養(yǎng)技術(shù)簡便，但一些最基本的設(shè)備仍需具備，它們包括：孵化箱、 檢卵器、卵架、打孔器、銀子、酒精燈、無菌眼科銀子和剪刀、吸頭、洗耳球、 注射器、適用的針頭、無菌試營、平皿、三角瓶、燒杯、消毒膠布、石蠟和滅菌 生理鹽水等。下面就一些最基本的設(shè)備作一簡單介紹：孵化箱是給受精卵提供發(fā)育條件的設(shè)備，要求恒溫恒濕。市售專用孵化箱可 自動進行氣體交換和翻蛋。實驗室中，常用普通恒溫培養(yǎng)箱或恒溫室代替， 要注 意保持室內(nèi)濕度和人工翻蛋。檢卵器 有市售專用檢卵器，在暗室中操作。也可根據(jù)條件向行設(shè)計，用木板 制成一大小為35 X 25.5 X 15厘米的木

6、盒，上半層為一暗室，上方開一小孔， 以便于用眼檢視雞胚，兩側(cè)開大孔以供雙手伸入小暗室轉(zhuǎn)動雞胚蛋和進行標記。 木盒中間有一隔板，其中間部位開一卵形圓孔，木盒下層安裝有100瓦燈泡，待檢胚蛋置于卵形孔上。開燈檢查，不必在暗室中進行。打孔器可用剪刀代替.卵架孵育用盛放雞胚蛋的卵盤有市售專用者，實驗操作中所用卵架可用木 板制成小方盒，上面開一卵形孔。三、雞胚的實驗室孵育選擇實驗室用雞卵，最好用白色薄殼雞蛋，具易于觀察胚胎的生活情況。實 驗用卵一般不宜保存過長時間，通常保存期不應(yīng)超過10天,5天以內(nèi)最好。而且不宜在高溫下保存，通常保存于 420 c，以10 C條件下最好。適宜的 孵育溫度為3839 C

7、,相對濕度為4560 %,并注意空氣流通。孵育3天后 每天應(yīng)翻卵12次，以保證氣體交換均勻，發(fā)育齊全，從而避免半邊發(fā)育現(xiàn)象 的出現(xiàn)。孵后第四天用檢卵器對雞卵進行檢視，檢出未受精卵和死亡的雞胚。經(jīng) 四天孵育后，未受精卵不見有雞胚跡象，僅見模糊的卵黃暗影；受精卵則可見清 晰的血管小團，其中有雞胚跡象，較大的雞胚可見到胚胎主動運動；瀕死或死亡的雞胚則見到胚胎運動呆滯或不運動， 血管昏暗、折斷或漂落，這種雞胚應(yīng)剔 出不用。四、雞胚的接種.絨毛尿囊膜接種主要用于痘病毒和皰疹病毒的分離和增殖，這些病毒可在雞胚絨毛尿囊膜上 形成痘斑和病斑。此外其它用于絨毛尿囊腔接種的病毒也可使用，而且收毒量更 高，缺點是操

8、作不易成功。選取10-13日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出，并在胚位附近無大 血管處，劃一記號，用蛋鉆在卵殼上磨一裂縫（或用電烙器在卵殼上烙出一個直 徑為2-3mm的烤焦圈），小心將蛋殼去掉，注意切勿損傷殼膜；在氣室中央也鉆 一個小口，用針尖挑破殼膜，切勿損傷其下的絨毛尿囊膜，滴加1滴無菌生理鹽 水于刺破處，用吸耳球緊貼氣室中央小口，造成負壓，即可見生理鹽水下沉，絨 毛尿囊膜凹下，和殼膜分開，造成人工氣室。滴加 0.05-0.1ml接種物于絨毛尿 囊膜上，臘封口，封口部位朝上，不要翻動，37c培養(yǎng)。.尿囊腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒，例如禽流感病毒和新城疫病毒的分離和增 殖，馬腦炎病

9、毒也常用、 舊D、舊DV也可。選取9 -11日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出，在氣室邊緣上打一 小口，避開大血管處，注射器沿小口插入1-1.5cm,注入接種物0.1-0.2ml ,臘封口。.卵黃囊接種主要用于蟲媒批膜病毒以及鸚鵡熱衣原體和立克次氏體的分離和增殖。選取6- 8日齡的雞胚，照檢后，將氣室及胚胎位劃出；垂直放置在卵座上，在 氣室中央鉆一個小口，注射器沿小口插入 3 cm,注入接種物0. 1-0.5ml ，臘封 口。.羊膜腔接種主要用于正粘病毒和副粘病毒的分離和增殖，操作技術(shù)比較困難。A.開窗法：從氣室處去蛋殼開窗，從窗口用小銀子剝開蛋膜，一手用平頭鑲 子夾住羊腹腔向上提，另一手

10、注射 0.05-0.1ml接種物于腔內(nèi)，使蛋直立孵化， 此法可靠，但胚胎易受傷而死，而且易污染。B.盲刺法：將雞胚放在燈光向上照射的蛋座上，使蛋轉(zhuǎn)動使胚胎面向術(shù)者。 在氣室頂部到邊緣的一半處打一孔，用40mmfc的針頭垂直插入，月深30mmz上。 如已刺如羊膜腔，能使針頭撥動胚即可注入接種物 0.1-0.2ml ,如針頭左右移動 時胚胎隨著移動，則針頭已刺入胚胎，這時應(yīng)將針頭稍提起后再注射，石蠟封口。五.雞胚材料的收獲原則上接種什么部位，收獲什么部位。(1)絨毛尿囊膜：用碘酊、酒精消毒接種部位及四周，揭去封閉處的卵殼。用滅菌銀子擴大開口處，輕輕夾起絨毛尿囊膜，用消毒剪刀剪下接種面及周圍的膜，

11、置于滅菌生理鹽水的平皿中。(2)尿囊腔接種：收獲前將雞胚置 4c冰箱中6h或過夜將雞胚凍死而使血液凝 周，以免收獲時流血。用碘酊、酒精消毒氣室部位卵殼，以無菌銀子擊破氣室端 卵殼，沿氣室周圍剪去卵殼，撕去殼膜和絨毛尿囊膜，用銀子輕輕壓住胚胎，以 無菌吸管或注射器吸取尿囊液于滅菌試管內(nèi)。 收集的液體應(yīng)清亮，渾濁則表明有細菌 污染；呈血紅色，說明血管破裂；黃色液體，可能卵黃囊被刺破。應(yīng)做無菌檢驗。(3)羊膜腔：首先收取尿囊液，方法同上。后用注射器插入羊膜腔內(nèi)收集，約 可收到1ml液體，無菌檢測。(4)卵黃囊：先首先收取尿囊液和羊腹腔液，后用吸管吸卵黃液。將整個內(nèi)容 物傾入無菌平皿中，剪取卵黃膜保存

12、。第二節(jié)細胞培養(yǎng)常用設(shè)備準備室的設(shè)備：單蒸儲水蒸儲器、雙蒸儲水蒸儲器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品）、儲品規(guī)（放置消毒過的物品）、包裝臺。配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配 置溶液室攪拌溶液）。培養(yǎng)室的設(shè)備：液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80 C）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。必須放在無菌間的設(shè) 備：離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO0俘箱（孵育培養(yǎng)物）、 水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4c冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。無菌操作無菌室的滅菌：.定期打掃無菌室

13、：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等， 然后用3%來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5 %過氧乙酸擦拭。.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3%新潔爾滅擦拭，然后用75%酒精擦拭或者0.5 %過氧乙酸，再用紫外燈照射.實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘.實驗后滅菌：用75%酒精（3%新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的 載物臺。實驗人員的無菌準備：.肥皂洗手?？蓽p少手上的微生物。.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋。但是在潔凈工作臺上時就無需上 述防護。如果你有長頭發(fā)，則應(yīng)把它系在腦后。不要說話或少說話。如果感冒， 則最好不要做組織培養(yǎng)工作。.用75

14、%酒精棉球擦凈雙手。無菌操作的演示：.凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75%酒 精擦拭瓶子的外表面.靠近酒精燈火焰操作。.器皿使用前必須過火滅菌.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒一、新的玻璃器皿的洗消：.自來水刷洗，除去灰塵。.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5%稀鹽酸中12小時以除去臟物、 鉛、種等物。.刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈 后用烤箱烘干。.

15、泡酸、清洗：用清潔液（重銘酸鉀 120g：濃硫酸200ml:蒸儲水1000ml）浸 泡12小時，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗 15次，最后蒸儲水沖洗3-5 次和用雙蒸水過3次。.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，當蒸氣 成直線上升時，關(guān)閉安全閥，當指針指向 15磅時，維持20-30分鐘。.高壓消毒后烘干二、舊的玻璃器皿的洗消：.刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過 來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。.泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時后從酸缸內(nèi)

16、撈出器皿立即用 自來水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸儲水沖洗3次。.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消 毒儲存及防止灰塵和再次被污染。.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當蒸氣成直線冒出3-5分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓 表指數(shù)隨之上升，當指針指向15磅時，調(diào)節(jié)電開關(guān)維持20-30分鐘即可。（玻璃 培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）.烘干備用：因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。 金屬器械洗消：金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后 用75

17、%酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸儲水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放 入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。 橡膠和塑料：橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸儲水沖 干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進行如下的處理程序：.針式濾器帽不能泡酸液，用NaO的6-12小時，或者煮沸20分鐘，在包裝之前 要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上（凹向上），然后將螺旋稍微擰松一些， 放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺內(nèi)取出使 用時應(yīng)該立即將螺旋旋緊。.膠塞烘干后用2%氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30

18、分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液 30分鐘，再用自來水，蒸儲水， 三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。.膠帽，離心管帽烘干后只能在2%氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時（切記時間 不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液 30分鐘，再用自來水，蒸儲 水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。.膠頭可用75%酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。.塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用 70%酒精 浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。 也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒

19、后需要用2-3周時間洗除殘留的氧化乙烯。 用20000- 100000rad的r射線消毒塑料制品效果最好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆， 可在紙包裝后，用密寫墨水作好標 記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水， 在包裝紙上作一記號，平時這種墨水 不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配 制：氯化鉆（CoC126H2o）2g, 30%鹽酸10ml,蒸儲水88m1 注意事項：.嚴格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸儲水，以防高 壓時燒干，水不能過多因為其將使空氣流暢受阻， 會降低高壓消毒效果。檢查安 全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。.安裝濾膜時

20、注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過 濾的作用。.注意人體的防護和器皿的完全浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷 害人體。B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時防止酸液濺到地面， 會腐蝕地面。C.器皿浸入酸 液中要完全，不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。細胞培養(yǎng)用液的配制與消毒器材與試劑：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素.純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計、 磁力攪拌器。具體步驟：. 水的制備：細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、 三蒸水或純凈水.PBS的制備與消毒（也可用于其它BSS如：Hanks, D-Hanks液的配制）：.溶解定容：將藥品（

21、NaCl 8.0g, KCl 0.2g , Na2HPO4 H2O 1.56g, KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量 瓶中準確定容至1000ml,搖勻即成新配制的PBS容液。.移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插 上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸儲水補充蒸 發(fā)掉的水份。.胰蛋白酶溶液的配制與消毒：胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。不同的組織或 者細胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用 時間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37c時，胰

22、酶溶液的作用能力最強。使用胰酶 時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含 Ca2卡Mg2+ 的BSS如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終 止胰酶對細胞的作用。.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25%,用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。 攪拌混勻，置于4c內(nèi)過夜。.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20 C保存以備使用

23、。.青、鏈霉素溶液的配制于消毒.所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。.具體操作均在超凈臺內(nèi)完成。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙 蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。.使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位=1微克？ 五.RPMI1640的制備與消毒：.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積 2/3的雙蒸水中，并用 雙蒸水沖洗包裝袋2-3次（沖洗液一并加入培養(yǎng)基中），充分攪拌至粉劑全部溶解， 并按照包裝說明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉 素液各0.5ml,使青鏈霉

24、素的濃度最終各為 100單位/ml。然后用一個當量的鹽 酸和NaOHS PH到7.2左右。最后定容至1000ml,搖勻。.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和 支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。.分裝：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4c冰箱內(nèi)待用。.使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4c時兩周有效）。六.血清的滅火：細胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56c水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。.HEPES容液：HEPES勺化學(xué)全稱位

25、羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N -a-hydroxythylpiperazine-N - ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長 時間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L, 一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES|3可達至IJ緩沖能力。1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：準確稱取HEPTS 238.3g,加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌，分裝后4c保 存。注意：因為現(xiàn)在市售HEPESfel勺10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實際情況靈活配制， 但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES勺終濃度仍然為20mmol/L。如：稱取4.766克HEP

26、ES 溶于20ml三蒸水中，過濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml 培養(yǎng)液中加入2ml即可。.谷氨酰胺：合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺， 其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合 成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4 c下放置1周可分解50%,故應(yīng)單獨配制，置于-20 C冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。 加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4c冰箱中儲存2周以上時，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰 胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為 14mmol/L?？梢耘渲?00mmol/L谷氨酰胺液 貯存，用時加入培

27、養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺 2.922g溶于三蒸水加至100ml 即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶，-20 C保存， 使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。.肝素溶液的配制：含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml 0因為現(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為 0.56克/瓶，配制時，可將 其溶于100ml三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為 -C。使用時，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml （精確可加入0.9ml）即可。十.I型膠原酶：0.1 % I型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注

28、意：因為I型膠原酶 分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入 10ml 小瓶-20 C保存。十一.明膠溶液：因為明膠難于過濾，所以配制0.1 %明膠溶液必須用無菌的PBS配制。所以制備 過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量 0.1克（配成100ml 溶液）一即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中，4c保存。其他培養(yǎng)用液的配制：20ug/ml內(nèi)皮生長因子，注意事項：.配制溶液時必須用新鮮的蒸儲水。.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑 0.45微米和0.22微米濾膜各一張，放置位置

29、 為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。.配制RPMI164g養(yǎng)基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了 保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2 ,可在配制時調(diào)PH至7.4。細胞傳代培養(yǎng)（消化法）具體操作：一.傳代前準備：.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37 c水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。.用75%酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。.準備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)

30、預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方 能放入超凈臺內(nèi)。.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯 微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。.打開瓶口：將各瓶口打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。.胰蛋白酶消化；.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用 PBS青洗（沖洗），加入適量消化液 （胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37Co.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質(zhì)回縮，細胞之 間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的 培養(yǎng)減。.吹打分散細胞：.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細胞吹打成細胞懸液

31、。.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入 10ml離心管中。.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入 2ml培養(yǎng)液，用滴管輕 輕吹打細胞制成細胞懸液。.分裝稀釋細胞：.分裝：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊 瓶蓋。.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數(shù)。注意密 度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應(yīng)該不低于 5X 105/ml 0最后要 做好標記。.繼續(xù)培養(yǎng)：用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO加養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面

32、積占培養(yǎng)瓶底面積 25% 時為一個十,占50%為+ + ,占75%時為+ + +。傳代細胞培養(yǎng)注意事項：.嚴格的無菌操作.適度消化：消化的時間受消化液的種類、 配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量 等諸多因素的影響，消化過程中應(yīng)該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質(zhì)回縮， 連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。附：EDTA（0.02 %乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：EDTA0.20g , NaCl 8.00g , KCl 0.20g , KH2PO40.02g , 葡萄糖 2.00g , 0.5 % 酚紅4ml,加入蒸儲水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時調(diào)節(jié) PH 到7.4。注

33、意EDTA不能被血清中和，使用后培養(yǎng)瓶要徹底清洗，否則再培養(yǎng)時 細胞容易脫壁.細胞的復(fù)蘇細胞復(fù)蘇的原則快速融化：必須將凍存在-196 C液氮中的細胞快速融化至37 C,使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。具體操作 一.實驗前準備：.將水浴鍋預(yù)熱至37 C.用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。.取出凍存管：.根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。.迅速解凍：.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并

34、要不斷的搖動， 使管中的液體迅速融化。.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外 壁，再拿入超凈臺內(nèi)。.平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機中 3000r/min離心3min.制備細胞懸液：.吸棄上清液。.向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。.細胞計數(shù)：細胞濃度以5X105/ml為宜。.培養(yǎng)細胞將復(fù)合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37 C和5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的 時間由細胞情況而定。初學(xué)者易犯錯誤：1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37 C。.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時間

35、延長。.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機損壞和細胞丟失。.一次復(fù)蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導(dǎo)致細胞交叉污染。細胞計數(shù)實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時， 通過測定一定體積懸液中的細胞 的數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。具體操作：一.準備工作：取一瓶傳代的細胞，按照傳代細胞培養(yǎng)（消化法）中的傳代方法繁 殖細胞，待長成單層后以被使用。.細胞懸液制備：細胞懸液的制備方法是用0.25 %的胰蛋白酶液消化、PBS1洗滌后，加入培養(yǎng)液 （或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測細胞懸液。.細胞計數(shù)：1.蓋好蓋玻片：取一套血球計數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數(shù)槽上。.制備計數(shù)

36、用的細胞懸液：用吸管吸 5滴細胞懸液到一離心管中，加入 5 滴臺盼藍染液（0.4%）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯 微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。.將細胞懸液滴入計數(shù)板：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿 蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓 懸液流入旁邊槽中。.統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并 移動計數(shù)板，當看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個大銘（每個大格含有 16個中銘）中沒有被染液染上色的細胞數(shù)目。.計算原細胞懸液的細胞數(shù)：按照下面公式計算細胞密度：（細胞懸液的細胞數(shù)）/ml =（四個大格子細胞數(shù)/4

37、） X2X104說明：公式中除以4因為計數(shù)了 4個大格的細胞數(shù)。公式中乘以2因為細胞懸液于染液是1: 1稀釋。公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：四.細胞計數(shù)要點：.進行細胞計數(shù)時，要求懸液中細胞數(shù)目不低于104個/ml ,如果細胞數(shù)目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；.要求細胞懸液中的細胞分散良好，否則影響計數(shù)準確性。.取樣計數(shù)前，應(yīng)充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數(shù)時更要注意每 次取樣都要混勻，以求計數(shù)準確；.數(shù)細胞的原則是只數(shù)完整的細胞，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞 計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。.操作時，注意蓋片下不能有氣泡，

38、也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要 重新計數(shù)。.初學(xué)者易犯的錯誤：.計數(shù)前未將待測懸液吹打均勻。.滴入細胞懸液時蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。.滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。.本實驗特殊試劑的配制：4%臺盼藍母液：稱取4克臺盼藍，加入少量蒸儲水研磨，加雙蒸水至100毫升, 用濾紙過濾，4c保存。使用液：使用時，用PBS稀釋母液至0.4 %即可。細胞的凍存.先將凍存管放入4 c冰箱，約40min。.接著置于-20 C冰箱，約30-60min。.置于-80超低溫冰箱中放置過夜。.置于液氮罐中長期保存。5同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。注意事項：.使用DMSOf,不需要進

39、行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而 會破華它的分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍保護效果。在常溫下，DMS財人體有害，故在配制時最好戴上手套操作。.不宜將凍存細胞放置在 0c-60 C這一溫度范圍內(nèi)過久，低溫損傷主要發(fā)生 在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險溫區(qū)”。.注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時添加。雞胚原代細胞培養(yǎng)（雞胚成纖維細胞的制作）取9-11日齡的雞胚，將胚蛋氣管端向上，用碘酊、酒精消毒氣室，以銀子擊碎 卵殼并棄之，沿氣室周圍剪去卵殼，撕去殼膜和絨毛尿囊膜，取出胚胎于滅菌平 皿中。剪去頭部、翅爪及內(nèi)臟，以Hanks液沖洗體表數(shù)次，移入滅菌小瓶中，在 用剪刀剪成小塊，使其成為約1mm狄小的碎塊

40、，以Hanks液沖洗體表數(shù)次；自 水浴中取出預(yù)熱的0.25%夷酶適量，一個雞胚約需5ml胰酶，37C水浴消化15-20 分鐘，其間每5分鐘輕搖一次，至液體變得混而稍稠，此時再輕搖可見組織塊懸 浮在液體內(nèi)而不易下降時則終止消化，吸棄胰酶，再以Hanks液沖洗三次，經(jīng)大 口吸管吹打分散，以少許營養(yǎng)液（DMEM?養(yǎng)液、10%賣牛血清、青鏈霉素500U/ml, PH7.2-7.4 ）輕輕懸浮，經(jīng)8層紗布過率，收集的細胞經(jīng)計數(shù)調(diào)整細胞濃度至 106 個/ml ,混勻，分裝于細胞培養(yǎng)瓶中，于 CO邪養(yǎng)多!中37c培養(yǎng)24h-48h。長成 單層的細胞換液，加入維持液：DMEM?養(yǎng)液、5%賣牛血清、青鏈霉素5

41、00U/ml, PH7.2第三章電子顯微鏡技術(shù)觀察病毒（2學(xué)時）教學(xué)目的：熟悉掌握病毒的電子顯微鏡觀察技術(shù)。教學(xué)重點：樣品的基本制備技術(shù)。教學(xué)難點：病毒電鏡樣品的制備?；窘虒W(xué)內(nèi)容：第一節(jié)電子顯微鏡技術(shù)概述一.電子顯微鏡的發(fā)展光學(xué)顯微鏡發(fā)明后，即成為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和其他學(xué)科不可缺少的研究工具。 可以 看到許多微生物和構(gòu)成生物的基本單元一細胞。但隨著人類認識的逐步深化，對 觀察微小物體的要求越來越高。大型電子顯微鏡20100萬倍0.1440.34nm中型電子顯微鏡520萬倍0.341.0nm小型電子顯微鏡5萬倍以下1.0nm以上 二.電子顯微鏡的分類1.透射電子顯微鏡2掃描電子顯微鏡其主要特點是景

42、深大，圖像富有立體感，制樣簡便，在觀察形貌的同時，還可以 利用樣品發(fā)出的其他信息在微小區(qū)域上作成份分析和晶體結(jié)構(gòu)分析。第二節(jié)電鏡樣品的基本制備技術(shù)一.超薄切片超薄切片法是研究病毒特征以及病毒與細胞之間相互作用的有效手段。a.將組織或細胞樣品，加入2.5% PH7.2戊二醛進行前固定，4c 24小時；b.用PH7.2PBS?中洗三次,每次10分鐘；c.用2剛氧化餓在通風(fēng)櫥內(nèi)進行后固定1.5-2小時；d.用PH7.2PBS?中洗三次,每次10分鐘；e.分別用濃度為50% 70% 80% 90% 100%勺乙醇進行月中K,每次10-15分鐘, 100%L醇中脫水三次，其它濃度中各一次；f.用1: 1

43、的100%醇和丙酮、純丙酮各置換一次，每次 10分鐘；g.用純丙酮和環(huán)氧樹脂包埋劑按濃度梯度對樣品進行浸透；h.將樣品置于恒溫培養(yǎng)箱中聚合；i.用ULTRACDTE超薄切片機進行切片，將切片用載網(wǎng)撈起，放入培養(yǎng)皿中；j.用醛酸雙氧鋁、檸檬酸鉛分別對樣品染色15-20分鐘，雙蒸水沖洗干燥后放入 培養(yǎng)皿中待檢。二.負染色負染色也叫陰性反差染色。這種染色法是用重金屬鹽類溶液與樣品混合而使樣品 呈現(xiàn)出良好的反差。經(jīng)這種方法染色的生物樣品，在電鏡下是暗背景下的亮物體 像，與通常的染色性質(zhì)相反，所以稱之為負染色。負染色的主要特點是反差強，分辨力高，可以看到病毒的亞單位結(jié)構(gòu)；在較段時 間內(nèi)可得出結(jié)果。負染色

44、使用的染液有磷鴇酸、磷鋁酸、醋酸鈾等。最常用的是：PH6.8的2%磷鴇酸溶液適用于多種病毒。被觀察的材料最好是比較純凈的病毒懸液。三.掃描電鏡樣品的制備掃描電鏡具有分辨率高和景深長等特點，因此圖像層次豐富，立體感強，能夠顯示 細胞和組織的三維結(jié)構(gòu)形貌，廣泛應(yīng)用于生物樣品表面及其斷面微結(jié)構(gòu)的觀察. 四.免疫電鏡免疫電鏡技術(shù)是把免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)有機地結(jié)合起來 ，使之兼有兩方面的 特性，所以是研究抗原-抗體相互作用的一種方法.抗原-抗體之間的相互作用是 免疫化學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)，它具有高度的特異性，結(jié)合電鏡的高分辨能力和放大本領(lǐng)， 可在超微結(jié)構(gòu)和分子水平研究各種組織和細胞內(nèi)的免疫反應(yīng)，并能精確定性、

45、定位和半定量，使形態(tài)與機能緊密結(jié)合。第四章 病毒和病毒成分的提純(2學(xué)時)教學(xué)目的：熟悉掌握病毒和病毒成分的提純。教學(xué)重點：病毒提純的具體操作方法。教學(xué)難點：超速離心法提純病毒的原理和方法?；窘虒W(xué)內(nèi)容： 第一節(jié)病毒的提純病毒的提純，就是應(yīng)用各種物理、化學(xué)方法，以不使病毒受損傷和失活為前提, 去除宿主細胞組分等非病毒雜質(zhì)，提取出高純度濃度的病毒樣品。病毒的純度只是一個相對的概念，通常以下列幾點作為判定依據(jù)。(1)物理均一性(2)病毒滴度與蛋白質(zhì)含量的比例(3)免疫學(xué)反應(yīng)(4)結(jié)晶形成一.沉淀法.中性鹽沉淀法病毒一般在45%Z上飽和度的硫酸錢溶液中沉淀，保持其感染性。.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇(P

46、EG為水溶性非離子型聚合物，具有各種不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量為20006000的PEG將PEGS已置成50流右的溶液，或直接將固體PEGta于病毒懸液中，使其達到所需濃度，通常在 4c攪拌過夜，然后 離心使病毒沉淀。3有機溶劑沉淀法4等電點沉淀法二.層析法.葡聚糖柱層析法.凝膠層析法.離子交換纖維素柱層析法.親和層析法.紅細胞吸附法所謂病毒的紅細胞凝集反應(yīng)，就是指病毒被紅細胞表面粘蛋白吸附的現(xiàn)象。.電泳法.超速離心法病毒經(jīng)初步濃縮之后，要進一步純化，通常采用超速離心法.差速離心法差速離心法適用于從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或經(jīng)過紅細胞吸附-釋放的病毒懸 液中提純病毒。以差速離心法分

47、離提純病毒時，經(jīng)常以低速（20003000rpm 20-30分鐘） 及中速（10000rpm, 20-30分鐘）去除較大的宿主細胞碎片、污染的細菌及其他 較大的雜質(zhì)。然后，選擇在60分鐘內(nèi)能夠沉淀80犯上的病毒粒子的較高速度， 離心1-2小時，使病毒沉淀。對中、大型病毒如流行性感冒病毒，在經(jīng)紅細胞吸 附一稀釋后，于25000rpm,離心60分鐘，即可達到目的。小型病毒如脊髓灰質(zhì) 炎、披膜病毒，則需以 35000-45000rpm離心1-2小時。.速度區(qū)帶離心法是根據(jù)被分離物質(zhì)在強大離心力中沉降速度不同而進行的分離方法。介質(zhì)可以為均一密度，也可以梯度密度。當被分離的物質(zhì)沉降到與介質(zhì)密度相等的區(qū)域

48、是就 不再沉降。不同分子形成不同的區(qū)帶，稱為速度區(qū)帶。常用的介質(zhì)為蔗糖、甘油、 聚蔗糖。常用的梯度范圍從 5%-20% 10%-60%.平衡密度梯度離心法大多數(shù)病毒的浮密度在1.10-1.40范圍內(nèi)；所制備密度范圍為1.0-1.7的懸浮介 質(zhì)，便可滿足大多數(shù)病毒密度梯度離心的需要。六.超濾法利用超濾膜將水、鹽及小分子濾過，將一定大小的大分子或病毒等顆粒截住從而使后者得到濃縮的一種方法。第二節(jié) 病毒蛋白亞單位的分離第三節(jié)病毒核酸的抽提第五章病毒的常規(guī)實驗室診斷（4學(xué)時）教學(xué)目的：熟悉掌握病毒的常規(guī)實驗室診斷方法。教學(xué)重點：病毒的血清學(xué)診斷。教學(xué)難點：病毒感染力的滴定和中和實驗。基本教學(xué)內(nèi)容：第一

49、節(jié)病毒的初步鑒定.病毒增殖的判定病毒在實驗動物體、雞胚和組織培養(yǎng)細胞內(nèi)增殖，顯然都會影響機體和細胞和生命活動，并經(jīng)常通過一定的形態(tài)學(xué)和病理學(xué)變化表現(xiàn)出來。a.細胞病變（CPE細胞病變是病毒在細胞內(nèi)增殖內(nèi)增殖及其對細胞產(chǎn)生損害的最明顯的表現(xiàn)，包括胞漿的顆粒變性、胞核的變形和破裂。細胞病變經(jīng)常具有病毒“種”的特性，可以作為病毒鑒定的依據(jù)之一。b.細胞代謝的測定PH值下降c.抗原的測定d.病毒間的干擾現(xiàn)象.病毒感染力的滴定實驗動物測定LD50（半數(shù)致死量）雞胚上的EID50 （半數(shù)雞胚感染量）組織細胞上測定TCID50 （半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量）I.Reed-Muench 法病母淞 稀釋度細胞管觀察結(jié)

50、果累計細胞管樹三細胞管總數(shù)出現(xiàn)CPEffi胞 管所占的出現(xiàn)CPE管不出現(xiàn)CP 管三出現(xiàn)CPE管不出現(xiàn)CP 管10-1802710127F 100 (27/27)10-28019019100 (19/19)10-3711111291.6 (11/12)10-435461040 (4/10)10-517113140.7 (1/14)10-608021210(0/21)出現(xiàn)細胞病變（CPE以及血凝素等的細胞管數(shù)分別列于表 14-2的第2和第 3歹I，它們的累計數(shù)分別列于第 4和第5列（根據(jù)箭頭所示方向），第6列為細 胞管總數(shù)，第7列為出現(xiàn)細胞病變的細胞管數(shù)占細胞管總數(shù)的百分率?？梢娫摬《局甑腡CID

51、。在10-3 （91.6%）和10-4 （40%之間，其確切稀釋倍數(shù)可按下列公 式計算：91.6 （高于50%勺百分數(shù)）一5041.6 91.6 （高于50%勺百分數(shù)）一40 （低于50%勺百分數(shù)）5160.8將由上式獲得的0.8加在高于50%E亡的稀釋度的對數(shù)（3）上，因此該病 毒的TCID5。應(yīng)是0.1ml 10-3.8稀釋的病毒液。查反對數(shù)，得 6310,即該病毒6310 倍稀釋液0.1ml等于1個TCID50O3.病毒理化特性的測定a.病毒核酸型鑒定是DNAW毒，還是 RNAW毒？b.脂溶性敏感性試驗（1）乙醴敏感性試驗（2）氯仿敏感性試驗c.耐酸性試驗d.胰蛋白酶敏感試驗e.耐熱性試

52、驗f.病毒粒子大小測定第二節(jié)病毒的免疫-血清學(xué)檢測1.中和試驗中和抗體：動物在受到病毒感染后，體內(nèi)產(chǎn)生抗體，如果該抗體能與相應(yīng)的病毒 粒子特意性地結(jié)合，使后者喪失感染力，這種抗體稱為中和抗體。中和抗體一般是針對病毒的蛋白衣殼或囊膜抗原的，并不是針對病毒粒子的內(nèi)部成分。應(yīng)用已知的病毒或病毒抗原，可以測知患病動物體內(nèi)中和抗體的存在及其 效價。應(yīng)用已知的抗病毒血清或中和性單克隆抗體，也可以進行病毒的鑒定，因此中和試驗也常用于新分離病毒株的鑒定。中和試驗具有高度的敏感性和免疫特意性， 常可用以偵察其他血清學(xué)反應(yīng)難以測出的病毒株之間的抗原差異。進行中和試驗，首先要選擇試驗宿主。（1）終點法中和試驗有固定

53、病毒一稀釋血清法和固定血清一稀釋病毒法a.固定病毒一稀釋血清法：將不同稀釋度的血清與固定量的病毒液（一般 100個TCID5。EID50、LD5。混合，置適當?shù)臈l件下感作一定時間以后，再將血清-病毒混合物接種于敏感細胞、雞胚或?qū)嶒瀯游铮瑴y定被檢血清阻止組織培養(yǎng)細 胞、雞胚或?qū)嶒瀯游锇l(fā)生病毒感染的能力及其效價。以能保護50%&織培養(yǎng)細胞、 雞胚或?qū)嶒瀯游锊话l(fā)生病變、感染或死亡的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的 50刈和效價。病毒稀釋-血清-感作一對照一接種一觀察和解釋一b.蝕斑減數(shù)試驗蝕斑：用稀釋的病毒液感染單層細胞，由于其致細胞病變作用，而在單層細胞上 形成蝕斑。從理論上講，一個病毒粒子形成一個

54、蝕斑，因此根據(jù)蝕斑的大小、形 狀和色澤等性狀，選擇不同的代表進行移植傳代，就有可能獲得若干不同的純系 毒株。但在實際上，一個蝕斑往往由幾十個乃至幾百個病毒粒子形成。因此，由 一個蝕斑分離獲得的毒株常是許多個病毒的后代，需要進行反復(fù)多次的蝕斑分 離，才有可能獲得來源一個病毒粒子的“純系”病毒。病毒+正常動物血清蝕斑數(shù)（平均）待檢血清稀釋+病毒 中和后蝕斑數(shù)（平均） 能使病毒蝕斑減少50%勺血清稀釋度。c.交叉保護試驗2,血凝和血凝抑制實驗病毒+紅細胞一凝集血凝的條件和特點：1822c最適宜操作方法：1,取血凝板，做好標記.2,按表1順序和劑量加入各種材料表1.紅細胞凝集試驗的操作程序單位：ul病

55、毒稀 1:21 1:22 1:2 3 1:24 1:2 5 1:26 1:2 7 1:2 8 1:2 9 1:210 1:211 對釋度照生理鹽水25252252525252525252525棄25 251%紅細胞252525252525252525252525.搖勻，放室溫30min,觀察結(jié)果。.結(jié)果判定操作方法：1,取血凝板作好標記2,按表4的順序和劑量加入各種材料:表 4: 紅細胞凝集抑制試驗的操作順序單位：ul血清稀釋度 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:2 8 1:2 9 血清病毒血球?qū)φ諏φ諏φ丈睇}水抗血清病毒液25252525252525

56、2525棄25252525252525252525252550251%1細胞252525252525252525252525.搖勻，置室溫45min,觀察結(jié)果。.結(jié)果判斷.瓊脂擴散實驗應(yīng)用病毒瓊擴標準陽性血清通過瓊脂免疫擴散試驗對本試驗所分離到的病毒進行鑒定，具體操作過程如下：用 0.85%NaCL溶液配制含1%脂糖的凝膠溶液， 加熱待瓊脂糖完全溶解后注入平皿中，凝固后置于4c冰箱2h后，取出打孔，剔除孔內(nèi)的瓊脂，用酒精燈加熱封底，中央孔為病毒瓊擴標準陽性血清， 周圍留 一孔為陽性對照，其余孔為經(jīng)初步提純的病毒懸液。.免疫熒光實驗將-70 C保存的一份感染臟器冰凍切片成 4pm置于載玻片上，用

57、丙酮固定，室 溫5分鐘，用0.01M pH7.2的PBSa滌3次，每次5分鐘，晾干后加入相應(yīng)的陽 性血清（1:16稀釋）37c作用45分鐘。用PBS?中洗3次，每次5分鐘，晾干后 加入含0.01%伊文思藍的熒光標記的兔抗雞IgG （, 37c作用45分鐘，PBS沖 洗3次，每次5分鐘。晾干后用緩沖甘油封片，用OLPMPU光顯微鏡觀察和拍 照。同時設(shè)立陽性對照、陰性對照、熒光抗體對照第六章病毒的分子生物學(xué)診斷（4學(xué)時）教學(xué)目的：熟悉掌握病毒的分子生物學(xué)診斷方法。教學(xué)重點：病毒核酸的提取和 PCR技術(shù)。教學(xué)難點：PCRfc術(shù)?；窘虒W(xué)內(nèi)容：概述近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，尤其是分子遺傳學(xué)

58、的進步，大大 提高了病毒病的診斷水平o病毒病的實驗室診斷技術(shù)已從常規(guī)的病毒分離鑒定以 及抗原和抗體的免疫學(xué)檢測，進入可對病毒基因序列和結(jié)構(gòu)直接進行測定的分子 生物學(xué)水平。病毒病的分子生物學(xué)診斷，包括對病毒核酸（DNAl RNA和蛋白等的測定，關(guān)鍵在于測定這些分子的特異性序列或結(jié)構(gòu)。病毒基因往往含有特異 序列，可以用核酸雜交的方法予以檢出，而這段序列的存在則說明了相應(yīng)病毒的 存在。雖然病毒是嚴格細胞內(nèi)寄生的最小、 最簡單的生命形式，但也具有與宿主細 胞不同的獨特的核酸序列和基因結(jié)構(gòu)。常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)包括基因組電 泳分析、DNAR切圖譜分析、寡核甘酸指紋圖、核酸雜交、聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR

59、 等。其中核酸雜交和PC叱術(shù)又以其特異、快速、敏感、適于早期和大量樣品的 檢測等優(yōu)點，成為當今病毒病診斷中最具有應(yīng)用價值的方法。DN麻交的靈敏度已經(jīng)提高到0.05pg/ul ,也就是說，只要有1000個DN砌貝，就可能被檢測出 來。使用PCRS至可以檢測出一個拷貝的 DN6子。第一節(jié)病毒核酸的提取技術(shù)懸浮培養(yǎng)的細胞或組織單細胞懸液的裂解a）于4c以2000g離心5分鐘收集細胞，以10倍體積用冰預(yù)冷的無鈣鎂離子磷 酸緩沖液懸沉淀，洗滌細胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細胞沉淀，使其徹底分散。b）估計細胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNNS取緩沖液重懸之。c）加入與步驟b）所加RNA提取緩

60、沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器 迅速混勻。用裝有21號針頭的皮下注射器抽吸細胞裂解物，再將其注入聚丙烯 管內(nèi)。重復(fù)3 4次，剪切DNAd）加蛋白酶K至終濃度為200仙g/ml,充分混勻后置于37c溫育30分鐘。蛋白 酶K以貯存的形式保存，貯存液為20g/ml蛋白酶K水溶液。二提取步驟1）用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質(zhì)。2）用吊桶式轉(zhuǎn)頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機相分相，將水相吸至一個新的離心管內(nèi)，加2.5倍體積用冰預(yù)次序的乙醇，充分混勻，于 0 c放置1小時。3）于0c以5000g離心10分鐘沉淀RNA棄上清，用含 0.1mol/L乙酸鈉（pH5.2）的70%乙酸