危險(xiǎn)性化合物微生物降解課件

1、Environmental Biotechnology第三章危險(xiǎn)性化合物的微生物降解/Biological Degradation of Hazardous Wastes1主要內(nèi)容引言烴類化合物的微生物降解鹵代有機(jī)化合物的微生物降解其他有毒化合物的微生物降解危險(xiǎn)性化合物處理的降解生態(tài)系統(tǒng)2美國(guó)“化學(xué)文摘”中登記的化學(xué)物質(zhì)已達(dá)600萬(wàn)種之多，并正以每周6000種的速度遞增，大部分是在自然界中從未發(fā)現(xiàn)過(guò)的新化合物。溶劑、冷卻劑、增塑劑、汽油和其它石化產(chǎn)品以及農(nóng)藥、殺蟲劑、木材防腐劑等。在過(guò)去的100年中，人工合成的化學(xué)物質(zhì)在全球的濃度從稍大于零增加到約1ppb，如果以工業(yè)產(chǎn)量每年遞增2-3%預(yù)計(jì)，

2、則該類化學(xué)物質(zhì)在100年后將增加到ppm級(jí)。 第一節(jié) 微生物降解理論基礎(chǔ)一、概述3優(yōu)先污染物(Priority Pollutant)由于有毒物質(zhì)品種繁多，不可能對(duì)每一種污染物都制定控制標(biāo)準(zhǔn)，因而提出在眾多污染物中篩選出潛在危險(xiǎn)大的作為優(yōu)先研究和控制對(duì)象，稱之為優(yōu)先污染物(Priority Pollutant)或稱為優(yōu)先控制污染物。我國(guó)也開展了水中優(yōu)先污染物篩選工作，提出初篩名單249種，通過(guò)多次專家研討會(huì)，初步提出我國(guó)的水中優(yōu)先控制污染物黑名單68種(見(jiàn)表1-2) 。 45異型生物質(zhì)/ xenobiotics在自然界中具有新穎結(jié)構(gòu)的合成化合物(異型生物質(zhì)，又稱非生物性物質(zhì), xenobioti

3、cs)，往往抗微生物攻擊或被不完全代謝。因?yàn)槲⑸镆延械慕到饷覆徽J(rèn)識(shí)這些物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵序列，還未進(jìn)化出降解此類難降解化合物的代謝機(jī)制。因?yàn)榇罅渴褂煤铣傻漠愋蜕镔|(zhì)，長(zhǎng)此以往將會(huì)造成整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的失衡。6異型生物質(zhì)/ xenobiotics異型生物質(zhì)（合成化合物）危險(xiǎn)性化合物(Hazardous Chemicals)三致作用：致畸、致突變和致癌來(lái)源：殺蟲劑、除草劑和防腐劑、溶劑的主要成分或石油化工產(chǎn)品的中間產(chǎn)物鹵代芳烴和鹵代烷烴占很大比例。7采用傳統(tǒng)的環(huán)境治理技術(shù)和方法不足以解決問(wèn)題。馴化得到具有一定降解能力的微生物群體從特定的環(huán)境中分離純化具有特定降解能力的微生物基因工程微生物反應(yīng)器規(guī)

4、模/微生物制劑現(xiàn)場(chǎng)投放混合培養(yǎng)的重要性。徹底礦化通常要求一個(gè)或一個(gè)以上營(yíng)養(yǎng)菌群（如發(fā)酵水解菌群、產(chǎn)硫菌群、產(chǎn)乙酸菌群以及產(chǎn)甲烷菌群等）通過(guò)多步反應(yīng)將有毒化合物轉(zhuǎn)化為礦化終產(chǎn)物。微生物脫毒：微生物將有毒異型生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無(wú)毒穩(wěn)定中間產(chǎn)物或徹底降解為礦化終產(chǎn)物的生物降解過(guò)程。危險(xiǎn)性化合物的處理8二、微生物菌群的生態(tài)學(xué)地位依據(jù)不同的代謝作用至少可以將微生物群落分為七種：提供特殊營(yíng)養(yǎng)物；去除生長(zhǎng)抑制產(chǎn)物；改善單個(gè)微生物的基本生長(zhǎng)參數(shù)(條件)；對(duì)底物協(xié)調(diào)攻擊；共代謝 ；氫（電子）轉(zhuǎn)移；提供一種以上初級(jí)底物利用者。包含微生物之間聯(lián)系的四種群落與較為復(fù)雜的有機(jī)化合物及異型生物質(zhì)的代謝有關(guān)。以相互代謝作用為基礎(chǔ)

5、的三種微生物群落對(duì)于簡(jiǎn)單有機(jī)化合物的降解很重要。9(1)提供特殊營(yíng)養(yǎng)物微生物群落Stirling等人(1976)在環(huán)己烷上富集分離得到的一個(gè)含有諾卡式菌屬/Nocardia以及假單胞菌屬/pseudomonas微生物的群落。在該含兩個(gè)菌屬的群落中，Nocardia能夠單獨(dú)氧化環(huán)己烷，但它只有在假單胞菌也存在的情況下才能生長(zhǎng)，pseudomonas提供生長(zhǎng)因子特別是生物素。PseudomonasNocardia10(2)去除生長(zhǎng)抑制產(chǎn)物微生物群落Wilkinson等人從以甲烷生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的微生物中分離得到的四種微生物組成的群落。甲醇只有在被群落中存在的生絲微菌Hyphomicrobium sp

6、.消耗時(shí)，才不會(huì)對(duì)氧化甲烷的假單胞菌起抑制作用。該群落中的其余兩個(gè)成員是黃細(xì)菌Flavobacterium sp.與不動(dòng)桿菌Acinetobacter sp.。11(3) 改善單個(gè)微生物的基本生長(zhǎng)參數(shù)(條件)微生物群落一個(gè)三種微生物組成群落被從苔黑酚(3，5-二羥基甲苯)中富集得到。降解苔黑酚的一株假單胞菌擴(kuò)展短桿菌Brevibacterium linens不動(dòng)桿菌Curtobacterium sp.只有在假單胞菌作為初級(jí)降解者存在時(shí)才能在苔黑酚上生長(zhǎng)。該群落建立在改善單個(gè)微生物的基本生長(zhǎng)參數(shù)的基礎(chǔ)上。PseudomonasBrevibacterium linens12(4) 對(duì)底物協(xié)調(diào)攻擊微

7、生物群落建立在聯(lián)合或協(xié)同代謝降解基礎(chǔ)上的微生物群落在危險(xiǎn)性化合物的降解中極為重要，其群落微生物成員不具備單獨(dú)的能力以轉(zhuǎn)化或脫除有毒化合物，而它們結(jié)合成的群落卻能將化合物徹底礦化。從降解表面活性劑LAS(線性烷基苯磺酸鹽)的活性污泥中富集得到的微生物群落由Pseudomonas putida, Pseudomonas alcaligenes, 節(jié)桿菌Arthrobacter globiformis和沙雷氏菌屬Serratia marcescens四種微生物組成，當(dāng)兩個(gè)成員或所有成員存在時(shí)，LAS(線性烷基苯磺酸鹽)的降解和開環(huán)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單個(gè)菌種單獨(dú)存在時(shí)。Arthrobacter globif

8、ormisSerratia marcescensPseudomonas putida13(5) 共代謝(Co-metabolism)，共氧化Definition: 指生長(zhǎng)基質(zhì)存在時(shí)生長(zhǎng)細(xì)胞對(duì)非生長(zhǎng)基質(zhì)的利用。共代謝被認(rèn)為是酶缺乏專一性的一種表現(xiàn) 。一個(gè)共代謝反應(yīng)不能產(chǎn)生用于生長(zhǎng)的能量，其之所以發(fā)生是因?yàn)榛|(zhì)(如氯代化合物)能被已經(jīng)產(chǎn)生的酶利用，共代謝脫氯細(xì)菌要求有另外的生長(zhǎng)基質(zhì)作為生長(zhǎng)的碳源和能源。使非生長(zhǎng)基質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，不能徹底降解，改變結(jié)構(gòu)后的化合物可能更容易被其它厭氧微生物降解。14(6) 氫（電子）轉(zhuǎn)移微生物種屬間電子(H2或甲酸鹽)或其它營(yíng)養(yǎng)鹽的轉(zhuǎn)移，這些作用的原理是微生物在厭氧條

9、件下需要一個(gè)積累過(guò)剩還原價(jià)的受體。兩種緊密結(jié)合微生物組成的甲烷生成群落中，一種微生物是將乙醇氧化成乙酸和氫的“S微生物”，另一中是利用氫將CO2還原為甲烷的產(chǎn)甲烷菌Methanobacterium MOH。它們的相互關(guān)系使得乙醇代謝可以連續(xù)進(jìn)行，而甲烷的生成可以避免抑制性高濃度氫的累積。15COMPLEX ORGANIC MATTERSProteinsCarbohydratesLipidsAmino Acids, SugarsFatty Acids, AlcoholsHydrolysisINTERMEDIARY PRODUCTS(Propionate, Butyrate etc)Acetate

10、Hydrogen, Carbon dioxideFermentationMethaneCarbon dioxideAnaerobic OxidationHomoacetogenesisAcetotrophic MethanogenesisHydrogenetrophic Methanogenesis111112354hydrolysisacidogenesisacetogenesisOrganics Conversion in Anaerobic Systemmethanogenesis722816(7) 提供一種以上初級(jí)底物利用者許多連續(xù)富集已經(jīng)得到含一種以上菌種的穩(wěn)定菌群，該菌群能夠在所提

11、供的唯一碳源和能源上生長(zhǎng)。這些群落與協(xié)同代謝群落不同，因?yàn)槠涿總€(gè)初級(jí)利用者都能完全代謝底物。在除草劑對(duì)硫磷和苯甲酸中分離得到了這一類菌群，發(fā)現(xiàn)對(duì)硫磷被該菌群降解的速度遠(yuǎn)高于其初級(jí)微生物的純培養(yǎng)，而這些初級(jí)微生物對(duì)整個(gè)菌群的降解成功可能非常重要。17第二節(jié) 烴類化合物的微生物降解烴類化合物在好氧混合培養(yǎng)條件下的微生物降解烴類化合物在厭氧混合培養(yǎng)條件下的微生物降解18一、烴類化合物在好氧混合培養(yǎng)條件下的微生物降解（一）芳香化合物雖然大多數(shù)芳香化合物在自然界并無(wú)生物合成的來(lái)源，但是由于這類化合物已經(jīng)在自然界存在了相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間，并且與有生命的有機(jī)生物長(zhǎng)時(shí)間接觸使之演化，因而確實(shí)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些芳香化合物可

12、以被微生物降解。191、苯及烷基苯類分子氧在單氧化酶或雙氧化酶的作用下使苯環(huán)羥基化，并進(jìn)一步使環(huán)開裂。真核細(xì)胞利用單氧化酶將O2的一個(gè)氧原子引入芳香烴，可生成反式-二羥基化合物。細(xì)菌催化氧化芳香烴是將氧分子的兩個(gè)氧原子化合，自發(fā)形成初級(jí)代謝物順式-二羥基二醇，而后失去兩個(gè)氫原子形成鄰苯二酚。苯20O2(I). Under aerobic condition21 (I). Ortho（鄰位） fission (II). Meta（間位） fissionO2O2芳香烴氧化形成的鄰苯二酚或取代鄰苯二酚的開環(huán)22真菌細(xì)菌23如甲苯、二甲苯及其它烷基苯在細(xì)菌氧化下也生成順式-二羥基二醇。好氧條件下的生物

13、降解可能有兩種途徑苯環(huán)氧化形成烷基-鄰苯二酚然后再環(huán)開裂；氧化發(fā)生在取代的烷基上形成芳香醇類，再進(jìn)一步氧化至開裂前的先導(dǎo)物二羥基芳香醇類化合物氧化是由甲基基團(tuán)還是芳環(huán)開始取決于細(xì)菌種類。取代苯24苯環(huán)氧化形成烷基-鄰苯二酚然后再環(huán)開裂；氧化發(fā)生在取代的烷基上形成芳香醇類，再進(jìn)一步氧化至開裂前的先導(dǎo)物二羥基芳香醇類化合物25Polycyclic Aromatic Hydrocarbon/PAH DegradationFigure 8. Proposed pathways for the metabolism of benz(a)anthracene/苯蒽by Beijerinckia strai

14、n B1. Benz(a)anthracene/苯蒽26Phenanthrene/菲 Degradation27二、 烴類化合物在厭氧混合培養(yǎng)條件下的微生物降解（一）芳香化合物苯甲酸降解機(jī)理中所涉及的初始缺氧(anoxic)轉(zhuǎn)化是通過(guò)環(huán)的還原達(dá)到的，還原的芳環(huán)提高了脂環(huán)(alicyclic)的飽和度，隨后可水解開環(huán)生成C1C5的羧酸，然后通過(guò)乙酸礦化為CH4和CO2(圖3-8)。2829在缺氧(anoxic)條件下氧能被從水分子中結(jié)合到甲苯和苯分子中。非氧加成芳香化合物如苯、甲苯等首先轉(zhuǎn)化為苯酚、甲苯酚或鄰苯甲酚。甲苯經(jīng)歷甲基氧化生成苯基醇、苯甲酸。多環(huán)芳烴(PAHs)如萘、苊等可以被厭氧降解

15、，但是途徑不明。起始轉(zhuǎn)化的步驟涉及從水分子的羥基引入氧。30Under anaerobic conditionH2O31第三節(jié) 鹵代有機(jī)化合物的微生物降解鹵代有機(jī)化合物在好氧混合培養(yǎng)條件下的微生物降解鹵代有機(jī)化合物在厭氧混合培養(yǎng)條件下的微生物降解32一、 鹵代有機(jī)化合物在好氧混合培養(yǎng)條件下的微生物降解與碳?xì)浠衔锵啾?，鹵原子的引入使鹵代有機(jī)化合物的生物降解性大大降低。例如，短鏈烴是易于生物降解的，而氯代烷烴是耐生物降解的。在特定條件下，微生物可以通過(guò)其具有較寬專一性的酶將這些化合物生物轉(zhuǎn)化。33分子氧。有機(jī)底物氧化釋放出電子和能量產(chǎn)生時(shí)用作最終電子受體氧作為生化反應(yīng)的底物并在進(jìn)一步的代謝中被化

16、合到有機(jī)產(chǎn)物中。已知有約100種氧化酶可以催化O2化合到有機(jī)物中雙氧化酶催化氧分子的兩個(gè)原子的插入單氧化酶催化氧分子的一個(gè)原子的插入，而其余的氧被還原成水。 34MonooxygenasesDioxygenasesOxidative Reactions35（一）鹵代芳烴鹵代芳香化合物的生物降解的概念是其環(huán)被開裂為中間代謝物并且其有機(jī)鹵素被礦化。生物降解的唯一重要限速步驟是鹵素取代基從有機(jī)化合物中的脫除，它主要通過(guò)以下兩種途徑發(fā)生在降解初期通過(guò)還原、水解或氧化分解(oxygenolytic)去除機(jī)理消除鹵素；生成非芳香結(jié)構(gòu)產(chǎn)物后通過(guò)自發(fā)水解脫鹵或-消去鹵化氫。361、脫鹵優(yōu)先于開環(huán)Johnsto

17、n等(1972)報(bào)道了一株假單胞菌將3-氯苯甲酸催化脫鹵為3-羥基苯甲酸和2,5-二羥基苯甲酸，1975年Chapman又發(fā)現(xiàn)幾株微球菌可以將4-氯苯甲酸轉(zhuǎn)化為4-羥基苯甲酸，爾后又有幾例相似的發(fā)現(xiàn)。1984年Mark等與Muller等用18O2和H218O進(jìn)行脫氯反應(yīng)發(fā)現(xiàn)碳鹵素鍵的開裂與水有關(guān)而與O2無(wú)關(guān)。偶爾由雙加氧酶催化的脫氯過(guò)程是鹵代芳香化合物脫鹵的另一個(gè)分支途徑，氧被空間選擇性地引入芳香環(huán)中并自發(fā)脫鹵。37382 、開環(huán)后脫鹵由于鹵代芳香化合物不進(jìn)行親核反應(yīng)，則可能在鹵代芳烴初步轉(zhuǎn)化為非芳香中間產(chǎn)物形成較弱鹵素碳鍵以后發(fā)生脫鹵反應(yīng)，該途徑的共同特點(diǎn)是鹵素去除都在鹵代芳香化合物被轉(zhuǎn)化為

18、3-氯鄰苯二酚以后所有利用鹵代芳香化合物的細(xì)菌體系都利用在鄰位斷裂途徑的酶。而間位途徑的關(guān)鍵酶，2，3-雙加氧酶被3-氯鄰苯二酚生成的?；炔豢赡娴匾种屏嘶钚?圖3-10)。3940 (二)鹵代脂肪烴有機(jī)揮發(fā)化合物：四氯乙烯(PCE)、三氯乙烯(TCE)、1,1,1-三氯乙烷(TCA)、順-1,2二氯乙烯(cis-1,2-DCE)、1,2-二氯乙烷(1,2-DCA)以及1,1-二氯乙烯(1,1-DCE)。這些化合物能在環(huán)境中持久存在并穩(wěn)定遷移到地表下層水體中。目前主要處理方法為：將水抽至地表曝氣塔處理或用炭吸附去除，但這些方法成本較高且只是簡(jiǎn)單地將污染物從一個(gè)相(水)轉(zhuǎn)移到另一相(空氣)中。4

19、1鹵代有機(jī)化合物通常不易于被微生物降解，例如，三氯乙烯的半衰期為300d。但鹵代化合物在特定條件下能被微生物降解。 鹵代脂肪烴的氧化模式主要有以下兩種。利用烷烴的細(xì)菌由加氧酶將分子O2引入到有機(jī)分子中。假單孢菌和生絲微菌屬(Hyphomicrobium)等能將氯代烷烴作為初始底物代謝，作為惟一碳源和能源。42碳一碳雙鍵的環(huán)氧化作用(epoxidation)或氧化作用被認(rèn)為是鹵代乙烯氧化的第一步，環(huán)氧化的中間產(chǎn)物可以自發(fā)通過(guò)一系列反應(yīng)生成二鹵乙酸、乙醛酸(glyoxylic acid)或其他一碳化合物。由加氧酶將分子O2引入到有機(jī)分子中epoxidation43甲烷營(yíng)養(yǎng)菌群 和其他好氧菌能夠通過(guò)

20、單加氧酶或雙加氧酶共代謝降解一些氯代甲烷、氯代乙烷、氯代乙烯。其氧化速率與化合物的氯取代程度成反比，高氯代化合物如四氯乙烯不被氧化，而氯乙烯(CH2CHCl)比二氯乙烯(DCEs)代謝快得多。44將氯代烷烴作為初始底物代謝氯代烷烴的完全代謝有三種不同途徑，見(jiàn)圖3-11。以二氯甲烷為例，谷胱甘肽(glutathione)-依賴型脫鹵：脫氯由谷胱甘肽(glutathione)-依賴型脫鹵酶完成，基于谷胱甘肽(glutathione-mediated)的脫鹵作用通常由對(duì)與鹵素相連的碳原子的親核攻擊引起的。氧化脫鹵：1，2-二氯乙烷的降解有兩種途徑，土壤細(xì)菌DE2通過(guò)氧化脫鹵將1，2二氯乙烷轉(zhuǎn)化為1，

21、2-二氯乙醇，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為2氯乙醛和2氯乙酸(圖3-11)。水解脫鹵：自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacter autotrophicus)通過(guò)水解脫鹵將1，2二氯乙烷降解為2-氯乙醇(圖3-11)。4546二、鹵代有機(jī)化合物在厭氧混合培養(yǎng)條件下的微生物降解厭氧微生物能降解許多毒害化合物，進(jìn)行一些好氧條件下未發(fā)現(xiàn)的特殊脫毒反應(yīng)(如高氯代脂肪烴、芳烴的還原脫氯、芳環(huán)到脂環(huán)(alicyclic)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化以及開環(huán)的還原作用。Food(OrganicCompound)Electron DonorElectron AcceptorChlorinatedSolvents47鹵代芳烴氯代苯甲酸氯代苯甲酸長(zhǎng)

22、期被作為降解研究的典型化合物，因?yàn)樗鼈兪俏ｋU(xiǎn)化合物之一，也是一些污染物的降解中間產(chǎn)物如多氯聯(lián)苯(PCBs)、氯酚，或是一些除草劑的組成成分。研究結(jié)果表明在厭氧污泥混合培養(yǎng)中85%的3-氯苯甲酸被礦化為CH4和CO2，其中間產(chǎn)物為苯甲酸。另一些研究表明底泥或污泥混合培養(yǎng)菌落可將單、二和三鹵代苯甲酸脫鹵。48+ HCl+ 2HReductive dehalogenation49五氯酚(PCP)是氯酚中研究最廣泛的，作為一種重要的化工原料，常用于防腐劑、殺蟲劑、除草劑和殺菌消毒劑中，其性質(zhì)穩(wěn)定，有劇毒。在造紙和紙漿廢水中，氯代芳烴，包括氯酚、氯代鄰苯二酚和氯代鄰甲氧基苯酚(chlorognaiaco

23、ls)，在厭氧流化床反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)化和降解，在新鮮污泥和富集微生物培養(yǎng)中都發(fā)現(xiàn)氯代鄰苯二酚和4-氯間苯二酚(4-chlororesorcinol)的還原脫氯作用，氯酚在厭氧反應(yīng)器中比在曝氣池或活性污泥法中去除要快得多。氯酚類50最初的脫氯發(fā)生在鄰位(ortho-)、或間位(meta-)或?qū)ξ?para-) 。Hendriksen等(1992) 在UASB反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn)了兩種脫氯途徑(圖1.4)。大部分進(jìn)水PCP通過(guò)途徑B脫氯，少數(shù)通過(guò)途徑A脫氯。在B途徑，最初的對(duì)位脫氯產(chǎn)生2,3,5,6-四氯酚(TeCP)，該產(chǎn)物進(jìn)一步在鄰位脫氯產(chǎn)生2,3,5-三氯酚(TCP)和3,5-二氯酚(DCP)。在途徑A，通過(guò)最初的鄰位脫氯，PCP逐步脫氯產(chǎn)生2,3,4,5-TeCP和3,4,5-TCP，隨后產(chǎn)生3,5-DCP和3，4-DCP。Bhatnager et al (1991)發(fā)現(xiàn)最初的脫氯發(fā)生在間位(途徑C，1.4)。氯酚類不同的脫氯途