酶免技術(shù)f教學(xué)內(nèi)容課件

1、第十四章 酶免疫技術(shù)第一節(jié) 酶免疫技術(shù)原理及分類 一、技術(shù)原理 二、分類第二節(jié)酶免疫技術(shù)要點(diǎn) 一、酶和酶作用底物 二、酶標(biāo)記抗體或抗原 三、固相載體第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 一、基本原理 二、方法類型及反應(yīng)原理第四節(jié) 酶免技術(shù)應(yīng)用小結(jié)標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點(diǎn)：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)一、標(biāo)記免疫技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù) 標(biāo)記免疫技術(shù)指用示蹤物標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)；并借助于熒光顯微鏡，射線測(cè)量?jī)x，酶標(biāo)檢測(cè)儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測(cè)定儀等精密儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測(cè)定；可以在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對(duì)抗原抗體

2、反應(yīng)進(jìn)行定性和定位研究；也可對(duì)體液中的半抗原、抗原或抗體進(jìn)行定性和定量測(cè)定。標(biāo)記免疫技術(shù)免疫測(cè)定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及標(biāo)記技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù)生物素-親和素免疫放大技術(shù) 放射免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記免疫技術(shù)核心試劑: 酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)： 免疫學(xué)活性 酶對(duì)底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性、 放大性二、酶免技術(shù)原理及特點(diǎn)免疫技術(shù)： Ag +Ab AgAb 酶標(biāo)記的免疫技術(shù)： Ag*+Ab Ag*Ab 標(biāo)記物的作用有二：一是便于觀察反應(yīng)結(jié)果，二是提高測(cè)定的敏感性 特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)

3、、準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定操作簡(jiǎn)便。原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析 酶免技術(shù)原理及特點(diǎn)三、酶免疫技術(shù)分類 酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均 相非均相（異相）固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位 液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測(cè)定 酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會(huì)發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理（一）、均相酶免疫測(cè)定最具代表性的兩種技術(shù)酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù)EMITenzym

4、e-mutiplied immunoassay technique克隆酶供體免疫測(cè)定 CEDIAcloned enzyme donor immunoassay 均相酶免疫測(cè)定EMIT示意圖毒品(如嗎啡及其衍生物) +溶菌酶 ；酶底物(藤黃微球菌)。酶的活性與待測(cè)樣品中抗原的量成正比，測(cè)定酶活性以標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出待測(cè)抗原的量。 CEDIA示意圖酶的活性與待測(cè)樣品中抗原的量成反比。分類：液相酶免疫測(cè)定 固相酶免疫測(cè)定 以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 是目前最為常用的固相酶免疫測(cè)定與均相不同之處需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物（二）、非均相酶免疫測(cè)定第二節(jié)ELISA的技術(shù)要點(diǎn)

5、基本原理1.抗原或抗體的固相化 ；2.抗原或抗體的酶標(biāo)記 ；3.受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。 三個(gè)核心試劑 免疫吸附劑（固相載體）酶結(jié)合物酶的底物 ELISA試劑盒組分（1）已包被抗原或抗體的固相載體；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性

6、對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液。標(biāo)記酶的要求： 純度高、活性高 性質(zhì)穩(wěn)定 標(biāo)記后不影響抗原或抗體的活性，也不降低酶的活性 酶催化底物的顯色信號(hào)易于判斷和測(cè)量 酶的反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定，檢測(cè)簡(jiǎn)便、快速 酶的底物易于配制保存，酶及底物安全、易得、價(jià)廉 一、酶和酶作用底物辣根過(guò)氧化物酶（HRP） 糖蛋白（主酶）（無(wú)色）亞鐵血紅素（輔基）（暗棕色）主酶與酶活性無(wú)關(guān) 輔基是酶的活性中心RZ值：403nm （輔基）與275nm（主酶） OD值之比 （2.5-3.0）能被58%-62%飽和硫酸銨沉淀，pH3.5-12均較穩(wěn)定 ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶 常用

7、酶酶和酶作用底物堿性磷酸酶（AP） 菌源性AP 腸粘膜AP 半乳糖苷酶（-Gal） 用于均相酶免疫測(cè)定 常用酶酶和酶作用底物另：葡萄糖氧化酶、糖化酶、乙酰膽堿酯酶等底物選擇：1.底物應(yīng)該是無(wú)色，經(jīng)酶催化后有明顯顏色變化；2.所顯色澤易于洗脫；3.顯色后的產(chǎn)物要穩(wěn)定，定量檢測(cè)時(shí)所產(chǎn)生的有色物質(zhì)應(yīng)是可溶的；4.價(jià)廉、易得、無(wú)毒。酶和酶作用底物HRP的底物 DH2+H2O2 D+2H2O HRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種 H2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體的專一性很高 常用底物酶和酶作用底物HRP的常見底物 鄰苯二胺 OPD四甲基聯(lián)苯胺 TMB5-氨基水楊酸5-ASA 2,2-氨基-二(

8、3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽 ABTS常用底物酶和酶作用底物OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色 ，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm ，穩(wěn)定，無(wú)致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。 HRP的常見底物 酶和酶作用底物AP的底物 -Gal的底物 對(duì)-硝基苯磷酸酯（ pNPP ）4-甲基傘酮基-D半-乳糖苷（ 4MUG ）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長(zhǎng)為405 nm。 酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物 ，用熒光計(jì)測(cè)量。常用底物酶和酶作用底物酶免疫技術(shù)的核心組成部分 酶結(jié)合物（conjugate）酶標(biāo)記物 通

9、過(guò)化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物 二、酶標(biāo)記的抗體或抗原（一）抗原或抗體抗原要求純度高，抗原性完整天然抗原、重組抗原和合成肽。抗體需要特異性好、效價(jià)高、親合力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。多克隆和單克隆抗體。結(jié)合劑要求：1.不影響酶及抗體或抗原活性；2.不產(chǎn)生干擾物質(zhì)；3.結(jié)合效率要高；4.不出現(xiàn)非特異性反應(yīng)；5.易得、價(jià)廉。（二）酶標(biāo)記抗體或抗原制備方法要求技術(shù)方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好標(biāo)記反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體的活性酶標(biāo)記物穩(wěn)定 ，不形成聚合物酶標(biāo)記抗體或抗原制備方法過(guò)碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標(biāo)記抗體或抗原 戊二醛交聯(lián)法酶標(biāo)記抗體或抗原戊二醛交聯(lián)法戊二醛

10、分子中有兩個(gè)相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標(biāo)記效率比一步法高，酶標(biāo)記物質(zhì)量較均一。 酶標(biāo)記抗體或抗原 一步法：將25mg 純抗體與5mgHRP 混合于0.1mol/L pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液1ml 中，4下用同上緩沖液透析平衡。磁力攪拌下加入1%戊二醛0.05ml，在室溫下放置2h，在4下用0.05mol/L pH 8.0 Tris 緩沖液透析平衡，即可。 二步法：第一步將過(guò)量的戊二醛與酶反應(yīng)，使酶僅與戊二醛結(jié)合；第二步是除去多余的戊二醛分子，加入免疫球蛋白，使球蛋白上的氨基與已結(jié)合酶的戊二醛分子上的另一活性基團(tuán)結(jié)合，形成一分子酶和一分子

11、免疫球蛋白結(jié)合物。純化及鑒定標(biāo)記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競(jìng)爭(zhēng)作用而降低特異性染色強(qiáng)度 常用的純化方法：Sephadex G-200/G-150過(guò)柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純酶標(biāo)記抗體或抗原固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物迅速分離的最常用方法 固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面 三、固相載體要求 吸附性能好 不參與化學(xué)反應(yīng) 不影響免疫反應(yīng)性 空白值低、透明度高 固相方法簡(jiǎn)便易行，快速經(jīng)濟(jì)種類塑料制品 （微量反應(yīng)板）微顆粒膜載體 固相載體將抗原或抗體結(jié)合于固

12、相載體 一般ELISA包被用的緩沖液都是偏堿性的碳酸鹽緩沖液（pH9.6)，目的就是要讓被包被的蛋白質(zhì)暴露較多的陰性集團(tuán)，更穩(wěn)定的吸附到板子上。 包被coating包被與封閉用1%5%的牛血清白蛋白或5%20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點(diǎn)，消除非特異性吸附封閉blocking洗滌液與稀釋液在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫-20磷酸緩沖鹽水（PBS,pH7.4）。 終止液 常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸。常用的AP反應(yīng)終止液為碳酸鈉。四、固相酶免疫測(cè)定儀（酶標(biāo)儀）比色測(cè)定波長(zhǎng)、吸光度范圍、光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)速度、震板功能、溫度控制、定性和定量的軟件，自動(dòng)洗板、溫育、加樣450

13、nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234一、基本原理終止5固相的抗原或抗體 酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物） 酶反應(yīng)的底物 三個(gè)必要試劑 二、方法類型及反應(yīng)原理雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用： 二價(jià)或二價(jià)以上的較大分子抗原測(cè)定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測(cè)抗原的方法1、已知抗體包3、加酶標(biāo)抗體4、加酶作用的底物2、加待檢物4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法

14、測(cè)抗原1、已知抗體包2、加待檢物無(wú)抗3、加酶標(biāo)抗體+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY競(jìng)爭(zhēng)法 方法：用已知抗體包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競(jìng)爭(zhēng)與包被物結(jié)合。加底物顯色。 應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）ELISA檢測(cè)抗原的方法洗滌洗滌競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測(cè)物和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合YE間接法方法

15、 用已知抗原包被，加入待測(cè)血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn) 一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用 常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定ELISA檢測(cè)抗體的方法1、已知抗原吸2、加待檢物3、加酶標(biāo)抗Ig4、加酶作用的底物1、已知抗體吸2、加待檢物3、加酶標(biāo)的抗Ig4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測(cè)抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似 應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測(cè)抗體的方法競(jìng)爭(zhēng)法原理：類似檢測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)法 應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e

16、抗體(HBeAb)的檢測(cè) ELISA檢測(cè)抗體的方法捕獲法 應(yīng)用： 病原體急性感染診斷中的IgM型抗體 甲型肝炎HAV-IgM抗體 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體ELISA檢測(cè)抗體的方法捕獲法 原理：抗人IgM鏈抗體包被捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體 底物顯色 洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY 1、固相化抗人IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人IgM2、加待測(cè)物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測(cè)物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體無(wú)抗原結(jié)合，加底物不顯色第四節(jié) 酶免疫測(cè)定的應(yīng)用均相酶免疫測(cè)定主要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測(cè)。非均相免疫測(cè)定中的ELISA應(yīng)用更為廣泛，ELISA廣泛用于傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝三對(duì)”、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌等。也用于一些蛋白質(zhì)檢測(cè)，如各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原等）。酶免疫