高效液相色譜法的簡介課件

1、高效液相色譜法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 一. 高效液相色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography, HPLC）是20世紀六十年代末在經(jīng)典液相色譜法（LC）的基礎上引入了氣相色譜（GC）的理論和技術，采用高壓泵、高效固定相以及高靈敏度檢測器發(fā)展而成的分離分析方法。1.1 HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別1經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段 柱內(nèi)徑13cm，固定相粒徑100m 且不均勻 常壓輸送流動相 柱效低 分析周期長 無法在線檢測2HPLC：分離和分析 柱內(nèi)徑26mm，固定

2、相粒徑10m（球形，勻漿裝柱） 高壓輸送流動相 柱效高 分析時間大大縮短 可以在線檢測主要區(qū)別：固定相差別，輸液設備和檢測手段1.2 HPLC與GC差別1分析對象 GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品， 高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及 高聚物的樣品不可檢測 ,占有機物的20%. HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性 和熱穩(wěn)定性的限制,分子量大、難氣化、熱穩(wěn) 定性差及高分子和離子型樣品均可檢測.用途廣范， 占有機物的80%。2.流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善

3、分離度增加了因素，對分離起很大作用,流動相種類較多，選擇余地廣,流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用,選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相 ,可以增大分離選擇性.3操作條件差別 GC：加溫操作 HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┫嗤杭婢叻蛛x和分析功能，均可以在線檢測 主要差別：分析對象的差別和流動相的差別二. 高效液相色譜法的特點和應用 “三高” “一快” “一廣” 高壓高柱效n=104片/米，柱效高（遠高于一般LC）高靈敏度分析速度快應用范圍廣泛（可分析80%有機化合物）三.各類高效液相色譜法液-固吸附色譜液-液分配色譜 離子交換色譜 離子色譜 排阻色譜親和色譜1.

4、 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類： 剛性固體：以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O1081.O109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團，就是鍵合固定相。 硬膠：主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。可承受壓力上限為3.5108Pa。 高效液相色譜固定相和流動相（）固定相2. 固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類表面多孔型固定相：它的基體是實心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酰胺等。特點：多孔層厚度小、孔淺，相對死體積小，

5、出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時能迅速達平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。全多孔型固定相：它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相。特點：顆粒很細（310m），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，最大允許進樣量比表面多空型固定相大，易實現(xiàn)高效、高速。特別適合復雜混合物分離及痕量分析（二）流動相由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：(1) 高純度。由于高效液相靈敏度高，對流動相溶劑的純度 也要求高。 (2) 低粘度。使用

6、高粘度溶劑，會增高壓力，不利于分 離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。 粘度過于低的溶劑易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離. 一般溶劑沸點要高于55，以便降低其揮發(fā)度(3) 化學穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應或聚合的溶劑。也要避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失。(4) 溶劑對于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。(5) 溶劑要與檢測器匹配。 對于紫外吸收檢測器，流動相不應有紫外吸收。 對于折光率檢測器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動相，以達最高靈敏度。3.1 液-固吸附色譜法 固定相為固體吸附劑,流動相為液體。固定相：固體吸附劑為

7、，如硅膠、氧化鋁等，較常 使用的是510m的硅膠吸附劑； 流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑分離機制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異，即物質(zhì)吸附作用的不同來分離的。適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構體有較高選擇性3.2 液-液分配色譜固定相與流動相均為液體（互不相溶）；基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相色譜），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相色譜）。正相與反相的出峰順序相反； 固定相：早期涂漬固定液，固定液流失較多，較少采用； 化學鍵合固定相：（將各

8、種不同基團通過化學反應鍵合到硅膠（擔體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。正相高效液相色譜正相高效液相色譜是指以親水性的填料作固定相(如在硅膠上鍵合羥基、氨基或氰基的極性固定相)，以疏水性溶劑或混合物作流動相(如己烷)的液相色譜。在液相色譜發(fā)展的早期，類似于氣相色譜把含羥基、氨基或氰基的極性固定相涂漬在硅膠上這樣容易被流動相沖洗掉，現(xiàn)在幾乎都使用鍵合固定相了。反相高效液相色譜反相高效液相色譜是指以強疏水性的填料作固定相、以可以和水混溶的有機溶劑做流動相的液相色譜。如在硅膠上鍵合C18或C8烷基的非極性固定相，以極性強的水、甲醇、乙腈作流動相的高效液相色譜。時間，min固定相：C1固定相：

9、C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。時間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長對反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可見：反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長，分離效果越好。正、反相色譜中極性和保留時間的關系正相色譜中，極性弱的物質(zhì)先被洗出。反相色譜中，極性強的物質(zhì)先被洗出。 3.3 離子交換色譜固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；流動相：陰離子離子交換樹

10、脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復離子交換反應；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關。親和力大，保留時間長； 陽離子交換：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 陰離子交換：RNR4OH +X- = RNR4 X + OH-應用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等固定相按固定相制作方法可分為：1多孔型離子交換樹脂(包括微孔型和大孔型)；2表面多孔型(包括薄膜型)離子交換樹脂；3離子交換鍵合型。流動相離子交換色譜流動相為鹽類緩沖溶液(有一定pH和離子強度) ，通過改變pH、緩沖劑類型、

11、離子強度、加入有機試劑和配位劑等條件來控制分配比k，改變交換劑的選擇性，進而影響樣品待測物的分離。3.3 離子對色譜 分離原理： 離子對色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對離子或反離子）加到流動相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法； 離子對色譜機理：離子對形成機理；離子交換機理；離子相互作用機理；例如離子對形成機理：固定相為非極性鍵合相，流動相為水溶液，組分離子A-，加入一種反荷離子B+，B+離子由于靜電引力與帶負電的組分離子生成離子對化合物A-B+。由于離子對化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機相）提取。組分離

12、子的性質(zhì)不同，與反離子形成離子對的能力大小不同以及形成的離子對疏水性質(zhì)不同，導致各組分離子在固定相中滯留時間不同，因而出峰先后不同； 離子對色譜法是分離分析強極性有機酸和有機堿的極好方法。3.4 排阻色譜固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。 全部在死體積前出峰； 可對相對分子質(zhì)量在100105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離。固定相3.5 親和色譜原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離先在載體表面鍵合上一種

13、具有一般反應性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。 上述每種色譜類型均可進一步分為多個不同色譜方法。這些方法可用于分析分離，也可用于制備分離，各色譜方法在相關領域應用互相補充。 高效液相色譜法分類和正反相色譜體系四.分離類型的選擇1據(jù)相對分子質(zhì)量選擇 相對分子質(zhì)量十分低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。標準液相色譜類型（液固、液液、及離子交換色譜）最適合的相對分子質(zhì)量范圍是2002000。對于相對分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。 2根據(jù)溶解度選擇 清楚樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。如果

14、樣品可溶于水屬則屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜為佳；如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采用液固吸附色譜；如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；如樣品既溶于水又溶于異丙醇時，常用水和異丙醇的混合液作液液分配色譜的流動相，以憎水性化合物作固定相。3根據(jù)分子結(jié)構選擇 用紅外光譜法，可預先簡單地判斷樣品中存在什么官能團。然后，確定采用什么方法合適。例如，酸、堿化合物用離子交換色譜；脂肪族或芳香族用液液分配色譜、液固吸附色譜；異構體用液固吸附色譜；同系物不同官能團及強氫鍵的用液液分配色譜高效液相色譜分離方法的選擇參考表 五.高效液相色譜儀 高效液相色譜儀HPLC示意圖色譜儀器的

15、流程由液體流動相的輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、信號放大記錄系統(tǒng)組成，其中高壓泵、色譜柱和檢測系統(tǒng)是高效液相色譜的主要部件。 1貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2高壓泵（輸液泵）3進樣裝置4色譜柱分離5檢測器分析6廢液出口或組分收集器 7記錄裝置 目前高效液相色譜使用的高壓泵分為恒壓和恒流泵，恒流泵使輸出的液體流量穩(wěn)定，而恒壓泵則使輸出的液體壓力穩(wěn)定。恒流泵中有往復泵、累積型往復泵、注射泵，恒壓泵有氣動放大泵。各種高壓泵均具有以下性能：(1) 泵體材料能耐化學腐蝕。通常使用普通耐酸不銹鋼或優(yōu)質(zhì)耐酸不銹鋼。(2) 能在高壓下連續(xù)上作。通常要求耐壓4050MPacm-2，能在824h連續(xù)

16、上作，壓力平穩(wěn)。(3) 輸出流量范圍寬。一般在0.0110mL/min。(4) 輸出流量穩(wěn)定可調(diào)。高效液相色譜使用的檢測器，大多數(shù)對流量變化敏感，高壓輸液泵應提供無脈沖流量。這樣可以降低基線噪聲并獲較好的檢測下限，流量控制的精密度應小于1，最好為0.5，重復性最好為0.5。 5.1高壓泵系統(tǒng)往復泵1.電機，2.往復凸輪，3.密封柱塞，4.吸排液單向閥，5.溶劑入口，6.脈動阻尼器,7.接色譜柱。5.2 梯度洗脫裝置外梯度: 將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入混合室，用高壓輸液泵混合液輸入色譜柱。內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥，將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。

17、5.3 進樣系統(tǒng):微量注射器，高壓定量進樣閥，自動進樣器（一）六通進樣閥 如圖22-5所示。在狀態(tài)a位置，用微量注射器將樣品注入貯樣管。進樣后，轉(zhuǎn)動六通閥手柄至狀態(tài)b，貯樣管內(nèi)的樣品被流動相帶入色譜柱。貯樣管的體積可按需固定。六通進樣閥具有進樣量準確、重現(xiàn)性好，可帶壓進樣等優(yōu)點（二）自動進樣裝置 采用微處理機控制進樣閥采樣（通過閥針）、進樣和清洗等操作。操作者只需把裝好樣品的小瓶按一定次序放入樣品架上（有轉(zhuǎn)盤式、排式），然后輸入程序（如進樣次數(shù)、分析周期等），啟動，設備將自行運轉(zhuǎn)。 色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金

18、屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長530cm，內(nèi)徑為45mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑312mm，制備往內(nèi)徑較大，可達25mm 以上。一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離的性能不受影響。5.4 高效液相色譜柱1.色譜柱類型 按內(nèi)徑大小可大致分為常規(guī)分析柱、制備或半制備柱、小內(nèi)徑或微徑柱、毛細管柱四種類型。 高效液相色譜柱2.保護柱 一般在分析柱前裝上較短的保護柱，不僅可除去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結(jié)合的組分，以保護較昂貴的分析柱，延長

19、使用壽命。3.柱恒溫器 對色譜柱嚴格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留值和更好分離色譜圖。 在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學特性有響應，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學性質(zhì)有響應，屬于這類檢測器的有示差折光，電導檢測器等。 5.5 液相色譜檢測器 l. 光吸收檢測器：紫外吸收檢測器，光二極 管陣列檢測器，紅外吸收檢測器2. 熒光檢測器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì) 靈敏度高3. 示差折光率檢測器：利用折光率的差別 靈敏度低，溫度要求嚴格4. 蒸發(fā)光散射檢測器5. 電化學檢測器 液相色譜檢測器1. 紫外