DNA測序技術(shù)分析課件

1、DNA測序技術(shù)的發(fā)展一、DNA序列測定的意義二、測序技術(shù)的建立三、DNA測序技術(shù)的發(fā)展四、DNA測序技術(shù)的展望五、DNA測序技術(shù)的應(yīng)用 DNA的序列測定是分子生物學(xué)研究中的一項非常重要的和關(guān)鍵的內(nèi)容。如在基因的分離、定位、基因結(jié)構(gòu)與功能的研究、基因工程中載體的組建、基因表達與調(diào)控、基因片段的合成和探針的制備、基因與疾病的關(guān)系等等，都要求對DNA一級結(jié)構(gòu)的詳細了解。一、DNA序列測定的意義 人類基因組計劃（Human Genome ProjectHGP）于1990年正式啟動，其主要目標有：識別人類DNA中所有基因（超過10萬個）；測定組成人類DNA的30億堿基對的序列；將這些信息儲存到數(shù)據(jù)庫中；

2、開發(fā)出有關(guān)數(shù)據(jù)分析工具；致力于解決該計劃可能引發(fā)的倫理、法律和社會問題。已于2003年完成。人類基因組計劃是當代生命科學(xué)一項偉大的科學(xué)工程，它奠定了21世紀生命科學(xué)發(fā)展和現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，具有科學(xué)上的巨大意義和商業(yè)上的巨大價值。造福人類的HGP1949年, Frederick Sanger開發(fā)了測定胰島素兩條肽鏈氨基末端序列的技術(shù),1953年測定了胰島素的氨基酸序列。1950年，Edman提出了蛋白質(zhì)的N端測序技術(shù),后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出了蛋白質(zhì)自動測序技術(shù)。1965年，Sanger等發(fā)明了RNA的小片段序列測定法,并完成了大腸桿菌5S rRNA的120個核苷酸的測定。同一時期,Ho

3、lley完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)運tRNA的序列測定。蛋白質(zhì)和RNA的測序技術(shù)二、測序技術(shù)的建立1975年，Sanger和Coulson發(fā)明了“加減法”測定DNA序列。1977年， Sanger在引入雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了雙脫氧鏈終止法,使得DNA序列測定的效率和準確性大大提高。1977年，Maxam和Gilbert報道了化學(xué)降解法測定DNA的序列。DNA測序技術(shù)的建立 DNA序列測定技術(shù)出現(xiàn)后,迅速超越了蛋白質(zhì)和RNA測序技術(shù),成為現(xiàn)代分子生物學(xué)中最重要的技術(shù)。三、DNA測序技術(shù)的發(fā)展第一代DNA測序技術(shù)第二代DNA測序技術(shù)第三代DNA測序技術(shù)1、第一代DNA測序技術(shù)第一代DNA

4、測序技術(shù)： 傳統(tǒng)的化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法以及在它們的基礎(chǔ)上發(fā)展來的各種DNA測序技術(shù)。 第一代DNA測序技術(shù)包括：化學(xué)降解法、雙脫氧鏈終止法、熒光自動測序技術(shù)和雜交測序技術(shù)。1.1 化學(xué)降解法基本原理: 利用特異的選擇性試劑，專一性的隨機斷裂DNA成不同長短的片段。根據(jù)試劑的選擇性及片段在高分辨力的聚丙烯酰胺凝膠電泳上的區(qū)帶位置，判斷DNA片段末端核苷酸的種類，從而測出DNA的序列。 將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂?每個單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標記,以便顯示DNA條帶 分別用不同方法處理,獲得只差一個核苷酸的降解DNA群體 電泳,讀取DNA的核苷酸順序技術(shù)路線堿基特異修飾方法GPh8.

5、0,用硫酸二甲酯對 N7進行甲基化,使 C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/L NaCl存在時,可用肼除去胞嘧啶Maxam-Gilbert 法所用的化學(xué)技術(shù) 化學(xué)降解法剛問世時，準確性較好，也容易為普通研究人員所掌握，因此用得較多。而且化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個明顯的優(yōu)點，即所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成產(chǎn)生的拷貝，排除了合成時造成的錯誤。但化學(xué)降解法操作過程較麻煩，且用到放射性物質(zhì)，逐漸被簡便快速的Sanger法所代替。1.

6、2 雙脫氧鏈終止法 又稱為Sanger法。該法的原理是：利用DNA聚合酶，以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，設(shè)立四種相互獨立的測序反應(yīng)體系，在每個反應(yīng)體系中加入不同的雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribo nucleoside triphos phate，ddNTP）作為鏈延伸終止劑。在測序引物引導(dǎo)下，按照堿基配對原則，每個反應(yīng)體系中合成一系列長短不一的引物延伸鏈，通過高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后，從凝膠底部到頂部按53方向讀出新合成鏈序列，由此推知待測模板鏈的序列 。 POHdNTPddNTP POHOH P P P POH雙脫氧鏈末端終止法測序原理示意圖

7、 Sanger法因操作簡便，得到廣泛的應(yīng)用。后來在此基礎(chǔ)上發(fā)展出多種DNA測序技術(shù)，其中最重要的是熒光自動測序技術(shù)。1.3 熒光自動測序技術(shù) 熒光自動測序技術(shù)基于Sanger原理，用熒光標記代替同位素標記，并用成像系統(tǒng)自動檢測，從而大大提高了DNA測序的速度和準確性。 目前，應(yīng)用最廣泛的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(applied biosystems ，ABI)3730系列自動測序儀即是基于毛細管電泳和熒光標記技術(shù)的DNA測序儀。如ABI3730XL測序儀擁有96道毛細管，4種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標記，在通過毛細管時不同長度的DNA片段上的4種熒光基團被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被CC

8、D檢測系統(tǒng)識別，并直接翻譯成DNA序列。目前所用自動測序技術(shù)的改進3730全自動測序儀1.4雜交測序技術(shù) 該方法不同于化學(xué)降解法和Sanger法，是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片段固定在基片上，把待測的DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列信息。 雜交測序檢測速度快，采用標準化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分第二代測序技術(shù)的特點。但該方法誤差較大，且不能重復(fù)測定。 通過幾十年的逐步改進, 第1 代測序儀的讀長可以超過1000 bp, 原始數(shù)據(jù)的準確率可以高達99.999%, 測定每千堿基序列的成本是0.5 美元, 每天的數(shù)據(jù)通量可

9、以達到600000 堿基。 第一代測序技術(shù)在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮過重要的作用,如人類基因組計劃(human genome project,HGP)主要基于第一代DNA測序技術(shù)。目前基于熒光標記和Sanger的雙脫氧鏈終止法原理的熒光自動測序儀仍被廣泛地應(yīng)用。 隨著人類基因組計劃的完成,人們進入了后基因組時代,即功能基因組時代,傳統(tǒng)的測序方法已經(jīng)不能滿足深度測序和重復(fù)測序等大規(guī)?；蚪M測序的需求,這促使了新一代DNA測序技術(shù)的誕生。新一代測序技術(shù)即第二代測序技術(shù)。2、第二代DNA測序技術(shù) 第二代測序技術(shù)，主要包括羅氏454公司的GS FLX測序平臺、Illumina公司的Solexa Genom

10、e Analyzer測序平臺和ABI公司的SOLiD測序平臺。 第二代測序技術(shù)最顯著的特征是高通量,一次能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測序,使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組測序或基因組深度測序變得方便易行。 第二代測序技術(shù)將片段化的基因組DNA兩側(cè)連上接頭,隨后用不同的方法產(chǎn)生幾百萬個空間固定的PCR克隆陣列。每個克隆由單個文庫片段的多個拷貝組成。然后進行引物雜交和酶延伸反應(yīng)。由于所有的克隆都在同一平面上,這些反應(yīng)就能夠大規(guī)模平行進行,每個延伸反應(yīng)所摻入的熒光標記的成像檢測也能同時進行,從而獲得測序數(shù)據(jù)。DNA序列延伸和成像檢測不斷重復(fù),最后經(jīng)過計算機分析就可以獲得完整的DNA序列信息。 第二代

11、測序技術(shù)包括：454測序技術(shù)、Solexa測序技術(shù)和SOLiD測序技術(shù)。2.1 454測序技術(shù) 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的作用下，將每一個dNTP的聚合與一次化學(xué)發(fā)光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測化學(xué)發(fā)光信號的有無和強度，達到實時檢測DNA序列的目的。 454生命科學(xué)公司在2005年最早推出了第二代測序平臺Genome Sequencer 20，并測序了支原體Mycoplasma genitalium的基因組。 并在2007年推出性能更優(yōu)的第二代基因組測序系統(tǒng)一Genome Sequencer FLX System(GS FLX)。羅氏在2005年便與454公司洽

12、談并購事宜，2007年完成并購，緊接著公布了DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)者之一沃森(Jim Watson)的個人基因組，測序總花費不到一百萬美元。2.2 Solexa測序技術(shù) 核心技術(shù)：“DNA簇”和“可逆性末端終止” 。 原理：將基因組DNA的隨機片段附著到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flow cell），這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴增后，在Flow cell上形成了數(shù)以億計Cluster，每個Cluster是具有數(shù)千份相同模板的單分子簇。然后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術(shù)對待測的模板DNA進行測序。 Illumina公司的新一代測序儀Genome An

13、alyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用合成測序(Sequencingby Synthesis)的原理，實現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平行測序。 Genome Analyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng，文庫構(gòu)建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間，配對末端讀長可達到250 bp，每次運行后可獲得超過20 GB的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)，且運行成本較低，是性價比較高的新一代測序技術(shù)。 SOLID通過連接反應(yīng)進行測序。其基本原理是以四色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應(yīng)。具體步驟包括：文庫準備擴增微珠與玻片連接連接測序 超高通量是SOLID系統(tǒng)最突出的特點，目前SOLID 3

14、單次運行可產(chǎn)生50 GB的序列數(shù)據(jù)，相當于17倍人類基兇組覆蓋度。2.3 SOLiD測序技術(shù)3、第三代DNA測序技術(shù) 第三代測序技術(shù)是以單分子測序為特點的測序技術(shù)。如生物科學(xué)公司(BioScience Corporation)的HeliScope單分子測序儀(HeliScope SingleMolecular Sequencer)以及正在研制的太平洋生物科學(xué)公司(Pacific Biosciences)的單分子實時DNA測序技術(shù)SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing technology和牛津納米孔技術(shù)公司(Oxford Nanopore T

15、echnologiesLtd)的納米孔單分子測序技術(shù)等。 目前,我國也啟動了第三代測序技術(shù)的研究。2009年12月,中科院北京基因組研究所與浪潮成立“中科院北京基因組研究所浪潮基因組科學(xué)聯(lián)合實驗室”,利用各自的優(yōu)勢聯(lián)合研發(fā)國產(chǎn)第三代測序儀,第一臺樣機預(yù)計2013年問世,屆時有望緩解測序儀核心技術(shù)受制于國外公司的現(xiàn)狀。 第二代的高通量測序技術(shù)已經(jīng)得到了很好的發(fā)展和應(yīng)用, 但是由于其測序速度、成本、準確度等關(guān)鍵問題的解決仍存在困難,研究者們很快將目光轉(zhuǎn)向了更高更新的測序解決方案。 單分子測序也就應(yīng)運而生。第三代測序技術(shù)非常驚人！1、它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的反應(yīng)速度，一秒可以測10個堿基，測序

16、速度是化學(xué)法測序的2萬倍。2、它實現(xiàn)了DNA聚合酶內(nèi)在自身的processivity（延續(xù)性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很長的片段），一個反應(yīng)就可以測非常長的序列。 二代測序現(xiàn)在可以測到上百個堿基，但是三代測序現(xiàn)在就可以測幾千個堿基。這為基因組的重復(fù)序列的拼接提供了非常好的條件。3、它的精度非常高，達到99.9999%。4、可直接測RNA序列。5、可直接測甲基化的DNA序列。 2008年4月，Helico BioScience公司的Timothy等人在Science上報道了他們開發(fā)的真正的單分子測序技術(shù),并利用該技術(shù)對一個M13病毒基因組進行重測序。 這項技術(shù)之所以被稱為真正的單分子測序,

17、是因為它完全跨過了前述3種高通量測序依賴的基于PCR擴增的信號放大過程,真正達到了讀取單個熒光分子的能力。 斯坦福大學(xué)的科學(xué)家最近利用Heliscope單分子測序儀,用了48 000美元的試劑和4個星期的時間,對一名白人男子的基因組進行了測序。測序的覆蓋度達28倍,覆蓋了90%的人類參考基因組。序列讀長24-70 bp,平均讀長為32 bp,并鑒定出280萬個SNP位點和752個拷貝數(shù)變異。3.1 HeliScope單分子測序儀 Pacific bioscience 在Science上報道了他們的基于SMART技術(shù)的單分子測序技術(shù),該技術(shù)利用單分子技術(shù)和DNA聚合酶,在聚合反應(yīng)的同時就可以讀取

18、測序產(chǎn)物,目前一期的讀取速度為3bp / s,但他們聲稱在2013 前實現(xiàn)三分鐘讀完人類基因組。Pacific技術(shù)目前在研究大腸桿菌基因組時的評價讀長為586個堿基,有些能達到2805堿基,新儀器的單個讀長已達10351個堿基,而且有望實現(xiàn)更大的讀長,而且準確率99.9999%。 3.2 單分子實時DNA測序技術(shù) 英國牛津納米公司成功研制出了基于納米孔的單分子測序技術(shù),該技術(shù)讀取數(shù)據(jù)的速度更快,而且成本會大大降低 。 在該測序技術(shù)平臺中,DNA分子以一次一個堿基的速度依次通過納米小孔,利用核酸外切酶的特性來識別出不同的DNA堿基,同時還能檢測出堿基是否被甲基化等相關(guān)的重要信息。3.3 納米孔單分子測序技術(shù) 據(jù)2010 年7 月30 日Xiao Yan（Nano Lett，July 30，2010）報道，美國賓夕法尼亞大學(xué)的研究人員開發(fā)出一個納米級的碳基平臺，可用于電子探測單個DNA 分子。該技術(shù)最終有望在快速DNA 電子測序方面發(fā)揮“用武之地”。這個納米平臺由石墨烯制成。研究小組利用電子束技術(shù)，在石墨烯膜上燒灼出納米大小的小孔，在電場的作用下，微小的DNA鏈就可以穿過這些孔洞。通過電子測量手段檢測DNA 的易位，再根據(jù)DNA 的4 個堿基各自獨特的“電子簽名”，就可以快速完成DNA 測序。探測單個DNA 分子技術(shù)開啟高通