IDO與Treg在支氣管哮喘小鼠中的相互作用及其意義

1、PAGE IDO與Treg在支氣管哮喘小鼠中的相互作用及其意義周麗蓉1，張劼2，羅永艾1（400016 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科1；400014 重慶，重慶市第三人民醫(yī)院老年科2）摘要 目的 探討吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleam ine 2,3-d ioxygense IDO) 與CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）之間的相關(guān)性及在支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。方法 BALB/C小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組和哮喘組，每組8只。哮喘組以雞卵清蛋白（ovalbumin ,OVA）致敏，激發(fā)BABL/C小鼠建立哮喘模型，無(wú)創(chuàng)肺功能儀檢測(cè)氣道反應(yīng)性，支氣管肺泡灌洗液(BALF

2、)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)分析，ELISA檢測(cè)BALF中INF-、IL-4、IL-10濃度，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺組織IDO和Foxp3 mRNA表達(dá)，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)IDO蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg占CD4+細(xì)胞的百分率。結(jié)果 哮喘組小鼠氣道反應(yīng)性、BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞比例及IL-4濃度明顯高于對(duì)照組(P 0.01)；而INF-與IL-10濃度、IDO和FoxP3的mRNA表達(dá)、IDO蛋白表達(dá)、Treg占CD4+細(xì)胞的百分率明顯低于對(duì)照組(P 0.01)；對(duì)照組與哮喘組IDO與Foxp3的mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.819，0.807; P0.05），對(duì)照組與哮喘組IDO蛋白表達(dá)

3、與Treg占CD4+細(xì)胞的百分率呈正相關(guān)（r=0.783,0.765; P0.05）。結(jié)論 哮喘小鼠IDO和Foxp3表達(dá)降低，Treg數(shù)量減少，且IDO蛋白表達(dá)與Treg占CD4+細(xì)胞的百分率呈正相關(guān)，表明IDO與Treg相互調(diào)節(jié)，打破免疫耐受，誘導(dǎo)哮喘發(fā)生，這補(bǔ)充了哮喘的免疫發(fā)病機(jī)制。關(guān)鍵詞 吲哚胺2，3雙加氧酶；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；支氣管哮喘；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；流式細(xì)胞術(shù)中圖法分類(lèi)號(hào) 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 AThe interaction and the role of indoleamine 2,3-dioxygenase and CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell

4、in the asthmatic mice modelZhou Lirong1, Zhang Jie2, Lou Yongai1（1Department of Respiratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 2Department of Geriatrics Medicine, The Third Peoples Hospital of Chongqing, Chongqing 400014, China）Abstract

5、Objective To explore the interaction and the role of indoleamine 2,3-dioxygenase（IDO）and CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell（Treg）in a mice model of allergic bronchial asthma. Methods BALB/c mice were sensitized and challenged by ovalbumin(OVA). Penh were measured to evaluate the airway responsiveness

6、 by noninvasive lung functional instrument. Bronchoalveolar lavage cytology was analysed. INF-、IL-4 and IL-10 of BALF were detected by enzyme-linked immunosorbnent assay( ELISA ). The mRNA expressions of IDO and Foxp3 were measured by real-time fluorescence-based quantitative PCR. The protein expres

7、sion of IDO was detected by immunohistochemistry. The percentage of Treg in CD4+ cells was assessed by flow cytometric analysis. Results The airway responsiveness、the total cell number、the eosinophils and IL-4 of BALF in the asthmatic group were significantly increased when compared with thecontrol

8、group(P0.01). INF- and IL-10 of BALF、the mRNA expressions of IDO and Foxp3、the protein expression of IDO、the percentage of Treg in CD4+ cells in the asthmatic group were significantly lower than that of the control group(P0.01). The mRNA expressions of IDO and Foxp3 were positive correlation. The pr

9、otein expression of IDO and the percentage of Treg in CD4+ cells were positive correlation. Conclusions The mRNA expression of IDO and Foxp3 、the protein expression of IDO、 the percentage of Treg in CD4+cells are lower in the asthmatic mice，and the protein expression of IDO and the percentage of Tre

10、g in CD4+ cells were positive correlation. These suggest that IDO and Treg are reciprocal inhibition, which surmount immune tolerance and induce asthma. Therefore, IDO and Treg may play important roles in asthma.Key Words Indoleamine 2,3-dioxygenase; Regulatory T cell; Asthma; Real-time fluorescence

11、-based quantitative PCR; Flow cytometric analysisCorresponding author: Luo Yongai, HYPERLINK mailto:E-mail E-mail：支氣管哮喘是一種常見(jiàn)的呼吸道疾病，是機(jī)體對(duì)過(guò)敏原刺激產(chǎn)生的以氣道高反應(yīng)性為特征的變態(tài)反應(yīng)性慢性炎癥性疾病，目前其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleam ine 2,3-d ioxygense ,IDO) 是肝臟以外唯一可催化色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶，特異表達(dá)于樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等1，使未成熟的DC 通信作者 羅永艾

12、HYPERLINK mailto:E-mail E-mail：轉(zhuǎn)變成調(diào)節(jié)性DC（iDC），對(duì)于維持T細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和免疫耐受的起著重要作用2-3。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是具有免疫抑制功能的細(xì)胞群，對(duì)于介導(dǎo)對(duì)環(huán)境過(guò)敏原的免疫耐受形成過(guò)程具有重要作用4。本研究通過(guò)觀察IDO與Treg在支氣管哮喘小鼠模型中的變化，探討兩者之間的相關(guān)關(guān)系以及在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用。1材料和方法 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB/C小鼠，雌性，68周齡，體重(182) g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，隨機(jī)分成2組，每組8只，分別為對(duì)照組、哮喘組。1.2 主要試劑雞卵清蛋白（ovalbumi

13、n ,OVA，grade V）、乙酰甲膽堿(Mch)為Sigma 公司產(chǎn)品，氫氧化鋁（AI(OH)3）凝膠為T(mén)hermo公司產(chǎn)品，Trizol為Gibco公司產(chǎn)品，熒光素標(biāo)記的抗小鼠抗體包括藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的 CD25、異硫氰基（FITC）標(biāo)記的CD4、PE-CY5標(biāo)記的FoxP3、固定破膜劑、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑復(fù)合物均為 eBioscience 公司產(chǎn)品，羊抗鼠IDO單克隆抗體、羊抗兔HRP-IgG為Santa cruz公司產(chǎn)品，Rever Tre Ace-a-逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為T(mén)OYOBO公司產(chǎn)品。1.3 哮喘模型的構(gòu)建1.3.1 致敏 實(shí)驗(yàn)第0、7、14天腹腔注射致敏，哮喘組每次給予100

14、g OVA+100 L PBS +100 LAl(OH)3混懸液，對(duì)照組給予100 L PBS +100 LAl(OH)3。1.3.2激發(fā) 在實(shí)驗(yàn)第21到27連續(xù)7天霧化，哮喘組給予1 g/ L OVA-PBS溶液激發(fā)，1次/d，每次30 min，對(duì)照組用PBS代替OVA。1.4 氣道反應(yīng)性測(cè)定末次激發(fā)后24 h，小鼠無(wú)創(chuàng)肺功能儀檢測(cè)各濃度Mch激發(fā)后增強(qiáng)呼氣間歇 (Penh)，Mch濃度依次為0.78 mg/ mL、1.56mg/ mL、3.125 mg/ mL、6.25 mg/ mL、12.5 mg/ mL、25mg/ mL、50mg/ mL，以生理鹽水（NS）的Penh為基值，Mch激發(fā)

15、的Penh/NS激發(fā)的Penh*100以Penh%表示，作為氣道反應(yīng)性的評(píng)價(jià)指標(biāo)。1.5 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類(lèi)以及ELISA法檢測(cè)INF-、IL-4、IL-10濃度 末次激發(fā)后48h，處死小鼠，仰臥位固定，暴露氣管，用留置針行氣管插管肺泡灌洗，每次用PBS 0.5 mL，共4次，記錄回收量。離心，沉淀重懸后取20 L計(jì)細(xì)胞總數(shù)，剩余涂片，蘇木素-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)；參照ELASA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液的細(xì)胞因子。1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺組織IDO和FoxP3的mRNA表達(dá) 取肺組織勻漿，Trizol法抽提總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，反應(yīng)體系為20 L，反應(yīng)

16、條件：42 10 min3020 min99 5 min4 5 min，以cDNA為模板進(jìn)行IDO、Foxp3和GAPDH mRNA的PCR擴(kuò)增。引物由南京金斯瑞公司合成，序列如下：IDO:上游5GCCAGACAGATATATGCGGAGAA 3，下游5AAGGCA CTGCACGACATAGCTAC3；Foxp3：上游5GGTGGAGGCGGGACTGAGT 3，下游5TCCCCCTTTTCCACTACTCTATG 3；GAPDH：上游5ACCCATCACC ATCTTCCAGGAG3，下游5GAAGGGGCGGAGATGATGAC 3，反應(yīng)體系為20 L，反應(yīng)條件：94 -5 min（94

17、 -30 s57 -30 s72 -30 s）4572 -10 min。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出CT值，與各自內(nèi)參GAPDH的CT值校正后，得到IDO和FoxP3的mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)。1.7 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肺組織IDO蛋白表達(dá) 取肺組織，10中性甲醛固定48 h，酒精脫水，石蠟包埋，切片，加入羊抗鼠IDO（1：200），4孵育過(guò)夜，羊抗兔HRP-IgG，DAB顯色。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，用image-pro plus 6.0圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性部位的平均光密度，用以代表蛋白表達(dá)水平。1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg占CD4+細(xì)胞的百分率 打開(kāi)腹腔無(wú)菌取脾，PBS沖洗，碾磨后200目篩網(wǎng)過(guò)

18、濾，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，加入anti-CD4-FITC，anti-CD25-PE，4避光孵育30 min；洗滌后加入新鮮配制的固定/破膜劑，4 避光孵育45 min；洗滌2次后加入anti-Foxp3-PE-cy5.5，4 避光孵育30 min，洗滌后重懸細(xì)胞，上機(jī)測(cè)定。1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)用表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，當(dāng)方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)，用Pearson方法進(jìn)行相關(guān)分析，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1 氣道反應(yīng)性哮喘組小鼠霧化吸入Mch 3.12550 mg/ mL時(shí)Penh%顯著高于對(duì)照組（P 0.01）；Mch-

19、Penh/Ns-Penh最大值哮喘組為1330.63295.94明顯高于對(duì)照組(519.83133.15)（P 0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖1。圖1 兩組小鼠不同氣道反應(yīng)性的比較2.2 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi) 與對(duì)照組比較，哮喘組BALF總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)比例均顯著性升高（P0.01），結(jié)果見(jiàn)表1。 表1 小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)的變化（ 105/ mL）n=8組別細(xì)胞總數(shù)中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞嗜酸性細(xì)胞巨噬細(xì)胞對(duì)照組1.620.713.210.975.561.8790.8711.160.340.05哮喘組8.162.5710.602.8119.004.3937.446

20、.5133.186.672.3 ELISA 檢測(cè)BALF中INF-、IL-4、IL-10濃度 與對(duì)照組比較，哮喘組BALF中INF-和IL-10濃度降低，而IL-4濃度升高，均有顯著性差異（P0.01），結(jié)果見(jiàn)表2。 表2 小鼠BALF 中INF-、IL-4和IL-10的濃度（n=8 ）組別INF-（pg/ mL） IL-4（ng/L）IL-10（pg/ mL）對(duì)照組332.088.95207.427.18151.996.13哮喘組252.798.36272.468.70121.245.852.4 熒光定量PCR檢測(cè)肺組織IDO和FoxP3的mRNA表達(dá) 哮喘組和對(duì)照組肺組織IDO mRNA

21、CT值分別為(5.930.23)和(4.450.17)，相對(duì)表達(dá)量為1:0.35（P0.01）；哮喘組和對(duì)照組肺組織FoxP3 mRNA CT值分別為(3.540.18)和(2.150.14)，相對(duì)表達(dá)量為1:0.38（P0.01）。2.5 免疫組化檢測(cè)肺組織IDO的蛋白表達(dá)以平均光密度為指標(biāo)檢測(cè)的小鼠肺組織中IDO在蛋白水平的表達(dá)，哮喘組為(118.4312.38)，對(duì)照組為(279.9330.24) ，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。ABA：對(duì)照組；B：哮喘組圖2 兩組小鼠肺組織中IDO的表達(dá)（200）2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg占CD4+細(xì)胞的百分率 哮喘組Treg占CD4+細(xì)胞的百分

22、率(2.53%0.13%)比對(duì)照組(5.05%0.26%)明顯降低（P0.01）。ABA：對(duì)照組；B：哮喘組圖3 兩組小鼠Treg占CD4+細(xì)胞的百分率2.7 相關(guān)分析結(jié)果將正常組IDO與Foxp3的mRNA和哮喘組IDO與Foxp3的mRNA的表達(dá)分別進(jìn)行相關(guān)分析，r值分別為0.819和0.807（P0.05），提示IDO與FOXP3的mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)。將正常組和哮喘組的IDO蛋白表達(dá)與Treg數(shù)量分別進(jìn)行相關(guān)分析，r值分別為0.783和0.765（P0.05），提示IDO蛋白表達(dá)與Treg數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系。 3 討論免疫耐受機(jī)制缺乏或減弱可使機(jī)體Th2細(xì)胞反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致氣道變態(tài)反應(yīng)

23、性炎癥發(fā)生，因此免疫耐受機(jī)制缺陷可能是支氣管哮喘發(fā)生的始動(dòng)因素5。正常氣道在接觸過(guò)敏原形成免疫耐受機(jī)制中Treg起著重要作用，F(xiàn)oxp3是Treg特異性的標(biāo)志，其表達(dá)與Treg功能密切相關(guān)6。本研究中，哮喘組肺組織Foxp3 mRNA表達(dá)降低，流式細(xì)胞檢測(cè)Treg占CD4+細(xì)胞的百分率減少，其分泌的抑制性細(xì)胞因子IL-10濃度降低，并且Th1細(xì)胞分泌的IFN-濃度減少，Th2細(xì)胞分泌的IL-4濃度增加，提示小鼠接觸特異性過(guò)敏原后，抗原特異性CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞偏移，而不是向Treg偏移，導(dǎo)致Treg數(shù)量減少。試驗(yàn)中哮喘組小鼠氣道反應(yīng)性明顯升高，BALF中細(xì)胞總數(shù)以及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、

24、嗜酸性細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)比例顯著性升高，提示氣道變應(yīng)性炎癥加重。由此可以推測(cè)，小鼠接觸特異性過(guò)敏原后，抗原特異性CD4+T細(xì)胞不向Treg偏移，導(dǎo)致Treg數(shù)量減少，免疫調(diào)節(jié)功能減弱，免疫耐受缺陷，從而引起Th1功能減弱，Th2功能亢進(jìn)，氣道反應(yīng)性增加，變應(yīng)性炎癥加重，支氣管哮喘發(fā)生。目前認(rèn)為，CTLA-4可能是機(jī)體外周T細(xì)胞耐受的主要控制開(kāi)關(guān)。表達(dá)CTLA-4的Treg誘導(dǎo)的免疫耐受機(jī)制是通過(guò)IDO解代謝色氨酸而抑制激活T細(xì)胞分化、增殖，導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)能的作用實(shí)現(xiàn)的；且IDO催化分解色氨酸的產(chǎn)物也可抑制同種異基因T細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，從而清除活化的抗原特異性T細(xì)胞克隆7。此外，Hill等8研

25、究顯示IDO可能通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化或者直接活化成熟的Treg細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，哮喘組小鼠肺組織Treg特異性的Foxp3 mRNA表達(dá)降低，流式細(xì)胞檢測(cè)Treg占CD4+細(xì)胞的百分率減少，Treg分泌的抑制性細(xì)胞因子IL-10水平降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)肺組織IDO的mRNA和蛋白表達(dá)降低。統(tǒng)計(jì)分析顯示，F(xiàn)oxp3的mRNA表達(dá)水平與IDO的mRNA表達(dá)水平之間呈正相關(guān)，IDO的蛋白表達(dá)水平與Treg細(xì)胞數(shù)量之間呈正相關(guān)。由此我們可以推測(cè)，由于Treg功能減弱，數(shù)量減少，所誘導(dǎo)的IDO表達(dá)量下降，同時(shí)由于IDO表達(dá)量降低，CTLA-4表達(dá)減低，不能誘導(dǎo)T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化或者活化，

26、導(dǎo)致Treg數(shù)量進(jìn)一步減少，由此形成正反饋。最終，通過(guò)色氨酸代謝機(jī)制的免疫耐受被打破，導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增加，氣道變應(yīng)性炎癥加重，誘導(dǎo)哮喘發(fā)生。IFN-及IFN調(diào)節(jié)因子1(IRF1)是激活I(lǐng)DO的主要細(xì)胞因子9，可上調(diào)IDO表達(dá)；IL-4、IL-6和TGF-可下調(diào)IDO的表達(dá)10。本研究中，哮喘組IFN-濃度減低，IL-4濃度增加，肺組織IDO的mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)降低，提示IFN-表達(dá)降低，IL-4表達(dá)升高，可導(dǎo)致IDO表達(dá)量降低。綜上所述，IDO與Treg之間存在一個(gè)調(diào)節(jié)環(huán)路，機(jī)體接觸特異性過(guò)敏原后， DC提呈抗原，抗原特異性CD4+T細(xì)胞不向Treg偏移，Treg數(shù)量減少和功能減弱，抑制D

27、C表達(dá)IDO，IDO不能通過(guò)降解色氨酸誘導(dǎo)對(duì)外源性抗原的免疫耐受；而且IDO的表達(dá)下調(diào)，又抑制幼稚T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化；同時(shí)由于Th1功能減弱，Th2功能亢進(jìn)，其分泌的細(xì)胞因子IFN-等減少，IL-4等增加，進(jìn)一步下調(diào)IDO表達(dá)，這種反饋?zhàn)饔米罱K導(dǎo)致免疫耐受缺陷的形成。當(dāng)氣道DC提呈抗原時(shí)引起T細(xì)胞向Th2反應(yīng)偏離，氣道反應(yīng)性增加，變應(yīng)性炎癥加重，支氣管哮喘發(fā)生。這是對(duì)哮喘免疫發(fā)病機(jī)制的重要補(bǔ)充。參考文獻(xiàn)：1 Beutelspacher S C, Tan P H, McClure M O, et a1. Expression of indoleamine2,3-dioxygenase (I

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