《儀器分析-色譜》課件第3節(jié) 液相色譜法-2010

1、第三節(jié) 高效液相色譜法High-performance liquid chromatography 3.1、高效液相色譜儀3.2、固定相與流動(dòng)相3.3、分離類型與原理3.4、日常操作和維護(hù)2經(jīng)典LC與HPLC的比較經(jīng)典LCHPLC柱內(nèi)徑15 cm0.46 cm柱長(zhǎng)50100 cm1525 cm粒徑150200 m5 m柱壓110 atm50200 atm分離時(shí)間0.5 h天10 60 min3 HPLC與GC的比較分析對(duì)象及范圍：GC占有機(jī)物總數(shù)20%；HPLC可分析高沸點(diǎn)、高分子量的化合物，占有機(jī)物總數(shù)80%。流動(dòng)相的選擇：GC為有限幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用；HPLC為混合液體，選擇機(jī)

2、會(huì)多。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。檢測(cè)器：GC 靈敏度普遍高。柱效：毛細(xì)管GC可通過(guò)增加柱長(zhǎng)提高總塔板數(shù)。分析成本：HPLC高柱外效應(yīng)：HPLC突出4高效液相色譜法的特點(diǎn)高壓、高效、高速高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。53.1、液相色譜儀及主要部件1、流程62、主要部件 (1) 高壓輸液泵 壓力：150350105 Pa。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性7輸液泵種類：恒壓型和恒流型 恒壓泵 可迅速獲得高壓，適于柱的勻漿填充。但因泵腔體積大，在往復(fù)推動(dòng)時(shí)，會(huì)引起脈動(dòng)。 恒流型 溶劑流量恒定，與柱填充情況無(wú)關(guān)，使用較多。有機(jī)械注射式和機(jī)械往復(fù)

3、式兩種。應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)式恒流泵，脈動(dòng)小。8馬達(dá)往復(fù)式拉動(dòng)密封溶劑球閥脈動(dòng)阻尼器到色譜柱機(jī)械往復(fù)柱塞泵示意圖單向閥9高壓梯度及低壓梯度(2) 梯度淋洗裝置10(3) 進(jìn)樣裝置六 通 閥1112(4) 色譜柱 柱體為直型不銹鋼管，常軌內(nèi)徑16 mm，柱長(zhǎng)540 cm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。復(fù)雜樣品分析常使用預(yù)柱。13色譜柱裝填常采用四氯 化碳作懸浮液，同時(shí)加入二氧六環(huán)作分散劑，有助于粒子分散. 14(5) 液相色譜檢測(cè)器 a. 紫外檢測(cè)器 應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點(diǎn)： 靈敏度高； 線性范圍寬； 流通池可做的很?。?mm 10mm ，容積 8L）； 對(duì)流動(dòng)相的

4、流速和溫度變化不敏感； 波長(zhǎng)可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。 1516b. 光電二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。1718光電二極管陣列檢測(cè)器19c. 示差折光檢測(cè)器 可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比； 通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同折光指數(shù)） 靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種20d. 熒光檢測(cè)器 高靈敏度、高選擇性； 對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；21 電導(dǎo)檢測(cè)器主

5、要用于離子色譜的檢測(cè)。 其原理是基于待測(cè)物在一些介質(zhì)中電離后所產(chǎn)生的電導(dǎo)（電阻的倒數(shù)）變化來(lái)測(cè)量電離物質(zhì)的含量。 電導(dǎo)檢測(cè)器的主要部件是電導(dǎo)池。其響應(yīng)受溫度影響較大，因此需要將電導(dǎo)池置于恒溫箱中。e.電導(dǎo)檢測(cè)器22f 質(zhì)譜檢測(cè)器與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用相比，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用要求更高23液相色譜固定相基本要求要耐高壓3.2、固定相與流動(dòng)相3.2.1、液相色譜固定相按基質(zhì)不同可分為無(wú)機(jī)基質(zhì)和有機(jī)基質(zhì)兩大類。無(wú)機(jī)基質(zhì)主要包括：二氧化硅、氧化鋁、氧化鋯、分子篩、羥基磷灰石等。 機(jī)械強(qiáng)度高、溶脹性小、耐高壓、柱效高。應(yīng)用相對(duì)更為廣泛。 有機(jī)基質(zhì)：各類有機(jī)聚合物，目前主要用于離子交換和體積排阻色譜 化學(xué)穩(wěn)定

6、性好、表面性質(zhì)均勻，但機(jī)械強(qiáng)度不高，易于溶脹，傳質(zhì)阻力大，柱效低。24（2）全多孔型早期采用100m的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見(jiàn)； 現(xiàn)采用10m以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料； （1）表面多孔型 （薄殼型微珠擔(dān)體） 3040m的玻璃微球，表面附著一層厚度為1 2m的多孔硅膠。表面積小，柱容量低。 硅膠基質(zhì)類型2526（3）化學(xué)鍵合固定相 化學(xué)鍵合固定相: 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型： SiOC b. 硅氧硅碳鍵型：SiOSi C 穩(wěn)定，耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣； c. 硅碳鍵型： SiC d. 硅氮鍵型： SiN27表面修飾功能團(tuán)類型：反相：C1

7、8、C8、苯基；正相：氰基、二醇基或氨基；離子交換：磺酸基、季胺；親和：蛋白質(zhì)手性：纖維素、環(huán)糊精28填料的端基封口封口殘余硅羥基減少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1% - 1%）使用三甲基氯硅烷（TMCS）或六甲基二硅烷（HMDS）等小分子的硅烷進(jìn)行處理29液相色譜流動(dòng)相需滿足的基本條件:（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相。（2）化學(xué)穩(wěn)定性好避免流動(dòng)相與樣品發(fā)生作用。（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。3.2.2、液相色譜流動(dòng)相(5) 低黏度30溶劑的強(qiáng)度和極性混合溶劑極性：P=1P1

8、+2P231溶劑選擇性323.3 HPLC分離模式液固吸附色譜液液分配色譜離子交換色譜離子對(duì)色譜體積排阻色譜親和色譜不同的分離模式是不同的機(jī)理33色譜分離法的分類（原理）吸附色譜排阻色譜分配色譜離子交換色譜吸附能力的差異分子尺寸的大小不同兩相中分配系數(shù)的不同親和力的差異Adsorption chromatographyExclusion chromatographyGel-permeation chromatographyPartition chromatographyIon-exchange chromatography親和色譜特異反應(yīng)，親和力的差異Affinity chromatograp

9、hy34固定相極性（親水性）流動(dòng)相非極性（疏水性）正相色譜反相色譜固定相非極性（疏水性）流動(dòng)相極性（親水性）35正相色譜低極性流動(dòng)相反相色譜高極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相中等極性流動(dòng)相時(shí)間時(shí)間時(shí)間時(shí)間待測(cè)物極性：ABC正、反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系363.3.1、液-固吸附色譜 固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是510m的硅膠吸附劑； 流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。 一般是正己烷、環(huán)己烷為基礎(chǔ)溶劑，加入二氯甲烷、短鏈醇、THF調(diào)節(jié)洗脫強(qiáng)度，構(gòu)成正相色譜體系37液固吸附色譜的分離機(jī)理基于溶質(zhì)和溶劑分子對(duì)吸附劑表面吸附活性點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)。38分離極性化合物含有不同官能團(tuán)的化合物或

10、族分離 思考：出峰順序？分離異構(gòu)體化合物（分離選擇性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它色譜法）（例：VE異構(gòu)體）對(duì)同系物分離選擇性差，只能快速分離低級(jí)同系物，不能分離高級(jí)同系物。液固吸附色譜適用對(duì)象39樣品分子結(jié)構(gòu)的影響Figure 3-2 HPLC chromatogram of benzene and substituted benzene separated on ceria-zirconia column. Conditions: column: 1504.6mmi.d.; mobile phase: ethanol/cyclohexane (1/99,v/v); flow-rate 1.0ml.min-1

11、; detection at UV 254nm.Peaks: 1. Benzene; 2.benzonitrile; 3. m-dinitrobenzene; 4. 3-phenylpropanol. 40HPLC方法 色譜柱: Eurospher 100-5 Si, 150 x 4 mm ID 流動(dòng)相: Hexan / 2-丁醇 (1000:4 v/v) 1. -維生素E 2. -維生素E 3. -維生素E 4. -維生素E 5. 維生素 D2 6. 順式-維生素A 結(jié)構(gòu)非常相似的維生素異構(gòu)體分離41液固吸附色譜存在的問(wèn)題嚴(yán)格控制固定相和流動(dòng)相含水量流動(dòng)相的雜質(zhì)要非常小（尤其是極性雜質(zhì))非線

12、形等溫吸附常引起峰的拖尾進(jìn)樣量的控制423.3.2、液-液分配色譜 固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）； 基本原理：組分在固定相和流動(dòng)相上的分配； 固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用； 化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。 43通常，化學(xué)鍵合相的載體主要是硅膠（表面有硅醇基）：Si-O-R：對(duì)熱不穩(wěn)定、遇水、乙醇等強(qiáng)極性會(huì)水解，使酯鏈斷裂，因此只適于以不含水或醇的流動(dòng)相。Si-R(或Si-N)：不水解，熱穩(wěn)定性比硅酸脂好。但所用的格氏反應(yīng)不方便。使用水溶液作流動(dòng)相時(shí)，其pH應(yīng)在4-8之間。Si-O-Si-R：不水解，熱穩(wěn)定性好，在pH2-8

13、范圍內(nèi)對(duì)水穩(wěn)定。化學(xué)鍵合固定相44化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn)（1）傳質(zhì)快，表面無(wú)深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無(wú)固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊；（3）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（4）有利于梯度洗脫； 存在著雙重分離機(jī)制： (鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理) 高覆蓋率：分配為主； 低覆蓋率：吸附為主；45以C18鍵合相的反相高效液相色譜最常用的一種色譜分離模式(85%)46反相鍵合相色譜分離非極性化合物色譜柱: Ultra Sep ES PAH, 250 x 2 mm ID 檢測(cè)器: 熒光檢測(cè)器1. 萘 9. 草屈 2. 苊 10. 苯(b)熒蒽 3. 芴 11. 苯(

14、k) 熒蒽 4. 菲 12. 苯(a) 芘 5. 蒽 13. 二苯(a,h)蒽 6. 熒蒽 14. 苯(g,h,i)二萘嵌苯 7. 芘 15. 茚酚(1,2,3-cd) 芘 8. 苯(a)蒽 47反相鍵合相色譜分離極性化合物48時(shí)間，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅膠-烷基鍵合相中烷基鏈長(zhǎng)對(duì)反相色譜分離的影響1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯反相鍵合色譜中，鍵合相碳鏈越長(zhǎng)，分離效果越好。反相色譜出峰順序49反相色譜流動(dòng)相反相色譜用極性溶劑及其混合物作流動(dòng)相。溶劑極性越低，洗脫能力越強(qiáng)；極性越高，洗脫能力越弱，水是反相色譜最弱的溶劑。反相色譜溶劑

15、強(qiáng)度近似地與Snyder在氧化鋁上按溶劑極性系列建立的強(qiáng)度順序相反。50溶劑的極性51溶劑選擇性甲醇和水性質(zhì)相似（質(zhì)子給予-接受體）將甲醇加入水中，只改變?nèi)苜|(zhì)的k值，而洗脫順序不變。乙腈、THF加入水中不僅改變k值，溶質(zhì)洗脫順序也將發(fā)生變化，顯著改變色譜分離選擇性。52反相色譜的方法開(kāi)發(fā)流動(dòng)相比例流動(dòng)相組成柱溫的影響流動(dòng)相pH值梯度淋洗53流動(dòng)相比例：改變?nèi)萘恳蜃?K樣品： 對(duì)羥基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 對(duì)羥基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)54流動(dòng)相組成：改變選擇性a通過(guò)改變流動(dòng)相改變選擇性同樣強(qiáng)度的不同溶劑55梯

16、度洗脫9個(gè)烷基苯酮化合物的分離56溫度的影響57用反相柱分離離子型化合物分離有機(jī)弱酸、弱堿溶質(zhì)色譜峰拖尾。為什么？怎么辦？離子抑制色譜法通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值，使樣品成中性離子對(duì)色譜法加入“對(duì)離子”，使樣品呈中性58離子抑制色譜（控制pH值的反相色譜）適用于弱酸性化合物的分離降低流動(dòng)相的pH值，使樣品降低離子化使用硅膠基質(zhì)C18填料使用條件應(yīng)在填料基質(zhì)的范圍內(nèi)硅膠柱的pH在2-8（較保險(xiǎn)值3-7）內(nèi)59常用緩沖液及其pH值60應(yīng)用實(shí)例在乙腈/水及pH=7時(shí)，多數(shù)保留時(shí)間很短，無(wú)法完全分離。611958年 氨基酸分析儀 （離子交換色譜的主要應(yīng)用）1975年，離子色譜產(chǎn)生（解決檢測(cè)上的問(wèn)題） 3.

17、3.3、離子交換色譜離子交換色譜此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)相結(jié)合，測(cè)定各類陰、陽(yáng)離子的分離分析方法。它既適于無(wú)機(jī)離子，也適于有機(jī)物分離，如蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等。62無(wú)機(jī)離子分離63生物離子性化合物分離64原理：利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。待測(cè)離子與離子交換樹(shù)脂固定相上帶電荷基團(tuán)或游離的離子發(fā)生可逆交換反應(yīng)：離子交換色譜分離原理65對(duì)陽(yáng)離子，滯留順序?yàn)椋?Fe3+, Ba2+, Pb2+, Sr2+, Ca2+, Ni2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mg2+, Cs+, Rb+, K+, NH4+, Na+, H+,

18、 Li+ 對(duì)陰離子，滯留順序?yàn)椋簷幟仕岣? SO42-, C2O42-, I-, HSO4-, NO3-, CrO42-, Br-, SCN-, Cl-, HCOO-, CH3COO-, OH-, F- 66離子交換色譜固定相陰、陽(yáng)離子交換劑，在有機(jī)高聚物或硅膠上接枝有機(jī)季胺或磺酸基團(tuán)。Styrene-divinylbenzene resinAnionexchangerCationexchanger67 按離子交換劑類型分四種 68離子交換色譜流動(dòng)相為鹽類緩沖溶液(有一定pH和離子強(qiáng)度) 。pH值：影響酸或堿的離解平衡，控制組分離子形式所占的分?jǐn)?shù)。當(dāng)組分以分子形式存在時(shí)，則不被保留；離子分?jǐn)?shù)越

19、高，保留值越大。離子強(qiáng)度I：對(duì)保留值的影響比pH更大。組分保留值受流動(dòng)相中鹽類總濃度控制。有機(jī)溶劑：外加有機(jī)溶劑通常減小組分的保留值。其極性越小，保留值越小。常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、乙腈和二氧雜環(huán)已烷等。離子交換色譜流動(dòng)相693.3.4、離子色譜法(Ion Chromatography,簡(jiǎn)稱IC)離子色譜(IC)是70年代發(fā)展的新方法。以無(wú)機(jī)、特別是無(wú)機(jī)陰離子混合物為主要分析對(duì)象,其分離原理與離子交換色譜原理一樣，只是流出的各種離子用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)。但由于流動(dòng)相都是強(qiáng)電解質(zhì)，其電導(dǎo)率比待測(cè)離子約高2個(gè)數(shù)量級(jí)，這種強(qiáng)背景電導(dǎo)會(huì)完全掩蓋待測(cè)離子信號(hào)。為解決此問(wèn)題，1975年Small 提出，在

20、離子交換柱之后，再串結(jié)一根抑制柱。70抑制柱該柱裝填與分離柱電荷完全相反的離子交換樹(shù)脂。通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變?yōu)榈捅尘半妼?dǎo)的流動(dòng)相，從而可用電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè)各種離子的含量。 例如：分析陽(yáng)離子時(shí)，以無(wú)機(jī)酸為流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂，則發(fā)生下列反應(yīng)： R+OH + HCl(流動(dòng)相)R+Cl- + H2O R+OH + MCl(待測(cè)物) R+Cl + M+OH- 可見(jiàn)，不僅大量酸轉(zhuǎn)化為低電導(dǎo)的水，而且待測(cè)離子轉(zhuǎn)化為具有更大淌度的堿。該法的不足之處在于：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過(guò)抑制柱后會(huì)展寬，降低分離度。因此有人提出了使用電導(dǎo)率很低的溶液(如苯甲酸鹽稀溶液)作流動(dòng)相。71離子色譜連續(xù)抑制裝置圖72離子色譜儀 在離子色譜的基本組成中，重要的和與其他高效液相色譜不同的就是抑制器和電導(dǎo)檢測(cè)器。 離子色譜用的泵是PEEK材料襯里的不銹鋼泵。73在反相色譜流動(dòng)相內(nèi)加入“離子對(duì)”試劑與樣品中可電離的組份形成“對(duì)離