蛋白表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)步驟

1、蛋白表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)步驟蛋白表達(dá)純化實(shí)驗(yàn)步驟（待改進(jìn)）、取適當(dāng)相應(yīng)蛋白高表達(dá)的動(dòng)物組織提t(yī)otal-RNA。、設(shè)計(jì)蛋白表達(dá)引物。引物要去除信號(hào)肽，要加上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)和保護(hù)堿基。、RT-PCR,K0酶擴(kuò)增獲取目的基因cDNA.、雙酶切，將cDNA克隆入PET28/32等表達(dá)載體。5 、 轉(zhuǎn)化到 DH5a 感受態(tài)細(xì)菌中擴(kuò)增提質(zhì)粒。6、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株，挑菌檢測(cè)并保種。表達(dá)菌株如BI21(DE3)、Rosettagami(DE3)、Bl21codon(DE3)等。7、蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)1）將表達(dá)菌株在3mlLB培養(yǎng)基中搖至0D二0?6右，加入IPTG,濃度梯度從2511M到lmMo37度誘導(dǎo)過夜（一般

2、3h以上即有大量表達(dá)）。2）SDS電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。注：目的蛋白包涵體表達(dá)量一般會(huì)達(dá)到菌體蛋白的50%以上，在膠上可以看到明顯的粗大的條帶。3）將有表達(dá)的菌株10%甘油保種，保存lml左右就足夠了，并記錄IPTG濃度范圍。甘油是用0.22um過濾除菌的，儲(chǔ)存濃度一般是30%-60%,使用時(shí)自己計(jì)算用量。4）用上述IPTG濃度范圍的最低值誘導(dǎo)10ml表達(dá),18度,低轉(zhuǎn)速(140-180rpm),誘導(dǎo)過夜作為包涵體檢測(cè)樣品注意:1.如果表達(dá)的蛋白對(duì)困體有毒性，可以在加IPTG之前的培養(yǎng)基中加入1%勺葡萄糖用來抑制本底表達(dá)。葡萄糖會(huì)隨著細(xì)菌的繁殖消耗殆盡，不會(huì)影響后面的表達(dá)。2.保種可以取一部

3、分分成50PI一管，每次用一管，避免反復(fù)凍融。包涵體檢測(cè)。方案見附件2、如有上清表達(dá)，則擴(kuò)大搖菌。1）取保種的表達(dá)菌株先搖10ml,37度,300rpm搖至OD=1.5,約5h左右，視菌種的活性而異，也可過夜搖菌。2）將上一步中的8ml加入300ml培養(yǎng)基中37度,250rpm搖至OD=1.0左右（約2.5h?3h），然后加IPTG（濃度同包涵體檢測(cè)中使用的濃度。）注：菌液濃度要適當(dāng)，否則第二天收集不到足夠的菌體為低溫低轉(zhuǎn)速細(xì)菌生長非常緩慢。，看到有大量云霧狀菌體即，將手指放在瓶底晃動(dòng)，看不清手,不過此法宜受氣泡影響。3)過夜搖菌,使用包涵體檢測(cè)的溫度(18。左),轉(zhuǎn)速140rpm左右。4)將

4、菌液6000rpm,4min,4度離心收集菌體。加入20mMPBS洗一遍后用平衡緩沖液重懸。每250ml菌液用30ml到50ml平衡緩沖液,視菌液的濃度而定。可用4支50ml的離心管同時(shí)離心，但是,離心管要重復(fù)使用，用完后洗凈保存。1) 用 6mm 變幅桿50min 即可。10、超聲波裂解35%功率,3.5s工作,7s休息,注意:1.要冰浴。2.要隨時(shí)觀察裂解情況以防意外。.要將探頭探入到溶液中下部，盡量不要打出大量氣泡。一般溶液量比較大的時(shí)候不會(huì)出現(xiàn)大量氣泡。.正常聲音為：孜孜聲，尖銳刺耳的聲音表明探頭位置不對(duì)或者功率太大或者探頭松動(dòng)等原因，要及時(shí)調(diào)整。溶液由渾濁變清透，由粘稠變不粘稠表明裂

5、解完成（后面3000轉(zhuǎn)離心時(shí),如果沉淀少說明裂解的好）。5.超聲波破碎儀工作30分min要休息5min（即關(guān)閉總電源開關(guān)）。注意:1.如果純化的蛋白較易被蛋白酶降解，在超聲裂解之前要加蛋白酶抑制劑（PMSF）,PMSf工作濃度為1%2.如不能判斷是否裂解完全，就按上述條件裂解60分鐘,60分鐘足夠裂解。1 ） 將破碎好的溶液收集到11、取得上清50ml離心管中。10000rpm,15min,4離心。沉淀為包涵體、細(xì)胞碎片和未破碎的細(xì)胞。輕輕的將上清倒出,盡量不要倒出沉淀。（此時(shí)可以測(cè)量一下pH值,pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就會(huì)在7.5左右。）12、純

6、化上清摸洗脫條件。）鎳柱處理。將1ml鎳柱吸入空層析管中，待其3ml。）將10ml上清加到已經(jīng)平衡過的NI柱上，并將過柱的樣品重復(fù)上樣3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一個(gè)針頭，或者用1ml的槍將膠體吹散。）取20口l過柱后的樣品，以備跑）分別加20mM40mM60mM80mM的咪唑梯度來洗脫雜蛋白。每個(gè)梯度分別4ml、2ml、2ml、2ml。每個(gè)次上樣的液體分前面1ml和后面1ml分別收集入EP管中,以備跑膠。注意：理論上是要將收集的溶液測(cè)量280nm處的吸光度,直到吸光度為零時(shí)再進(jìn)行下一個(gè)梯度的洗脫。實(shí)際上測(cè)不到零，怎么都會(huì)有一點(diǎn)的，上面說的量已經(jīng)做夠洗脫了。)加ElutionBuffer

7、將目的蛋白洗脫。上樣量為4.5ml(將前面的0.5ml單獨(dú)接入EP,再將后面的4ml接入另外兩個(gè)EP管),留跑膠樣品。)加MES將NI柱重生。MES加10ml,流完后再10mlMiliqH2O。流完后保存于2倍體積的20%乙醇中,鎳柱至少能重復(fù)利用6次。(尿素可能對(duì)NI柱有損傷。)注意：所有溶液使用前都要確定其pH是否正確，pH對(duì)掛柱及洗脫影響較大。鎳柱所用溶液MES的ph=5.0,其余EquilibrationBufferpH=7.8,上清pH=7.5,WashBufferpH=7.0,ElutionBufferpH=7.2。13、跑膠驗(yàn)證。1)跑2塊0.75mm的PAGE交,把所有的樣品都

8、加上去,注意兩塊膠的濃分離比要相同兩塊膠才會(huì)比較一致。2)跑膠順序：負(fù)對(duì)照、正對(duì)照、上清、過柱樣品、W1W2W3W4W5W6W7W8W9E1、E2、MES3)300V快速壓膠5min左右,160V分離樣品50min左右。(也可以300V,30min,只是圖沒有160V好看。)4)考馬斯亮藍(lán)染色。一般染色2h即可。5)脫色。先用脫色劑1脫15min,再用脫色劑2脫過夜。14、純化上清收集目的蛋白)將重生的鎳柱再次平衡(即加EquilibrationBuffer3ml)。)重復(fù)步驟12中的操作，只是wash時(shí)只用步驟12中摸好的咪唑濃度洗。、跑膠驗(yàn)證。同步驟13這次膠圖要跑的漂亮一點(diǎn)(用160V)

9、，保存好。、透析1)配制2L透析液(配方見附件1),并放于-20度冰箱預(yù)冷但不要結(jié)冰。)透析袋(剪10cm即可)用透析袋處理液煮沸10min,用MILIQH2O充分洗凈。)用透析夾將透析袋夾住(將透析袋折疊一下會(huì)),將洗脫的蛋白樣品加入其中,置入提前預(yù)冷的500ml透析液(20mMPBS+50mMJaCI)中。冰浴下輕微磁力攪拌20min后置入冰箱1.5h后換液。透析3次即可。注意:用廣口瓶裝透析液，將廣口瓶置于裝有冰的2L大燒杯中。冰浴以防活性降低。17、濃縮。)將透析好的樣品連同透析袋一起放在白色盒子中,用預(yù)冷的聚乙二醇2000固體包埋。)30min后將吸水后呈漿糊狀的聚乙二醇去除加入新的

10、固體聚乙二醇)每隔10min觀察一次,一旦出現(xiàn)渾濁立即停止?jié)饪s。4)透析袋用完后，洗凈，保存于2011醇中40存放。注意：濃縮過度后會(huì)有白色小顆?；蛐鯛罹w出現(xiàn),由于透析袋使溶液成薄層狀，透明度較高，不易發(fā)現(xiàn)小顆?；蛐鯛畛恋恚醋屑?xì)。如果看不到,可根據(jù)自己估計(jì)的蛋白量留1-2ml體積。用透析液將透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分裝后-20度保存。18、超濾法濃縮、透析蛋白。使用超濾法就可省去16、仃兩步。將4mlElution得到的蛋白溶液加入超濾管)配平7400g,30min,4。離心,結(jié)束時(shí)4ml變?yōu)?ml左右。濃縮4倍?？筛鶕?jù)需要選擇不同的離心時(shí)間，以達(dá)到不同的濃縮倍數(shù)。可以幾

11、次的Elution液一起濃縮。4)加入需要的蛋白儲(chǔ)存液至4ml,離心。重復(fù)操作可以使Elution液逐漸換為所需的蛋白儲(chǔ)存液。蛋白儲(chǔ)存液一般用20mMPBS+*mMNaCl或適當(dāng)濃度和pH的tris-HCl溶液。如果蛋白有沉淀達(dá)不到預(yù)定濃度可以添加適當(dāng)?shù)母视停?%-5%即可）助溶。5）收集。將溶液從超濾管中收集到EP管中,標(biāo)記好儲(chǔ)存液的成分，蛋白名稱,蛋白濃度（測(cè)量后）,制備日期。注：超濾管的使用方法見附件419、蛋白濃度測(cè)定。見附件320、蛋白活性測(cè)試。轉(zhuǎn)染細(xì)胞測(cè)量熒光。21、抗原處理。蛋白與弗氏佐劑混合成油包水狀。22、注射兔子。選擇合適的注射方式和合適的免疫程序。、收集免疫血清。提取抗體

12、。、抗體效價(jià)評(píng)定。附件1所需溶液配方：1)20mMPBS:20mMsodiumphosphate,300mMNaCIpH7.4試劑名稱NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量(g)1L0.59285.80219217.532EquilibrationBuffer(平衡緩沖液):PBSwith10mM咪唑pH7.4WashBuffer(清洗緩沖液):PBSwith25mM/50mM/75mM咪唑pH7.4ElutionBuffer(洗脫緩沖液):PBSwith250mM咪唑pH7.4MES(再生緩沖液):20mM2-(N-morpholine)-ethanesulfonic

13、acid,0.1Msodiumchloride;pH5.0。即0.3904gMES+0.5844gNaCl.透析袋處理液:2%(w/v)碳酸氫鈉和1mmol/L(pH8.0)EDTA透析液:20mMPBS+50mMNaCI(2.92g)試劑名稱NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCI用量(g)1L0.59285.8021922.92gTIPS:14 的溶液可以一起配制。先配10ml 8M的咪口坐。再配1L的PBS,用500ml水將濃度(L4mg/mi0.6mg/hil0.8mg/mJRSA(img)172p1!08p1J44pIH2OI44|j1JOK|J(7即11試劑溶解，

14、取兩個(gè)50ml和一個(gè)150ml分別加到兩個(gè)100ml瓶子和一個(gè)500ml瓶子中，作為WashBuffer、日utionBuffer和EquilibrationBuffer,再向其分別加入適當(dāng)體積的8M咪唾。最后,定容。WashBufferElutionBuffer各配了100ml,EquilibrationBuffer配了300ml。PBS配了500ml。附件2包涵體檢測(cè)搖10ml菌，加0.5%葡萄糖和相應(yīng)抗性。培養(yǎng)至OD600=0.5后離心加入新的培養(yǎng)基和相應(yīng)濃度的IPTG低溫（16-25度）誘導(dǎo)過夜（也可不離心,在原來LB中直接加IPTG）。在離心前取500uI菌液作為負(fù)對(duì)照，誘導(dǎo)完成后取

15、500微升作為正對(duì)照。正負(fù)對(duì)照不用超聲波裂解，直接煮沸10min跑膠。誘導(dǎo)完成后,用2mlEP管6000rpm,2min,4度,收集10ml菌液。1.5mlPBS(50mMPBS,300mMNaCI)重懸細(xì)菌。裂解細(xì)胞。用超聲波破碎細(xì)胞直到懸液變清亮一般15到30min。裂解3s,停止6s,裂解時(shí)冰上放置。分離上清。5000rpm,4min,4。除去未裂解的細(xì)菌和大的細(xì)菌碎片。然后,10000rpm,10min,4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中,加5微5*SDSloadingbuffer混勻,煮沸10min。重懸包涵體。用1000微PBS震蕩重懸包涵體

16、,取20微于200微的EP管中加5微5*SDSloadingbuffer,煮沸10min。正負(fù)對(duì)照的收集。離心收集正負(fù)對(duì)照菌體,0.5ml上清留下40p1,加入10Pl5*SDSIoadingbuffer,煮沸10min裂解。跑聚丙烯酰胺凝膠。將正負(fù)對(duì)照及實(shí)驗(yàn)樣品一起跑膠。一般順序是：-,+,上清,包涵體.附件3蛋白濃度定量測(cè)試方案將染色劑稀釋。稀釋5倍,取4ml染色劑于50ml離心管中，加16mlmiliqH2O.充分溶解后用0.44Pm的濾膜過濾于另50ml離心管中。（此劑量可測(cè)4個(gè)樣品。）牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品的制備）將凍干的BSA溶于去離子水中，溶解成濃度為1mg/m1,分裝為4

17、00-500P1/支（可以60天,-20度長期保存）將1mg/ml的BSA分別稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml,各180Pl,另外加一管水為.染色。取1.5ml已過濾的染色劑分別加入13支（其中4支為待測(cè)樣品）1.5mlEP管中。4個(gè)梯度各做一個(gè)重復(fù),共8支,另外加1個(gè)樣品（或1+n個(gè)樣品）和1個(gè)blank,共10支EP管（或10+n支）,分別對(duì)應(yīng)標(biāo)記。將30PI樣品和30PI標(biāo)準(zhǔn)BSA及30PIH2O分別加入上述EP管中。渦旋混勻。）室溫孵育5min到60min。5min后即開始測(cè)量，在60min內(nèi)測(cè)完,越快越好,因?yàn)锳bsorbaneewilincreaseovertime吸

18、光度的測(cè)量。600nm處測(cè)量，并記錄吸光度。注意:1.blank是染色液加30微升的水。2.從低濃度測(cè)量到高濃度。根據(jù)混合液的顏色大致判斷sample的濃度范圍，據(jù)此決定sample的測(cè)量順序。.比色皿的洗滌。用10011醇浸泡洗滌。.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。利用excel工具取標(biāo)準(zhǔn)品的平均值制作線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。附件4.4mlmillipore超濾離心管使用注意事項(xiàng)1.用前用miliq水潤濕。2.4度預(yù)冷。離心力不能超過7500g。加速度設(shè)定為8.離心時(shí)將離心管的兩膜片豎直到與地面垂直的角度后開始離心，以使兩膜所受的壓力一致。使用完畢后，用miliq水洗凈，加入1ml0.1NNaOH泡24h,后加入

19、1ml20率云醇保存。如果要短期保存幾天，也可加水浸泡。附件5聚丙烯酰胺凝膠的制備及使用方法附件6.包涵體蛋白的提純與提上清中所用試劑不同之處：在EquilibrationBuffer、WashBuffer、ElutionBuffer中各加了6M尿素或鹽酸胍。尿素或鹽酸胍用來溶解包涵體蛋白。在裂解完后，離心時(shí)先3000rpm3min去除未裂解的細(xì)胞和大的碎片，再10000rpm15min離心，沉淀就是包涵體。用加了6M尿素或鹽酸瓜的EquilibrationBuffer溶解包涵體。后面的步驟跟提上清蛋白一致，只是所用EquilibrationBuffer、WashBuffer、ElutionBuffe