微生物限度檢查及控制-王旭

1、微生物限度檢驗及控制2009教程目的GMP檢查中常見的缺陷微生物限度檢查的定義微生物限度檢查的樣品處理微生物限度檢查用培養(yǎng)基及其靈敏度檢查微生物限度檢查方法和驗證1 GMP檢查中常見的缺陷XXX止咳糖漿中含有防腐劑，但成品的微生物限度檢驗操作規(guī)程未嚴格按照2000年版中國藥典的要求制定，未考慮到防腐劑對試驗的影響，檢驗方法不合理。純化水微生物限度檢測方法未驗證，實際檢測方法不合理，樣品被稀釋了1660倍后再用直接接種法進行檢測。微生物限度檢查的原始記錄缺少所用培養(yǎng)基的名稱、配制批號。注射用水、純化水檢測中，未按2005版藥典要求進行霉菌和酵母菌數(shù)的檢驗。2. 定義 測定所有藥用材料（從原料到成

2、品）中需氧微生物的數(shù)量的方法。證明所有藥用材料（從原料到成品）中無特定微生物的方法。3. 取樣及樣品處理我們期望什么?在整批產(chǎn)品中特定微生物的數(shù)量。我們做的是什么測試?限度是一個破壞性的實驗 我們不能對整批進行100%檢驗。如何通過檢驗來證明整批產(chǎn)品的微生物數(shù)量？要求有一個取樣計劃來涵蓋整個批號。有足夠的取樣量和檢驗量無抑菌因素如何對批進行取樣？樣品必須具有批代表性：最易污染的位置取樣：批開始、結(jié)束及重大故障和調(diào)整后連續(xù)性隨機性上述取樣過程要有文件規(guī)定和記錄3.1 取樣及樣品處理_ 取樣計劃取多少樣 （檢驗數(shù)量）?藥典規(guī)定檢定量是：10克或10毫升同時要考慮檢驗損耗和復試3.2 取樣及樣品處理

3、_ 取樣量目的溶解：避免讀數(shù)時的干擾勻質(zhì)：保證檢驗量消除抑菌因素：提高檢驗靈敏度3.3 取樣及樣品處理_ 供試液的制備方法:10ml/g樣品，加無菌氯化鈉蛋白胨至100ml, 1小時內(nèi)使用3.3 取樣及樣品處理_ 供試液的制備無抑菌性水溶性液體樣品：無需處理無抑菌性油性液體樣品：加聚山梨酯20、80; 乳濁液（45,70%。藥典無要求檢查頻率：每次滅菌批（至少滅菌參數(shù)變更后4.3 微生物限度檢查用培養(yǎng)基_ 保存應(yīng)規(guī)定保存有效期: 在密閉容器中一年，非密閉容器中一月2-25保存確保pH在密閉容器中保存使用三種微生物培養(yǎng)基有效控制微生物培養(yǎng)基的保存和效期4.4 微生物限度檢查用培養(yǎng)基_結(jié)論5. 微

4、生物限度檢查方法藥典規(guī)定兩種方法:平皿法: 加1ml樣品制備液至無菌平皿中，倒15-20ml, 45培養(yǎng)基混勻倒置培養(yǎng) 。至少制備2個平板?？刂凭鋽?shù)在30-100CFU（細菌），30-80CFU（真菌）薄膜過濾法 ：制備液用0.45m膜過濾并用3x100ml無菌蛋白胨水淋洗后，菌面朝上貼與培養(yǎng)基上。每種培養(yǎng)基制備一張膜控制菌落數(shù)100CFU /膜若樣品本身的混濁，會干擾計數(shù)結(jié)果要考慮對樣品中抑菌因素進行中和0.5大豆磷脂4聚山梨醇酯由于接種量限制，試驗靈敏度受局限操作簡便，設(shè)備要求低5.1 微生物限度檢查方法_平皿法操作復雜，設(shè)備要求高不適用于無法溶解的樣品大體積檢驗量，檢驗靈敏度不受局限樣

5、品中的抑菌因素可被濾除中和試劑可應(yīng)用在淋洗液中，如：-內(nèi)酰胺酶分散劑可作為溶劑，如十四烷酸異丙酯5.2 微生物限度檢查方法_薄膜過濾法 兩種方法的共同點: - 培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度 - 培養(yǎng)時間 - 工作環(huán)境：100級區(qū)域進行（一般是要求與生產(chǎn)的潔凈條件一致）5.3 微生物限度檢查方法TSB培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)2天金葡菌：劃線甘露醇氯化鈉瓊脂3035，培養(yǎng)1天。革蘭氏染色顯微觀察。 無陽性球菌大腸、沙門和綠膿：劃線麥康凱瓊脂3035，培養(yǎng)1天，革蘭氏染色顯微觀察。 無陰性桿菌 控制菌檢查:5.4 微生物限度檢查方法方法驗證試驗 _ 證明在試驗條件下沒有抑菌作用，如：防腐劑，抗生素，中和劑，表面活性劑，

6、 下列情況應(yīng)進行重新驗證：檢驗方法變更培養(yǎng)基變更（包括，滅菌參數(shù)變更）產(chǎn)品處方變更菌種：大腸、金葡、枯草、白念、黑曲霉、控制菌5.5 微生物限度檢查方法_ 方法驗證方法驗證試驗 _ 證明在試驗條件下沒有抑菌作用，如：防腐劑，抗生素，中和劑，表面活性劑， 下列情況應(yīng)進行重新驗證：檢驗方法變更培養(yǎng)基變更（包括，滅菌參數(shù)變更）產(chǎn)品處方變更挑戰(zhàn)菌液：大腸、金葡、枯草，稀釋至50-100cfu/ml待用白念、黑曲霉，稀釋至30-80cfu/ml待用5.5 微生物限度檢查方法_ 方法驗證驗證方法：試驗組：挑戰(zhàn)菌液樣品制備后進行試驗供試品對照組：樣品制備后進行試驗菌液組：挑戰(zhàn)菌液進行試驗空白對照組：直接用稀

7、釋液進行試驗5.5 微生物限度檢查方法_ 方法驗證驗證合格標準細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)試驗空白對照組無菌生長菌液組無雜菌生長（試驗組供試品對照組）菌液組70控制菌檢查試驗空白對照組無菌生長菌液組無雜菌生長對試驗組的菌落鑒定，確認是所接種挑戰(zhàn)菌株5.5 微生物限度檢查方法_ 方法驗證報告：（平均計數(shù)稀釋倍數(shù)）若在1:10稀釋樣品中沒有檢出，報告10cfu/g(ml)若平均值有小數(shù)，應(yīng)取整數(shù)后乘稀釋倍數(shù)，例如：1:10稀釋樣品：平板1: 1cfu; 平板2：0cfu; 平均為0.5報告結(jié)果是10cfu/ml, 而不是5cfu/ml5.6 微生物限度檢查方法_ 結(jié)果判斷結(jié)論:有三種檢驗方法，但所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、時間相同檢驗方法應(yīng)驗證證明，在試驗條件下沒有抑菌效應(yīng)5.7 微生物限度檢查方法_ 結(jié)論培養(yǎng)基:細菌: 大豆胰蛋白瓊脂， 30-35 ，培養(yǎng)48小時霉菌酵母：沙氏葡萄糖， 20-25 ，培養(yǎng)5天6. 微生物限度檢查_USP 介紹 美國藥典：多管法6. 微生物限度檢查_USP 介紹 中國藥典中對控制菌檢查有類似方法要考慮對樣品中抑菌因素進行中和0.5大豆磷脂4聚山梨醇酯由于接種量限制，試驗靈敏度受局限操作復雜，設(shè)備要求高適用于無法溶解的樣品6. 微生物限度檢查_USP 介紹 美國藥典：多管法6. 無菌檢驗USP 29 Ph.eur supplement 6