微生物遺傳-結(jié)合轉(zhuǎn)移

1、細(xì)菌質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移 三親本雜交微生物遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)原理：1、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性細(xì)菌的遺傳重組有接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)三種主要方式。 接合轉(zhuǎn)移是指供體和受體細(xì)胞間直接接觸，質(zhì)粒DNA從供體向受體轉(zhuǎn)移的過程。質(zhì)?？煞譃榭赊D(zhuǎn)移質(zhì)粒和非轉(zhuǎn)移質(zhì)粒兩類，轉(zhuǎn)移質(zhì)粒帶有完整的編碼轉(zhuǎn)移酶的 tra 基因,質(zhì)粒能自主地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞,甚至還能帶動(dòng)供體細(xì)胞的染色體 DNA 向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移，這類質(zhì)粒常被稱為自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。如大腸桿菌的 F 質(zhì)粒。有些質(zhì)粒不含 tra 基因,但含有質(zhì)粒轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT，雖不能自主轉(zhuǎn)移，但能被其他一些含完整 tra 基因的質(zhì)粒所誘動(dòng),這類質(zhì)粒又被叫做可誘動(dòng)質(zhì)粒。23實(shí)驗(yàn)原理：2、

2、本實(shí)驗(yàn)所用供體質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)中要轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒是pHN102，它是在廣宿主范圍的穩(wěn)定載體pTR102 中插入生物發(fā)光酶基因luxAB 構(gòu)建而成。pTR102中帶有含 par 基因的穩(wěn)定性片段（stabillty）,它能在較多革蘭氏陰性細(xì)菌中穩(wěn)定存在，它含有質(zhì)粒轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)oriT，不含完整的轉(zhuǎn)移基因 tra，必須在含有 tra 基因的輔助菌株誘動(dòng)下， pTR102 才能從供體菌向受體菌轉(zhuǎn)移。為有效篩選轉(zhuǎn)移接合子 (transconjugant), pHN102 質(zhì)粒上帶有 Tc 抗性和生物 發(fā)光酶基因( lux AB）兩個(gè) 標(biāo)記。加入lux AB的底物癸醛 （Decanal）后，菌體可發(fā)出 微弱熒光。

3、4實(shí)驗(yàn)原理：3、三親本雜交本實(shí)驗(yàn)中的輔助菌株是E. coli (pPK2073） ， pPK2073中帶完整的 tra 基因，將已活化的供體菌、協(xié)助菌與受體菌混合起來，使菌體細(xì)胞緊密接觸，供體菌中的質(zhì)粒（ pHN102 ）可以在協(xié)助菌的幫助下通過接合轉(zhuǎn)移方式導(dǎo)入受體菌（費(fèi)氏中華根瘤菌Sinorhizobium fredii ）中。因此該接合轉(zhuǎn)移過程稱為三親本雜交。 實(shí)驗(yàn)菌株供體菌：E.coli DH5(pTR102-luxAB) (TcR、luxAB) 受體菌: Sinorhizobium fredii ( Tc S)輔助菌: E. coli MM294 (pRK2073)（SpecR） 實(shí)驗(yàn)

4、產(chǎn)物轉(zhuǎn)移接合子: S. fredii (pTR102-luxAB), (TcR，luxAB)5實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備菌株活化（教師做）： 將受體、供體、輔助菌分別培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期： E. coli (pTR102-luxAB): 液體LB + Tc 20g/ml, 37OC震蕩培養(yǎng)1夜； S. fredii : TY液體, 28OC震蕩培養(yǎng)2天 ； E. coli (pPK2073) : 液體LB + Spe 50g/ml ,37OC震蕩培養(yǎng)1夜倒平板（學(xué)生做）：第1、2組：倒不加Tc的SM（平皿上標(biāo)記“純SM” ）： 融化SM后，每瓶加混合維生素0.2ml（裝在1.5ml離心管中，標(biāo)記“維”)，混勻倒平板，3

5、瓶250ml的培養(yǎng)基共倒3640皿。凝固后，報(bào)紙包好，放冰箱冷藏室（4OC）備用。第3、4組：倒TY平板： 融化1瓶TY固體, 倒平板12-13個(gè), 凝固后分發(fā)到4個(gè)超凈臺(tái)使用。第5、6組：倒SMTc平板（平皿上標(biāo)記“SMTc” ） ： 融化SM后，每瓶加混合維生素0.2ml和四環(huán)素0.5ml （Tc,10mg/ml,裝在1.5ml離心管中，標(biāo)記“Tc” ），混勻倒平板，3瓶250ml的培養(yǎng)基共倒3640皿。凝固后，報(bào)紙包好，放冰箱冷藏室(4OC) 備用。 6操作步驟：三菌混合培養(yǎng)（第1天）(1)吸取供體菌、輔助菌各 0.4ml，吸受體菌0.6ml，都加入同一個(gè)1.5ml離心管內(nèi)（每個(gè)同學(xué)做1

6、管），8000轉(zhuǎn)/min 離心1分鐘。 (2) 倒上清，向沉淀加 1ml 的 TY液體，用 tip上下抽吸，洗滌菌體，再8000轉(zhuǎn)/min離心1分鐘，倒上清，留沉淀。 (3) 用鑷子取滅菌濾紙片貼于已準(zhǔn)備好的TY平板上（每個(gè)同學(xué)1片，3片/平板，平皿背面標(biāo)記姓名），用200l的 tip 抽吸離心管內(nèi)沉淀的菌體，打散成濃菌液，將之加到濾紙片中央（切勿傾斜平板，以免菌液流出濾紙片以外） (4) 加好菌液后，靜置510分鐘，待濾紙上的培養(yǎng)基液體被平板吸收后，倒置放培養(yǎng)箱，28OC培養(yǎng)1天。7操作步驟：洗菌涂平板（第2天）（1）滅菌小PA瓶中加5ml無菌水(1瓶/人), 鑷子揭下TY平板上的濾紙片，放入瓶中，在震蕩混勻器上充分打散菌體。（2）向1.5ml管加0.9ml無菌水,加0.1ml已打散的菌液,混勻。（3）吸已稀釋的菌液分別涂布于昨日倒的 SM+Tc 平板和不加 Tc的純SM上（每個(gè)同學(xué)各涂1板， 200l / 板）（