實(shí)驗(yàn)二蔬菜中胡羅卜素的測(cè)定紙層析法營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生

1、實(shí)驗(yàn)二蔬菜中胡羅卜素的測(cè)定 (紙層析法) 營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)學(xué)系1一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^本次實(shí)驗(yàn)掌握用紙層析法分析蔬菜中胡蘿卜素的含量 。2二、原理蔬菜的植物色素包括葉綠素、葉黃素及胡蘿卜素等，它們能被丙酮、石油醚溶液提取出來(lái)。將樣品提取液進(jìn)行紙上層析，由于胡蘿卜素極性最小，移動(dòng)速度最快，從而與其他色素分離；剪下含胡蘿卜素的區(qū)帶，洗脫后于450nm波長(zhǎng)下定量測(cè)定。3三、方法 （一）儀器：組織搗碎機(jī)層析缸：可用標(biāo)本缸代替（內(nèi)徑10cm、高25cm）分光光度計(jì)恒溫水浴鍋點(diǎn)樣器或微量注射器新華濾紙：定性，快速或中速，16cm20cm 4（二）試劑（1）石油醚(沸程3060，分析純)：同時(shí)是展開劑。（2）丙酮

2、：分析純。（3）丙酮石油醚混合液：37(V/V)。（4）無(wú)水硫酸鈉：分析純。（5）5%硫酸鈉溶液。（6）胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液：取50mg 胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，溶于數(shù)ml氯仿中，然后以石油醚稀釋至100ml，其濃度約為500g/ml，將此溶液稀釋10倍，即得50g/ml得胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。 5（三）樣品的采集和處理（1）糧食：樣品用水洗三次，置60烤箱中烤干，磨粉，儲(chǔ)于塑料瓶?jī)?nèi)，放一小包樟腦精，蓋緊瓶塞保存，備用。（2）蔬菜與其他植物性食物：取可食部用水沖洗三次后，用紗布吸去水滴，切碎，用勻漿器制成勻漿，貯于塑料瓶?jī)?nèi)，冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?6四、操作步驟以下步驟需在避光條件下進(jìn)行（1）樣品提?。喝∵m量樣品

3、，相當(dāng)于原樣15g(含胡蘿卜素約2080g)的勻漿，置100ml帶塞錐形瓶中，加入丙酮20ml，石油醚5ml，振搖1min，靜置5min。（2）在150ml分液漏斗中，放入5硫酸鈉溶液30ml。（3）將錐形瓶?jī)?nèi)的提取液小心移入上述分液漏斗中，再于錐形瓶中加入10ml丙酮石油醚混合液（3：7），振搖1min，靜置5min，將提取液并入分液漏斗中。如此反復(fù)提取23次，直至提取液無(wú)色為止。（4）振搖分液漏斗，放置分層后，棄去下層水溶液。再用5%硫酸鈉溶液15ml振搖洗滌，反復(fù)進(jìn)行三次，直至下層水溶液清亮為止，目的是除盡丙酮，防止乳化。 7四、操作步驟（5）將石油醚提取液通過盛有10g無(wú)水硫酸鈉固體的

4、小漏斗，濾入瓷蒸發(fā)皿。用少量石油醚分?jǐn)?shù)次洗凈分液漏斗和無(wú)水硫酸鈉層內(nèi)的色素，洗滌液合并瓷蒸發(fā)皿中。（6）將瓷蒸發(fā)皿置于低溫電熱板上蒸發(fā)至約1ml時(shí)，取下，待其自然揮干。冷卻后置于冰裕上，立即用石油醚2ml沿蒸發(fā)皿壁將色素洗下，混勻立即點(diǎn)樣。（7）層析點(diǎn)樣：準(zhǔn)確吸取待檢液40l在濾紙下端基線上A、B兩點(diǎn)之間或C、D兩點(diǎn)之間迅速來(lái)回進(jìn)行帶狀點(diǎn)樣一次點(diǎn)完（見圖1）。每個(gè)樣品點(diǎn)2帶作為平行樣。8展開：待紙上所點(diǎn)樣液自然揮發(fā)干后，將濾紙卷成圓筒狀，用定書機(jī)固定兩邊，置于預(yù)先用石油醚飽和的層析缸中（見圖2），進(jìn)行上行展開。（注意紙紋方向與展開方向一致；缸內(nèi)石油醚深度約1cm即可，樣斑不能直接接觸石油醚。9

5、（8）洗脫：待胡蘿卜素與其他色素完全分開后，取出濾紙，自然揮發(fā)干石油醚，將位于展開劑前沿的胡蘿卜素層析帶剪下，立即放入盛有5ml石油醚的具塞試管中，用力振搖，使胡蘿卜素完全溶入溶劑中。（9）比色：用1cm比色杯，以石油醚調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于450nm波長(zhǎng)下，測(cè)吸光度。（10）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取濃度為50g/ml的胡蘿卜素應(yīng)用液2ml放入100ml具塞錐形瓶中，以下操作步驟與樣品19項(xiàng)相同，但點(diǎn)樣體積分別為20l、40l、60l、80l和100l，相當(dāng)于含胡蘿卜素1、2、3、4、5g。比色后，以胡蘿卜素含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 10五、計(jì)算 式中：X2樣品中胡蘿卜素的含量，以胡蘿卜素計(jì)，mg/100g； c在標(biāo)準(zhǔn)曲線上所查得的胡蘿卜素的含量，g； V1點(diǎn)樣體積，ml； V2加入瓷蒸發(fā)皿內(nèi)的樣品石油醚提取液濃縮后的定容體積，ml； m樣品質(zhì)量，g。11六、注意事項(xiàng)樣品搗碎時(shí)加水不能太多，否則不僅提取困難，還不容易得到均勻樣品。濾紙層析一結(jié)束，應(yīng)立即從層析缸中取出，并盡快剪下胡蘿卜層析帶進(jìn)行洗脫，以免氧化使結(jié)果偏低。本方法適用于植物性食物和含有植物性食物的混合食物中胡蘿卜素的測(cè)定，其最小檢出限為0.11g。結(jié)果的允許差：同一實(shí)驗(yàn)室平行測(cè)定或重復(fù)測(cè)定結(jié)果的相