KRAS與免疫治療的療效關(guān)系

1、免疫治療對(duì)抗KRAS突變的希望之光引言：KRAS屬于Ras基因家族主要成員之一，KRAS基因突變占非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)總數(shù)的20-30%，肺腺癌較高，肺鱗癌中不常見，位于EGFR信號(hào)通路的下游1。肺癌中的KRAS突變似乎與EGFR和ALK易位互不相容，眾多研究顯示，KRAS基因突變是影響TKI藥物療效的不利因素2。KRAS基因突變主要發(fā)生在外顯子2、3、4上，其中KRAS基因外顯子2、3變異對(duì)EGFRTKI類藥物敏感性降低，即吉非替尼、厄洛替尼的效果受限3。此外KRAS基因被激活的方式是點(diǎn)突變，多發(fā)生在N端的第12、13和61、146密碼子，其中以第12密碼子突變最常見4。目前并沒有治療

2、KRAS基因突變的晚期非小細(xì)胞肺癌藥物，各大公司的研究重點(diǎn)也都集中在KRAS的下游通路上，如MEK，CDK4/6以及免疫治療5。KRAS的不可成藥性和藥物開發(fā)的探索：為什么RAS長(zhǎng)期以來被認(rèn)為不可成藥？這要從其結(jié)構(gòu)，工作原理和調(diào)控機(jī)制說起。RAS主要有三個(gè)亞型HRAS、KRAS和NRAS,其中KRAS通過RNA剪接又表達(dá)兩個(gè)不同的蛋白KRAS4A和KRAS4B6。RAS蛋白是一種21kDa大小，位于細(xì)胞膜上的，擁有GTPase酶活性的鳥嘌吟核苷結(jié)合蛋白7。RAS是GDP/GTP循環(huán)控制的二進(jìn)制分子開關(guān)：GDP結(jié)合時(shí)處于“關(guān)”的狀態(tài)，而GTP結(jié)合則代表“開”的狀態(tài)。沒有刺激信號(hào)時(shí)，這種開關(guān)狀態(tài)的

3、轉(zhuǎn)換非常緩慢。接收到信號(hào)后，鳥苷酸交換因子GEFs被招募到細(xì)胞膜上與RAS結(jié)合并釋放GDP7。由于細(xì)胞中GTP的濃度遠(yuǎn)高于GDP,RAS蛋白迅速結(jié)合GTP，招募其下游信號(hào)通路的效應(yīng)蛋白進(jìn)入開的狀態(tài)。在GAPs(GTPaseactivatingprotein)的作用下，RAS的GTPase的活性被提高上千倍，其結(jié)合的GTP被水解成GDP，RAS重新進(jìn)入GDP結(jié)合的“關(guān)”的狀態(tài)，從而完成一個(gè)完整的循環(huán)7。RAS分子開關(guān)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)也得到了很好地闡釋。RAS蛋白1-166個(gè)氨基酸組成G-domain，這個(gè)結(jié)構(gòu)域在各亞型中高度保守，余下的23-24個(gè)氨基酸組成高度可變區(qū)(HVR)。D-domain帶有R

4、AS的核苷酸結(jié)合口袋,包括P-loop(殘基10-17)，SwitchI(殘基30-38)和SwitchII(殘基60-67)等區(qū)域8。從其名字可以判斷，SwitchI和II是RAS功能切換的關(guān)鍵。如圖1所示，GTP結(jié)合活性狀態(tài)時(shí)，GTP分子中Gamma磷酸分別與SwitchI的T35和SwitchII的G60形成氫鍵，像彈簧一樣將它們拉在一起。一旦GTP被水解，Gamma位磷酸被水解掉，SwitchI和II被分開，回到GDP結(jié)合的非活性構(gòu)象9-io。從上述描述可以看出GTP水解是淬滅RAS活性的關(guān)鍵步驟11。不難想象，如果基因突變抑制了GTP水解，RAS蛋白將被鎖在激活狀態(tài)。正因?yàn)槿绱?，RA

5、S最常見的突變就發(fā)生在G12、G13和Q61三個(gè)位置。前面提到RAS高效水解GTP需要GAP蛋白參與，GAP與RAS結(jié)合后，將一個(gè)精氨酸(arginine)殘基伸到催化位點(diǎn)，協(xié)助水解，這個(gè)殘基被稱作精氨酸手指(argininefinger)12。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究表明，除了脯氨酸，G12或G13替換成任何氨基酸，立體位阻將阻礙精氨酸手指進(jìn)入催化位點(diǎn)。Q61則是直接參與水解過程，協(xié)助定位一個(gè)水分子，穩(wěn)定水解反應(yīng)的過渡態(tài)。其它突變還有與GDP結(jié)合相關(guān)的氨基酸如A146比較有意思的是，雖然各個(gè)亞型的D-domain和功能高度類似，但腫瘤中發(fā)現(xiàn)的RAS突變主要集中在KRAS(85%)，NRAS(12%)次

6、之，HRAS(3%)最少13。最近的研究也許提供了部分解釋，研究發(fā)現(xiàn)KRAS4B而不是其它亞型通過HVR區(qū)域與calmodulin結(jié)合，從而抑制非經(jīng)典Wnt通路，有利于保持腫瘤細(xì)胞的干性狀態(tài)14。簡(jiǎn)單來說為什么RAS難以成藥，首先，RAS各個(gè)亞型的D-domain高度類似，直接靶向RAS很難達(dá)到高度選擇性15；第二，小分子藥物最常見的是抑制酶的活性，但RAS比較特殊，GTP水解酶與其功能反相關(guān)，需要開發(fā)酶的激活劑；第三，藥物分子無法與底物競(jìng)爭(zhēng)，因?yàn)镽AS與GTP的親和力常數(shù)達(dá)到皮摩爾(picomolar)級(jí)別，而細(xì)胞中GTP的濃度高達(dá)0.5mMi6；第四，除了不可逾越的核苷酸口袋，RAS蛋白其

7、它地方缺乏有利于小分子結(jié)合的口袋；第五，RAS的調(diào)控和功能執(zhí)行都是通過蛋白-蛋白的相互作用實(shí)現(xiàn)的，很難通過小分子干預(yù)17。這些蛋白相互作用發(fā)生在細(xì)胞膜內(nèi)，單抗等大分子難以觸及。因?yàn)檫@些原因，制藥界早期將注意力轉(zhuǎn)移到RAS的高度可變區(qū)(HVR)18。HVR是RAS用來定位細(xì)胞膜的區(qū)域，末端包含CAAX系列19。RAS蛋白合成后，要進(jìn)行一系列修飾才能進(jìn)入細(xì)胞膜OCAAX系列的Cys被異戊烯化(prenylation)后,AAX被轉(zhuǎn)化酶RCE1切除，最后Cys的羧基被甲基轉(zhuǎn)移酶ICMT所甲基化20。細(xì)胞膜定位對(duì)于RAS的功能至關(guān)重要，其調(diào)節(jié)蛋白如GEFs、GAPs以及各種效應(yīng)蛋白都依賴細(xì)胞膜移位(t

8、ranslocation)進(jìn)行調(diào)控21。讓人沒想到的是，抑制RCE1和ICMT有時(shí)反而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，原因還不太清楚。其實(shí)抑制RAS通路的某個(gè)環(huán)節(jié)造成反向激活(paradoxicalactivation)還比較常見，比如Raf和MEK抑制劑中都發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象22，這也是RAS藥物開發(fā)的難點(diǎn)。（圖一KRAS信號(hào)通路與蛋白水解活性示意圖）免疫治療是否能為KRAS突變患者另辟蹊徑呢？最近舉行的ESMO免疫腫瘤學(xué)大會(huì)上報(bào)道了帕博利珠單抗的兩個(gè)探索性分析，分析結(jié)果顯示帕博利珠單抗單藥或聯(lián)合化療一線（初始）治療KRAS突變非鱗非小細(xì)胞肺癌療效良好，客觀緩解率40%以上。研究人員對(duì)KEYNOTE-O42研

9、究的數(shù)據(jù)進(jìn)行探索性分析23。分析結(jié)果顯示在有進(jìn)行基因檢測(cè)的301例患者中，69例（23%）為KRAS突變，包括了29例（10%）的KRASG12C突變。KRAS突變患者與非KRAS突變患者相比，PD-L1表達(dá)和TMB（腫瘤突變負(fù)荷）更高中位PDL1TPS中位TMEKRAS突變6側(cè)191mui/exome非KRAS突變35嗾105mut/exomeKEYNOTE-042研究中KRAS突變與非KRAS突變PD-L1和TMB對(duì)比）PD-L1表達(dá)和TMB越高，通常免疫治療效果越好，那帕博利珠單抗治療KRAS突變患者實(shí)際療效如何呢？詳見下表：KRAS突變KRASG12C突變非KRAS突變帕博利珠單抗單藥

10、N=30化療N=39帕博利珠單抗單藥N=12化療N=17帕博利珠單抗單藥N=127化療N=105ORR%56.71866.723.529.121mPFSm12615666PFSHR0.51(0.29-0.87)0.27(0.10-0.71)1.00(0.75-1.34)mOSm2811NR81512OSHR0.42(0.22-0.81)0.28(0.09-0.86)0.86(0.63-1.18)（表二KRAS突變與帕博利珠單抗單藥治療的療效，NR為未達(dá)到）從上表可見，KRAS突變患者，包括KRASG12C突變患者帕博利珠單抗單藥治療的療效優(yōu)于化療，也優(yōu)于非KRAS突變患者。研究人員也對(duì)KEYN

11、OTE-189研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行探索性分析24這是一個(gè)帕博利珠單抗聯(lián)合培美曲塞+鉑類化療一線治療非鱗非小細(xì)胞肺癌的臨床研究。分析結(jié)果顯示在有進(jìn)行基因檢測(cè)的289例患者中，89例（31%）為KRAS突變，包括了37例（13%）的KRASG12C突變。KRAS突變患者與非KRAS突變患者相比，PD-L1表達(dá)和TMB（腫瘤突變負(fù)荷）更高。中位PDL1TPS中位TMEKRAS突變30K204mut/exome非KRAS突變5%141mut/exame（表三KEYNOTE-189研究KRAS突變與非KRAS突變患者PD-L1和TMB對(duì)比）Public帕博利珠單抗聯(lián)合化療治療KRAS突變患者療效如何呢？詳見下

12、表:KRAS突變KRASG12C突變非KRAS突變帕博利珠單抗+化療N=59安慰劑+化療N=30帕博利珠單抗+化療N=26安慰劑+化療N=11帕博利珠單抗+化療N=145安慰劑+化療N=55ORR%40.726.75018.247.610.9mPFSm9511595PFSHR0.47(0.29-0.77)0.48(0.22-1.06)0.40(0.29-0.57)mOSm21141825239OSHR0.79(0.45-1.38)1.14(0.45-2.92)0.55(0.37-0.81)（表四KRAS突變與帕博利珠單抗+化療治療的療效，NR為未達(dá)到）從上表可見，KRAS突變患者，帕博利珠單抗

13、+化療療效總體也優(yōu)于化療，但是KRASG12C突變患者帕博利珠單抗+化療的總生存期獲益與化療沒有明顯差異，這可能是因?yàn)榛熃M患者數(shù)量較少造成。我們可以看到KRASG12C突變化療組的中位總生存期為25個(gè)月，這遠(yuǎn)優(yōu)于歷史數(shù)據(jù)，不代表普遍情況24。KRAS藥物開發(fā)的展望1）首先，考慮靶向其它RAS突變，比如最常見的G12D和G12V。因?yàn)檫@類蛋白缺乏合適的Cys或者其它非天生的可共價(jià)結(jié)合的氨基酸，要取得足夠的活性和選擇性比較困難。今年8月份報(bào)道了一個(gè)納摩爾活性的結(jié)合在Switch區(qū)域的非共價(jià)抑制劑BI-2852。機(jī)制上不同于G12C抑制劑，這個(gè)化合物可以同時(shí)抑制活性和非活性狀態(tài)RAS，且不限于G1

14、2C。令人遺憾的是，細(xì)胞測(cè)試上活性不高，而且出現(xiàn)了類似于BRAF抑制劑的反向激活的老問題；2）另外，藥物聯(lián)用是克服耐藥和提高療效的一個(gè)常用辦法。臨床前研究表明，KRAS變異對(duì)腫瘤免疫療法比較敏感，特別是P53共變異的病人。AMG510與PD-1單抗聯(lián)用的臨床研究即將展開，讓我們拭目以待。KRAS抑制劑與RAS通路上其它藥物的聯(lián)用也值得探索，比如EGFR、BRAF、MEK、PI3K,以及SHP2抑制劑，等等；3)尋找與RAS變異合成致死的藥物，最近的例子有XPO1抑制劑和鐵死亡誘導(dǎo)劑等；4)隨著新技術(shù)的發(fā)展，人們也將眼光轉(zhuǎn)向了其它非小分子藥物形式，比如siRNA(23)、細(xì)胞內(nèi)單抗碎片(24)等

15、。用于RAS蛋白降解的PROTAC也有不少專利公開。這些研究都是很好的嘗試，但離真正的臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路。比較有意思的是，細(xì)胞治療的權(quán)威Rosenberg教授最近在NEJM上報(bào)道了一例針對(duì)KRASG12D的TIL療法。經(jīng)過G12D特異和HLA-C*8:02等位基因限制的T細(xì)胞治療，個(gè)50歲的帶有肺轉(zhuǎn)移的女性腸癌患者取得了9個(gè)月的PR。然而，HLA-C*8:02的廣泛性如何還有爭(zhēng)議。參考文獻(xiàn)：Nature1964;204:11041105.9NatlCancerInst.1967;39:311-335Nature1982,297:474Cell2015Nov19;163(5):1237-125

16、1ProcNatlAcadSciUSA.1989Nov;86(21):8323-7JBiolChem1997,14459Nature2013May30;497(7451):638-42NatCommun.2016Apr20;7:11360BioorgMedChem.1997Jan;5(1):125-33NatureReviewDrugDiscovery2016,15,771ProcNatlAcadSciUSA.2012Apr3;109(14):5299-304MolCancerTher17:1051-1060.PNAS2019,116(7),2551-2560Nature2013Nov28;503(7477):548-51ProcNatlAcadSciUSA2000Aug15;97(17):9367-72Science2016February5;351(6273):604-608NatStructMolBiol.2018Jun;25(6):454-462Angew.