實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)從動物組織中提取DNA及其含量、純度測定的原

1、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)從動物組織中提取DNA及其含量、純度測定的原理和方法 掌握離心機(jī)的使用方法兔肝脫氧核糖核酸（DNA）的提取和測定1在0.15M的氯化鈉溶液中脫氧核糖核蛋白的溶解度最低。用0.15M氯化鈉溶液洗滌可洗去其它物質(zhì)。沉淀用SDS處理，SDS使蛋白質(zhì)與DNA解離，再用氯仿異丙醇抽提，將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA則溶解。DNA溶液用乙醇沉淀析出。實驗原理2實驗操作1. 棄上清留沉淀兔肝稱取4 g 加8ml 1X SSC1X SSC洗兩次取8ml勻漿液離 心勻漿、過濾2.棄上清留沉淀加至8ml 1X SSC離 心加至 8ml 0.15MNaCl-0.1MNa2EDTA離 心3.棄上清留沉淀（脫氧

2、核糖核蛋白）3加約2倍體積95% 乙醇沉淀加 0.15MNaCl-0.1MNa2EDTA至4ml攪拌10min逐滴加入0.5ml 15% SDS加1ml5M NaCl去塞！離心加塞反復(fù)倒置抽提10min吸取上清液勿吸到中間層！等體積氯仿-異丙醇混合液DNA析出用玻棒挑出挑取DNA至一離心管(小燒杯)用10ml 0.01N NaOH溶解重復(fù)一次輕攪10min4注意事項盡可能避免DNA的斷裂 1. 勻漿時應(yīng)保持低溫，且勻漿時間應(yīng)短； 2. 實驗中使用的吸取DNA水溶液的滴管口應(yīng)粗短并成鈍口。保持DNA活性，避免酸堿或其他變性因素使DNA變性。攪動不要太大，以免使DNA斷裂。整個實驗過程應(yīng)在低溫條件

3、下進(jìn)行。攪拌時動作要輕，反復(fù)倒置抽提，不可激烈振蕩。5加入15% SDS時要慢，邊攪邊滴加（兩人配合）。SDS的溫度不能太低，易凝固。吸過SDS的吸管要及時清洗。加入CHCl3/IAA液離心后，分為三層，由上到下為：無機(jī)相-蛋白相-有機(jī)相。DNA溶解在無機(jī)相中，吸取無機(jī)相時動作要輕，不要吸到蛋白相。CHCl3/IAA會溶解有機(jī)玻璃，用完后不能豎直放置在試管架上，必須沖洗干凈。6離心機(jī)的使用打開電源開關(guān)；平衡放置離心管；蓋上蓋子。調(diào)節(jié)時間旋鈕至10min；緩慢調(diào)節(jié)速度旋鈕至9檔，每5-10s上升1檔；離心完畢后機(jī)器自動停止，待完全停止后，打開蓋子取出離心管。離心管必須平衡后，才能啟動離心機(jī)；離心

4、機(jī)的蓋子必須蓋緊；離心過程中不要用重物撞擊離心機(jī)；要等離心機(jī)完全停止轉(zhuǎn)動后再打開蓋子。7二苯胺顯色法測定DNA含量DNA的-脫氧核糖在酸性條件下轉(zhuǎn)變成-羥基-r酮基戊醛，與二苯胺共熱后形成藍(lán)色化合物，該化合物在595nm處最大吸收。每ml含20400g范圍內(nèi)光密度與DNA的濃度成正比。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定DNA含量。用生物分光光度計（用紫外光度法）分析DNA含量與純度實驗原理8取8支試管，按實驗指導(dǎo)的表格加入試劑。加畢置沸水浴10分鐘，取出冷卻；以0號管（空白管）調(diào)零點，于595nm波長比色。以光密度為縱坐標(biāo)，DNA含量（g/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.將實驗中所得到的兔肝DNA溶液作為待測樣品，取兩只試管，分別標(biāo)“U”和“B”，按表加入試劑?；靹颍梅兴?0min, 取出冷卻。在595nm處，以B管調(diào)零，測得待測液的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)于該光密度值DNA的含量。實驗操作9核酸在220-320nm處呈特征性吸收，在260nm處有最大吸收，測A260/A280可得知核酸的大致純度。 A260/A280 1.8 表示DNA純 1.8 RNA含量高 1.8 蛋白含量高核酸紫外吸收的測定10 以0.0