單克隆抗體和基因工程抗體制備

1、關(guān)于單克隆抗體和基因工程抗體的制備第一張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月目的要求1. 掌握雜交瘤技術(shù)的基本原理2. 熟悉單克隆抗體的制備技術(shù)3. 熟悉基因工程抗體技術(shù)第二張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 大多數(shù)抗原分子具有多個抗原決定簇（表位，epitope）。一個抗原決定簇刺激一個B細(xì)胞克隆產(chǎn)生一種特異性抗體，一種抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生多種抗體稱為多克隆抗體（polyclonal antibody ,PcAb）如免疫血清。由一個只識別一種抗原表位的B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的同源抗體稱為單克隆抗體(monoclonal antibody,McAb)。概 述第三張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于20

2、22年6月 單克隆抗體理化性狀高度均一，其抗原結(jié)合部位完全相同，生物活性專一，特異性強(qiáng)，純度高，效價高，易于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化及大量制備，是研究抗體的一重大突破。應(yīng)用比較廣，如試劑診斷盒、治療腫瘤、器官移植及自身免疫病等。第四張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 第一節(jié) 雜交瘤技術(shù)的基本原理 基本原理是融合的兩種細(xì)胞保持自身的特性，產(chǎn)生具有原來兩個細(xì)胞基因信息的單個核細(xì)胞稱為雜交細(xì)胞。包括B細(xì)胞、T細(xì)胞，前者產(chǎn)生Ig，后者產(chǎn)生CK。第五張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、B 淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù) 細(xì)胞是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。B細(xì)胞能產(chǎn)生抗體，但不能在體外長期生長，而骨

3、髓瘤細(xì)胞不產(chǎn)生抗體但在體外能長期生長，二者融合，各保持其本性，既產(chǎn)生抗體又長期生長。 其原理分為幾個步驟第六張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 目的是制備抗原特異的 McAb，所以融合的細(xì)胞必須經(jīng)抗原免疫的B細(xì)胞，通常取脾，另一是在體外長期生長又不產(chǎn)生抗體，所以選腫瘤細(xì)胞即多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，具備以下特點(diǎn)： （一）細(xì)胞的選擇與融合第七張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 1. 穩(wěn)定、易培養(yǎng) 2. 自身不分泌Ig或CK 3. 融合率高 4. 是HGPRT缺陷株 第八張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 目前常用的BALB/c小鼠B細(xì)胞瘤株有P3-X63-Ag8.653C（P3.

4、653）、Sp2/0等。為HAT敏感株，易培養(yǎng), 融合率高，最常選用聚乙二醇(PEG)使細(xì)胞膜輕度損傷，細(xì)胞容易融合。第九張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 （二）選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用 細(xì)胞融合是一個隨機(jī)的物理過程。融合后可能出現(xiàn)以下情況: 1）脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞 2）瘤細(xì)胞與瘤細(xì)胞 3）脾細(xì)胞與脾細(xì)胞 4）未融合的脾細(xì)胞 5）未融合的瘤細(xì)胞 6）多聚體形式。 3）、4）、6）在體外易死去，不需篩選。第十張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞的 DNA 合成一般有兩條途徑 一是糖和氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，進(jìn)一步合成 DNA，葉

5、酸是重要輔酶。 一是輔助途徑，是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶存在下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（hypoxanthine guanine phospheribosyl transferase,HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinase,TK）的催化作用合成 DNA。 第十二張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，當(dāng)氨基蝶呤存在時，能阻斷第一條途徑。細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分，次黃嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤(aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)，三者取前綴縮寫為 HAT 培養(yǎng)基，其融合細(xì)胞所用

6、的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選擇出來的 HGPRT 陰性細(xì)胞株。第十三張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 所以，前面提到的 2）瘤細(xì)胞與瘤細(xì)胞及 5) 未融合的瘤細(xì)胞不能生長，只有 1）脾細(xì)胞與瘤細(xì)胞才能生長，因?yàn)槠⒓?xì)胞為 HGPRT 陽性，通過補(bǔ)償途徑代替氨基蝶呤阻斷的主要途徑。第十四張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 （三）有限稀釋與抗原特異性選擇 在免疫動物時，一種抗原往往有多個表位 ，一個B細(xì)胞克隆接受一個表位，故在免疫動物時是眾多 B 細(xì)胞克隆的抗體的分泌，而針對目的抗原的B細(xì)胞只占很少部分，在細(xì)胞融合后，有相當(dāng)一部分是無關(guān)的細(xì)胞融合體，即融合細(xì)胞分泌的不是目的抗體，要進(jìn)行

7、篩選，分二步稀釋。第十五張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 計(jì)數(shù)，每個孔只放一個細(xì)胞，實(shí)際是0至數(shù)個，整個過程為克隆化，將陽性細(xì)胞株重復(fù)一次，盡量使抗體更純，將陽性細(xì)胞進(jìn)行增殖，部分凍存，部分進(jìn)行體外培養(yǎng)或動物接種。第十六張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 另外還有其他雜交瘤技術(shù)，如人-人 B 淋巴細(xì)胞雜交瘤和鼠-人 B 淋巴細(xì)胞雜交瘤，人骨髓瘤細(xì)胞系體外建株比較困難，生長不穩(wěn)定，有的分泌 IgE，有的分泌 Ig 的、鏈。B細(xì)胞取外周血淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、病灶浸潤性淋巴細(xì)胞。從理論上講很好，但實(shí)際比較困難，在于缺乏好的親體骨髓瘤細(xì)胞株，較難獲得抗原特異性B淋巴細(xì)胞；人

8、雜交瘤細(xì)胞不能在小鼠或其他動物體內(nèi)生長。 第十七張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 小鼠骨髓瘤與人的B細(xì)胞雜交瘤，該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是易獲得小鼠骨髓瘤細(xì)胞，融合率較高，但最大的缺點(diǎn)是不同種雜交后不穩(wěn)定，雜交瘤傳代后，很快喪失分泌抗體的染色體。第十八張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月二、T 細(xì)胞雜交瘤 自 B 細(xì)胞雜交瘤技術(shù)后，T 淋巴細(xì)胞雜交瘤成為熱門，為獲得淋巴因子，更深入地研究T細(xì)胞的各種功能，雖然有一些小鼠T細(xì)胞雜交瘤成功的報道，但結(jié)果不滿意，該細(xì)胞很不穩(wěn)定，分泌淋巴因子無特異性，一種T細(xì)胞雜交瘤可同時分泌幾種淋巴因子，到目前仍無突破性進(jìn)展。第十九張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于20

9、22年6月 T 淋巴細(xì)胞雜交瘤分為小鼠及人，由于 T 細(xì)胞功能的多樣化，制備出的 T 細(xì)胞雜交瘤也各有其特性，如分泌淋巴因子，特異性殺傷功能，分泌抑制因子，自身反應(yīng)性等。其基本過程是將激活的T細(xì)胞與酶缺陷型T淋巴細(xì)胞瘤細(xì)胞融合，可表達(dá)特異性 TCR 或其他功能的雜交瘤T細(xì)胞，與 B 細(xì)胞相以，但細(xì)胞激活和陽性克隆篩選較為雜交，不穩(wěn)定，簡介主要步驟 。第二十張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 淋巴瘤細(xì)胞系的選擇1）體外無限制快速生長2）融合率高3）不分泌淋巴因子和殺傷功能4）缺乏某一特異性表面抗原或受體5）HGPRT 酶缺陷型第二十一張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.特

10、異性T細(xì)胞的制備與純化主要有可溶性抗原誘導(dǎo)激活的 T 細(xì)胞、同種反應(yīng)性T 細(xì)胞、人的特異性 T 細(xì)胞。 第二十二張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.T 細(xì)胞雜交瘤的篩選 通常在含有HAT選擇培養(yǎng)基上，用特異性抗體篩選產(chǎn)生淋巴因子的雜交瘤細(xì)胞，用抗 CD3-TCR 抗體篩選陽性細(xì)胞。第二十三張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 三、陽性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng) 雜交瘤細(xì)胞形成的初期很不穩(wěn)定，鼠的二倍體細(xì)胞有40對染色體，雜交后80對，易丟失，丟失后仍生長，要檢測上清液中是否有目的抗體及淋巴因子。第二十四張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 將陽性細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，反復(fù)23

11、次，確保為一單細(xì)胞陽性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時凍存，以防止細(xì)胞染色體丟失，發(fā)生變異或污染，凍存于液氮（-196）,凍存時加小牛血清至20%, 加幾滴10%二甲亞砜。 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)可用液體、半固體、接種動物腹腔。第二十五張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 單克隆抗體的制備技術(shù) McAb 單一、特異、純化，利用雜交瘤技術(shù)制備McAb的基本原理是三個原則： 1）一種單克隆產(chǎn)生一種抗體 2）雜交瘤細(xì)胞保持雙親細(xì)胞特性 3）篩選培養(yǎng)基第二十六張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 一、單克隆抗體的產(chǎn)生 1. 動物體內(nèi)生長 雜交瘤細(xì)胞注射同系小鼠腹腔，先注射石蠟或不完全佐劑，使腹腔滲出液增多，

12、12周后無菌方法抽取腹水，離心取上清。 第二十七張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. 體外培養(yǎng) 較常做，用普通培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)時間、細(xì)胞生長情況收取上清液。另有高密度培養(yǎng)，在單位體積內(nèi)增加細(xì)胞的培養(yǎng)數(shù)量。第二十八張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、單克隆抗體的純化 腹水或細(xì)胞上清液，均含有脂蛋白、脂質(zhì)及細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，用濾紙去掉脂質(zhì)和大顆粒，離心去除細(xì)胞碎片和蛋白聚合物。第二十九張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 目前純化方法有十幾種，一般采用鹽析、凝膠過濾、離子交換層析和辛酸提取等，現(xiàn)在最有效的方法是親和純化法，常用 SPA 或抗小鼠免疫球蛋白抗體與載體交

13、聯(lián)。稱為 Sepharose 柱，抗體結(jié)合上去，然后洗脫。第三十張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 三、單克隆抗體的性質(zhì)鑒定 鑒定的方法很多，用已知抗原測定抗體，幾乎所有的抗原抗體反應(yīng)試驗(yàn)都可以作，如陽性，再定量，確定工作濃度。 第三十一張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 基因工程抗體技術(shù) 雜交瘤單克隆抗體在診斷、治療、預(yù)防和蛋白質(zhì)提純應(yīng)用中非常廣泛，但對人是異源性，人抗小鼠抗體，應(yīng)用基因工程技術(shù)減少小鼠源成分，保留原有的抗體特異性。第三十二張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月一、人源化抗體 人源化抗體主要指鼠源性單克隆抗體的基因克隆及 DNA 重組技術(shù)改造，重新表

14、達(dá)的抗體。其大部分氨基酸序列為人源序列所取代，既基本保留親代鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了鼠異源性。第三十三張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 （一）人-鼠嵌合抗體 通過基因工程技術(shù)將人 IgG C 區(qū)與鼠IgG V 區(qū)連接，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)表達(dá)制備的抗體稱為嵌合抗體，因 IgG 的抗原性在 C 區(qū)，來自人，故抗原性降低，且半衰期明顯延長，在介導(dǎo) CDC 及 ADCC 亦明顯增強(qiáng)。 第三十四張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 1.鼠單克隆抗體可變區(qū)基因克隆 用探針從該雜交瘤細(xì)胞的基因組文庫中調(diào)取。用 PCR 方法從該細(xì)胞的 RNA 中擴(kuò)增 VH 及 VL 基因。 第三十五張，

15、PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. 表達(dá)載體的構(gòu)建 人-鼠嵌合抗體的表達(dá)載體基因依可變區(qū)基因克隆的表達(dá)方式不同而分為兩類，從基因文庫所克隆的可變區(qū)基因帶有上游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件及內(nèi)含子剪接信號，因此載體只需要包括細(xì)胞內(nèi)增殖所必須的抗生素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制的起始序列以及在真核細(xì)胞進(jìn)行選擇的顯性標(biāo)記基因。 第三十六張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 將載體 DNA 導(dǎo)入真核細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)染。導(dǎo)入的 DNA 整合至細(xì)胞基因組 DNA 中得到轉(zhuǎn)染子，要得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子需利用真核細(xì)胞的顯性選擇標(biāo)記基因，這些標(biāo)記基因使細(xì)胞獲得對某些細(xì)胞毒物質(zhì)的抗體，在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的細(xì)胞毒物質(zhì)可殺死轉(zhuǎn)染不成功

16、的細(xì)胞，達(dá)到選擇的目的。第三十七張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.表達(dá) 用哺乳動物細(xì)胞或大腸桿菌表達(dá)量較少，而應(yīng)用二氫葉酸還原酶（dhfr）擴(kuò)增系統(tǒng)使抗體表達(dá)增強(qiáng)。dhfr 是正常核酸代謝必須的酶，缺乏該酶的中華倉鼠卵細(xì)胞（ CHO）需在有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷條件下利用 DNA 合成，因此, dhfr 作 CHO 的顯性選擇標(biāo)記基因，在無次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷的情況下，只有導(dǎo)入 dhfr 基因，細(xì)胞才能存活。該糸統(tǒng)可用來擴(kuò)增導(dǎo)入的目的基因。第三十八張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 (二) 改形抗體（reshaped antibody,RAB） 應(yīng)用基因工程技術(shù)在嵌合抗

17、體基礎(chǔ)上用人抗體可變區(qū)序列取代鼠源單抗CDR以外的骨架序列，重新構(gòu)成既有鼠源單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體，該抗體對人無免疫原性。第三十九張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 （三）抗體的表面修飾 人和鼠 IgV區(qū)來自不同的種屬，輕鏈不同型別，互補(bǔ)性決定區(qū)(complementarity determining region,CDR) 的長度可不一致，但暴露于表面的AA殘基的位置數(shù)量都很保守，通過改變表面殘基使其人源化，降低鼠可變區(qū)的異源性，將Fv的表面人源化，消除其免疫原性而不影響 Fv 的整體空間構(gòu)象。第四十張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 （四）雙特異性抗體 雙

18、特異性抗體（bispecific antibody,BsAb）又稱雙功能抗體。兩個抗原結(jié)合部位具有不同的特異性，可以同時與兩種不同特異性抗原發(fā)生結(jié)合。第四十一張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 1.化學(xué)交聯(lián)BsAb 分別分離純化兩種抗原的單抗，先使Ig解離后，獲得單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體或其片段交聯(lián)起來。該方法易致抗體失活，其產(chǎn)物也難以保證均質(zhì)性。第四十二張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2.細(xì)胞工程BsAb 將二種雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行融合產(chǎn)生雜交瘤，核酸隨機(jī)組合多種多樣。第四十三張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3.基因工程BsAb 用抗體分子片段如S

19、cFv或Fab等，經(jīng)基因操作修飾后，或體外組裝成為BsAb，或直接導(dǎo)入受體細(xì)胞表達(dá)分泌BsAb。 在免疫檢測、腫瘤放射免疫顯象、藥物剎傷、介導(dǎo)細(xì)胞剎傷效應(yīng)起重要作用。第四十四張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 二、小分子抗體 具有結(jié)合抗原功能的分子片段稱為小分子抗體。其優(yōu)點(diǎn)：1）可在原核細(xì)胞表達(dá)，生產(chǎn)成本低; 2）易于穿透血管或組織到靶細(xì)胞部位，有利于疾病的治療；3）不含F(xiàn)c 段，副作用小；4）半衰期短，有利于毒素中和及清除。 第四十五張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 小分子抗體包括：抗原結(jié)合片段（fragment of antigen binding,Fab），可變區(qū)片段（

20、fragment of variable region,Fv）,單鏈抗體（single chain Fv,ScFv），單區(qū)抗體。另有VH和VL。 第四十六張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 1. Fab 由一條完整的 L 鏈和約為1/2的 H 鏈組成，是完整抗體的 1/3，只有一個Ag 結(jié)合位點(diǎn)，它是將 McAb 重鏈V區(qū)和 CH1 區(qū)cDNA 與完整輕鏈 cDNA 連接，在細(xì)胞啟動子的控制下分泌表達(dá)。 第四十七張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2. Fv和單鏈抗體（ScFv） Fv 由 VH 和 VL 構(gòu)成，非共價鍵結(jié)合，為完整抗體的1/6，單一抗原結(jié)合位點(diǎn)，VH和VL連接

21、有三種方法：1）用戊二醛處理，使之交聯(lián)；2）引入半胱氨酸殘基，使VH和VL之間形成二硫鍵；3）把VH和VL用一段適當(dāng)?shù)墓押塑账岱肿舆B接起來，表達(dá)成一個單鏈，稱為ScFv。第四十八張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3. 單區(qū)抗體及最小識別單位 根據(jù)抗體分子的結(jié)構(gòu)，一般將 Fv 稱為抗體的最小單位，但有些更小亞單位仍結(jié)合抗原，如單獨(dú)重鏈 VH 仍可保留相當(dāng)程度抗原結(jié)合能力，其作用比 VL 大，稱為單區(qū)抗體（single domain antibody），其親和力低于完整的 Fv，因單區(qū)抗體的疏水區(qū)的暴露，增加了非特異性吸附，水溶性減低，其應(yīng)用受到限制，但分子量小，單位體積濃度高，副作用小

22、，是很有前景的抗體部分。 第四十九張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得到有多樣性生物功能的融合蛋白，有幾種構(gòu)建方式： 1）將 Fab 或 ScFv與其他生物活性蛋白融合，建成生物導(dǎo)彈。 三、抗體融合蛋白第五十張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 2）在融合時可根據(jù)某些恒定區(qū)，可使某些生物活性與抗體的生物學(xué)效應(yīng)功能聯(lián)結(jié)在一起。 3）將 ScFv 與某些細(xì)胞膜蛋白融合，形成嵌合受體，使細(xì)胞結(jié)合抗原 。第五十一張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 （一）含F(xiàn)v片段的抗體融合蛋白 將 Fv 與某些毒素、酶及細(xì)胞因子等的基因連接，能編碼 Fv 與毒素

23、、酶及細(xì)胞因子復(fù)合物，即生物導(dǎo)彈，主要在于抗腫瘤。 第五十二張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 （二）嵌合受體 將ScFv 與某些細(xì)胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白可表達(dá)于細(xì)胞表面。其抗體部分與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合。如將抗體的可變區(qū)基因與TCR的鏈和鏈恒定區(qū)融合，將融合基因?qū)隩細(xì)胞，既表達(dá)特異性抗體，又表達(dá)TCR，該TCR不受MHC分子限制。第五十三張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 （三）含 Fc 的抗體融合蛋白 如將CD4分子細(xì)胞膜外部分與Fc 融合后用真核細(xì)胞表達(dá)，由二硫鍵連接成雙體，分泌到細(xì)胞外，產(chǎn)生二種功能：1）延長在血循環(huán)中的半衰期；2）通過功能蛋白與配體分子的作用

24、，將Fc的生物學(xué)效應(yīng)引導(dǎo)至特定目的，如CD4與Fc融合蛋白，CD4是T輔助細(xì)胞表面糖蛋白，是HIV 的受體，該融合蛋白能競爭結(jié)合 HIV，可阻斷 HIV 對TH 的感染，可介導(dǎo) ADCC及CDC，可通過胎盤。 第五十四張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 小分子抗體都是單價，不能偶聯(lián)。將特異性不同的兩個小分子抗體連接在一起可獲得雙特異性抗體。（bispecific antibody,BsAb），雙價ScFv與抗原結(jié)合比單價敏感性高，親和力大，結(jié)構(gòu)和功能上都更接近親本抗體。BsAb分子片段可從Fab、Fv 或 ScFv 組建，可在體內(nèi)或體外連接。 四、雙特異性抗體第五十五張，PPT共六十八

25、頁，創(chuàng)作于2022年6月 在小分子抗體的羧基端設(shè)計(jì)半胱氨酸殘基，如帶鉸鏈區(qū)的 Fab 段或帶半胱氨酸殘基尾巴的 ScFv，可在體外通過化學(xué)交聯(lián)成為雙價抗體分子，亮氨酸鉸鏈也可用來構(gòu)建，兩個不同抗體連接成為功能抗體。如抗體 CD3 和抗 IL-2R的Fab 在體外直接介導(dǎo)T細(xì)胞對表達(dá) IL-2的細(xì)胞有殺傷作用。 （一）雙價抗體分子的構(gòu)建1. 體外構(gòu)建第五十六張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 對小分子抗體基因的改造修飾，使細(xì)胞直接表達(dá)雙抗體分子，比體外組建更有效，現(xiàn)有以下幾種方法: 2. 雙抗體分子的細(xì)胞內(nèi)組建第五十七張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 （1）設(shè)計(jì)促進(jìn)雙聚體形成的

26、結(jié)構(gòu)域，半胱氨酸是促進(jìn)雙聚體形成的結(jié)構(gòu)域，使小分子抗體在大腸桿菌的分泌型表達(dá)過程中形成雙體，亮氨酸拉鏈和甲基（CH3）亦有螺旋轉(zhuǎn)角螺旋結(jié)構(gòu)，使之成為雙體。 （2）在基因構(gòu)建上直接將兩個抗體分子片段融合。 （3）雙體分子 兩個 ScFv 的 VH 和 VL 相互配對，可產(chǎn)生雙價的雙抗體分子。第五十八張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 能同時結(jié)合兩種不同抗原，因而可介導(dǎo)標(biāo)記物與靶抗原的結(jié)合，或某些高級分子定位于靶細(xì)胞。在臨床上有以下應(yīng)用： （ 二）雙特異性抗體的應(yīng)用第五十九張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 1. 在免疫檢測中的應(yīng)用 一個臂結(jié)合靶抗原，另一個臂結(jié)合酶，不需用酶標(biāo)記抗體，避免在標(biāo)記過程中降低酶及抗體的活性。 2. 在腫瘤放射免疫顯像中的應(yīng)用 一個臂結(jié)合腫瘤細(xì)胞，另一個臂結(jié)合半抗原螯合劑，半抗原螯合劑能選擇與放射性核素結(jié)合。放射免疫顯像，清晰度和靈敏度高。第六十張，PPT共六十八頁，創(chuàng)作于2022年6月 3. 雙特異性抗體介導(dǎo)的藥物殺傷效應(yīng) 治療腫瘤生物導(dǎo)彈如藥物、毒素或核素。 4. 介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷效應(yīng) 一臂結(jié)合腫瘤抗原，一臂結(jié)合免疫活性細(xì)胞起